一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法和海藻多酚

1.本发明属于海洋生物材料的技术领域，尤其涉及一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法和海藻多酚。


背景技术：

2.海藻是一种重要的海洋生物资源，由于生活在低温、高盐以及寡照的恶劣海洋环境中，因此普遍含有特殊功能的生物活性物质，如酚类、吲哚类、萜烯类等化合物，是海洋天然产物的重要来源。
3.海藻多酚是一大类结构不同、含有多羟基的化合物，由多种简单酚结构单元组成，具有良好的抗氧化、抗癌、化学防御以及除臭等生物活性；目前，海藻多酚的提取方法主要有极性溶剂提取法、超临界法、生物酶提取法以及低共熔溶剂提取法等方法。
4.其中，生物酶提取法由于其条件温和、快速以及转移性强，能够有效地将多酚化合物从海藻细胞中释放且保持多酚的活性，受到人们广泛的关注。但是，由于生物酶解提取法所得的发酵液中化学组成复杂，采用常规的方法无法有效分离多酚物质与发酵液中的其他物质，使得最终制备得到的海藻多酚中含有较大量的杂质、纯度低，具有较大的局限性。


技术实现要素：

5.为了实现多酚物质与海藻发酵液中其他物质的有效分离，获得一种高纯度的海藻多酚，本发明提供了一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法和海藻多酚。
6.第一方面，本发明提供的一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法采用以下的技术方案：
7.一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，该方法包括：
8.s1、取海藻发酵液与沉淀剂混合，离心取上清、冷冻干燥，得到冻干粉；
9.s2、取所述冻干粉与固体吸附剂进行机械研磨，得到混合物；
10.s3、取所述混合物进行水洗、酸洗脱，得到洗脱液；
11.s4、采用有机溶剂对所述洗脱液进行萃取，取上层溶液进行减压蒸馏、冷冻干燥，得到所述海藻多酚；
12.所述固体吸附剂为含有zn
2+
和/或fe
3+
的金属氧化物，且所述固体吸附剂不溶于水。
13.在一些具体的实施方式中，步骤s1中，所述海藻发酵液的制备为：按照(10～15):1的质量比取海藻粉末与复合酶于35～45℃下发酵24～36h。
14.在一些具体的实施方式中，步骤s1中，所述海藻粉末选自羊栖菜、海带、马尾藻、泡叶藻、面条藻、褐藻鼠尾藻、昆布、铁钉藻、鹅肠菜和绳藻中的一种或多种。
15.在一些具体的实施方式中，步骤s1中，所述复合酶选自蛋白酶、纤维酶、脂肪酶和淀粉酶中的至少两种。
16.在一些具体的实施方式中，步骤s1中，所述沉淀剂选自甲醇、乙醇和丙酮中的一种
或多种。
17.在一些具体的实施方式中，步骤s1中，所述海藻发酵液和沉淀剂的投入体积比为1:(1～3)，具体为1:1、1:1.3、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3或它们之间的任意值。
18.在一些具体的实施方式中，步骤s2中，所述固体吸附剂选自fe2o3和/或zno。
19.在一些优选的实施方式中，步骤s2中，所述固体吸附剂为zno，zno对与冻干粉中多酚物质具有理想的特异性结合能力，使得最终制备得到的海藻多酚的纯度高。
20.在一些具体的实施方式中，步骤s2中，所述冻干粉和固体吸附剂的添加质量比为1:(0.8～1.2)；具体为1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2或它们之间的任意值。
21.在一些具体的实施方式中，步骤s2中，所述机械研磨的转速为2000～2500r/min，具体为2000r/min、2100r/min、2200r/min、2300r/min、2400r/min、2500r/min或它们之间的任意值；机械研磨的时间为30～60min，具体为30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min或它们之间的任意值。
22.在一些优选的实施方式中，采用间断的方式进行机械研磨——机械研磨3～5min后停止30～60s，减少多酚类化合物在机械研磨过程中应温度升高发生氧化，使得最终制备的海藻多酚生具有良好的生物活性。
23.在一些具体的实施方式中，步骤s3中，所述水洗为：按照1g:(200～500)ml的比例取混合物与去离子水混合搅拌，离心取沉淀。
24.在一些具体的实施方式中，步骤s3中，所述酸洗脱为：按照1g:(45～65)ml的比例取经过所述水洗的混合物与ph为2～2.3的质子酸溶液混合，使得混合物完全溶解。更加具体的，混合物与质子酸溶液的混合比例可以是1g:45ml、1g:47ml、1g:50ml、1g:52ml、1g:55ml、1g:56ml、1g:59ml、1g:60ml、1g:62ml、1g:65ml或它们之间的任意值，质子酸溶液的ph可以是2、2.05、2.1、2.2、2.3或它们之间的任意值。
25.在一些具体的实施方式中，所述酸洗脱中，质子酸选自盐酸和/或硫酸。
26.在一些具体的实施方式中，步骤s4中，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
27.在一些具体的实施方式中，所述有机溶剂和洗脱液的投入体积比为1:(1～1.5)。，具体为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5或它们之间的任意值。
28.第二方面，本发明还提供通过以上纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法制备得到的海藻多酚。
29.有益效果：
30.本发明提供的制备海藻多酚的方法中，利用含有zn
2+
和/或fe
3+
的金属氧化物能够与冻干粉中多酚化合物特异性结合这一特点，首先将海藻发酵液通过冷冻干燥的方式制备成固体粉末状的冻干粉，接着采用含有zn
2+
和/或fe
3+
的金属氧化物与冻干粉进行机械研磨，在机械力的作用下使得金属氧化物与冻干粉中的多酚化合物发生络合，通过水洗洗去混合物表面的水溶性杂质后，结合有多酚化合物的金属氧化物溶解于质子酸溶液中，最后通过萃取的方法将多酚化合物从水相中转移到有机相中，实现多酚类化合物与海藻发酵液中其他物质的有效分离，使得最终得到的海藻多酚纯度高，且具有良好的抗氧化、抗菌等生物活性。
具体实施方式
31.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
32.制备例.
33.本制备例用以说明海藻发酵液的制备，具体包括以下步骤：
34.s1、取新鲜的昆布洗净后，自然风干后，粉碎得到昆布粉末；
35.s2、取100g的昆布粉末与1g的复合酶混合，溶解于5l的去离子水中，于40℃下发酵24h，得到海藻发酵液。
36.本制备例中所采用的复合酶包括纤维素酶和蛋白酶，且复合酶中纤维素酶和蛋白酶的质量比为10:1。
37.实施例1.
38.本实施例用以说明一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，该方法中以制备例所得的海藻发酵液作为原料，具体步骤为：
39.s1、取海藻发酵液于80℃下进行灭酶10min，按照体积比为1:1取经灭酶的海藻发酵液与70％的乙醇混合，于2500r/min下离心10min取上清，上清液在-40℃下进行冷冻干燥，得到冻干粉；
40.s2、按照质量比为1:1取冻干粉与氧化锌粉末混合，于转速为2250r/min的条件下间断进行球磨30min(球磨5min，停止30s)，得到混合物；
41.s3、(1)按照1g:200ml的比例取混合物与去离子水混合搅拌10min，离心取沉淀，重复该操作3次后完成对混合物的水洗；(2)按照1g:50ml的比例取经过水洗的混合物与浓度为0.01mol/l的稀盐酸溶液混合，得到洗脱液；
42.s4、按照体积比为1:1.5取洗脱液与乙酸乙酯混合，进行萃取取上层溶液，重复该操作3次后，合并上层溶液得到萃取液，对萃取液进行减压蒸馏和冷冻干燥，得到海藻多酚粉末。
43.实施例2.
44.本实施例采用实施例1提供的方法制备海藻多酚，不同之处在于：步骤s2中，按照质量比为1:1取冻干粉与氧化铁粉末混合，其他条件相同。
45.实施例3.
46.本实施例采用实施例1提供的方法制备海藻多酚，不同之处在于：步骤s2中，按照质量比为1:0.8取冻干粉与氧化锌粉末混合，于转速为2000r/min的条件下进行球磨60min，其他条件相同。
47.实施例4.
48.本实施例采用实施例1提供的方法制备海藻多酚，不同之处在于：步骤s2中，按照质量比为1:1.2取冻干粉与氧化锌粉末混合，于转速为2500r/min的条件下进行球磨30min，其他条件相同。
49.对比例1.
50.该对比例提供了一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，具体地，取海藻发酵
液于80℃下进行灭酶10min，按照体积比为1:1取经灭酶的海藻发酵液与70％的乙醇混合，于2500r/min下离心10min取上清，上清液在-40℃下进行冷冻干燥，得到海藻多酚。
51.对比例2.
52.该对比例采用实施例1提供的方法制备海藻多酚，不同之处在于：步骤s2中，按照质量比为1:1取冻干粉与氧化镁粉末混合，其他条件相同。
53.对比例3.
54.该对比例采用实施例1提供的方法制备海藻多酚，不同之处在于：步骤s2中，按照质量比为1:1取冻干粉与碳酸钙粉末混合，其他条件相同。
55.测试例.
56.本测试例用以说明实施例1～4提供的方法的多酚提取率及所得到的海藻多酚的纯度，并以对比例1～3作为对照，具体测试方法为：
57.分别吸取1.0ml的浓度分别为0mg/l、1mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l的没食子酸标准溶液于试管中，并加入5.0ml的10％(v/v)福林酚，摇匀，反应5min；接着加入4.0ml的7.5wt％的碳酸钠溶液，摇匀，于室温下暗反应45min；测定反应溶液于730nm的吸光度，得到吸光度与多酚化合物的关系式为：a＝0.0065c-0.0005(其中，a为吸光度，c为多酚化合物浓度)；
58.取10mg实施例1～4以及对比例1～3所提供海藻多酚溶于去离子水中，配制得到待测液；分别取1.0ml待测液于试管中，并加入5.0ml的10％(v/v)福林酚，摇匀，反应5min；接着加入4.0ml的7.5wt％的碳酸钠溶液，摇匀，于室温下暗反应45min；测定反应溶液于730nm的吸光度，并计算得到多酚化合物浓度；并按照下式(1)和(2)计算多酚提取率和纯度，结果如表1所示。
[0059][0060][0061]
表1.多酚提取率和海藻多酚纯度
[0062][0063]
[0064]
由测试结果可知，相较于对比例1～3，本发明实施例1～4提供的方法所制备得到的海藻多酚纯度高达70.23％，说明采用本发明提供的方法对海藻发酵液进行处理具有良好的纯化效果，所得海藻多酚中多酚类化合物的含量高。值得注意的是，对比例2和3分别采用氧化镁和碳酸钙与冻干粉进行机械研磨，其他条件与实施例1的相同，但所得到的海藻多酚纯度低，这是由于海藻发酵液中所含有的物质成分复杂，仅使用含有zn
2+
、fe
3+
的金属氧化物才能够很好地与冻干粉中的多酚化合物特异性结合，使得最终得到的海藻多酚纯度高，而其他金属离子氧化物不仅能和海藻多酚化合物结合，还可以与其他的物质结合，因此无法实现多酚化合物和其他物质的有效分离。
[0065]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，该方法包括：s1、取海藻发酵液与沉淀剂混合，离心取上清、冷冻干燥，得到冻干粉；s2、取所述冻干粉与固体吸附剂进行机械研磨，得到混合物；s3、取所述混合物进行水洗、酸洗脱，得到洗脱液；s4、采用有机溶剂对所述洗脱液进行萃取，取上层溶液进行减压蒸馏、冷冻干燥，得到所述海藻多酚；所述固体吸附剂为含有zn
2+
和/或fe
3+
的金属氧化物，且所述固体吸附剂不溶于水。2.根据权利要求1所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，步骤s1中，所述海藻发酵液的制备为：按照(10～15):1的质量比取海藻粉末与复合酶于35～45℃下发酵24～36h。3.根据权利要求2所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，步骤s1中，所述海藻粉末选自羊栖菜、海带、马尾藻、泡叶藻、面条藻、褐藻鼠尾藻、昆布、铁钉藻、鹅肠菜和绳藻中的一种或多种；任选地，所述复合酶选自蛋白酶、纤维酶、脂肪酶和淀粉酶中的至少两种。4.根据权利要求1所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，步骤s1中，所述沉淀剂选自甲醇、乙醇和丙酮中的一种或多种；任选地，所述海藻发酵液和沉淀剂的投入体积比为1:(1～3)。5.根据权利要求1所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，步骤s2中，所述固体吸附剂选自fe2o3和/或zno；优选地，所述固体吸附剂为zno。6.根据权利要求1所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，步骤s2中，所述冻干粉和固体吸附剂的添加质量比为1:(0.8～1.2)。7.根据权利要求1所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，步骤s2中，所述机械研磨的转速为2000～2500r/min，时间为30～60min。8.根据权利要求1所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，步骤s3中，所述水洗为：按照1g:(200～500)ml的比例取混合物与去离子水混合搅拌，离心取沉淀；任选地，所述酸洗脱为：按照1g:(45～65)ml的比例取经过所述水洗的混合物与ph为2～2.3的质子酸溶液混合，使得混合物完全溶解；任选地，所述酸洗脱中，质子酸选自盐酸和/或硫酸。9.根据权利要求1所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法，其特征在于，步骤s4中，所述有机溶剂为乙酸乙酯；任选地，所述有机溶剂和洗脱液的投入体积比为1:(1～1.5)。10.权利要求1～9任一所述的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法制备得到的海藻多酚。

技术总结
本发明属于海洋生物材料的技术领域，公开了一种纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法和海藻多酚。本发明中提供的纯化海藻发酵液制备海藻多酚的方法包括：取海藻发酵液与沉淀剂混合，离心取上清、冷冻干燥，得到冻干粉；取冻干粉与固体吸附剂进行机械研磨，得到混合物；取混合物进行水洗、酸洗脱，得到洗脱液；采用有机溶剂对洗脱液进行萃取，取上层溶液进行减压蒸馏、冷冻干燥，得到海藻多酚；固体吸附剂为含有Zn


技术研发人员：罗贤泽 陈艳红 李志朋 王嘉钦 杨璐 陈焓 陈积高 萧诗佳
受保护的技术使用者：集美大学
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/22