PIK3IP1蛋白在制备诊断或治疗自身免疫性疾病的试剂或药物中的应用

pik3ip1蛋白在制备诊断或治疗自身免疫性疾病的试剂或药物中的应用
1.本技术要求2022年3月15日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为202210255844.5，发明名称为“pik3ip1蛋白在制备诊断或治疗自身免疫性疾病的试剂或药物中的应用”的在先申请的优先权。该在先申请的全文通过引用的方式结合于本技术中。
技术领域
2.本发明属于生物医药领域，具体涉及pik3ip1蛋白在调节t细胞代谢、制备诊断或治疗自身免疫性疾病的试剂或药物中的应用。


背景技术：

3.机体的免疫反应受到多种类型免疫细胞、细胞因子等的调控，以抵御危险信号和外来抗原的攻击；t细胞在免疫应答过程中发挥了重要作用。调节机体免疫反应并维持对自身抗原引起的免疫耐受，有赖于一个由共刺激和共抑制分子组成的复杂网络的参与。
4.t细胞是获得性免疫系统最核心的要素。根据t细胞表面的特征性分子的不同，t细胞可以分为cd4
+
t细胞和cd8
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t细胞。而循环性的cd4
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和cd8
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t细胞在体内巡逻时可以区分这种蛋白是异物还是自身的多肽，外源性的蛋白会释放免疫系统处于危险的信号，导致t细胞激活，同时启动其他免疫细胞，然后杀死靶细胞。在对抗肿瘤免疫过程中，t细胞作为核心的执行者，首先被t细胞受体介导的抗原识别信号激活，同时众多的共刺激信号和共抑制信号精细调节t细胞反应的强度和质量，这些抑制信号即为免疫检查点。
5.t细胞活化受协同信号网络的调控，这种调控贯穿于t细胞反应的全程。b7/cd28为代表的ig超家族和tnf受体超家族的一些成员构成了t细胞共刺激分子的主体。这些协同信号通路的重要性在人类多种疾病中得到了证实，包括移植物抗宿主反应、自身免疫性疾病、感染和肿瘤。从数目众多的临床试验中可以看出，除了大家熟知的ctla-4，越来越多的检查点调控分子及信号通路，如程序性死亡分子(pd)-1和b7-h4通路被发现在多种疾病的治疗中发挥作用。近年来，新的检查点调控分子，如t细胞活化的v-区ig抑制分子(vista)和b7-h6被陆续发现和证实。
6.自身免疫性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病。目前认为，受遗传、环境、感染等多种因素的影响，各类免疫细胞、炎症介质、自身抗体参与介导的自身免疫耐受功能紊乱是自身免疫性疾病最主要的发病机制。常见的自身免疫性疾病包括：系统性红斑狼疮(systemic lupus erythe-matosus，sle)、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)、多发性硬化症(multiple sclerosis，ms)等。自身免疫疾病的潜在机制仍未完全阐明，但似乎其发病或恶化是由于免疫耐受的丧失。t淋巴细胞是调节适应性免疫反应的中枢角色。t细胞耐受性的损害，使t细胞极化为过度活跃和致病性炎症表型，将导致t细胞/自身抗体介导的自身免疫疾病。因此，迫切需要在临床前和临床试验中开发旨在增强t细胞耐受性和抑制致病性炎症t细胞对各种t细胞介导的自身免疫性疾病的治疗方法。
7.t细胞代谢程序的改变与它们的激活和炎症状态有着复杂的联系。尽管越来越多
的证据表明有氧糖酵解在转录和表观遗传学上赋予t细胞强烈的前炎症表型，氧化磷酸化为主的静止t细胞向糖酵解为主的促炎t细胞转变的分子途径仍不清楚。负免疫调节蛋白，如ctla-4、pd-1、lag-3，是传导免疫激活的负信号并阻止不适当免疫反应的蛋白质。已经证明，在感染和肿瘤期间，负免疫调节因子需要抑制糖酵解和驱动t细胞的氧化代谢。到目前为止，只有一种针对负免疫调节因子的药物(abatacept，一种ctla-4-fc融合蛋白)获得了食品和药物管理局(fda)的完全批准，用于治疗几种自身免疫性疾病，但反应率不令人满意。因此，有必要彻底了解负性免疫调节因子的基础代谢调节，并在自身免疫性疾病中发现更有效的替代药。
8.磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，pi3k)是由许多细胞受体激活的脂质激酶家族。pi3k及其产物的适当调节对细胞稳态至关重要。pi3k和下游效应物akt的活化突变或扩增已经牵涉在各种癌症中。pi3k的下游效应子包括许多含ph结构域的蛋白。与抗原应答性白细胞如t细胞和肥大细胞特别相关的是tec家族酪氨酸激酶，其增强plc-γ1活化，以及akt家族丝氨酸/苏氨酸激酶，其调节细胞存活、代谢、生长和蛋白质翻译。
9.磷脂酰肌醇3激酶相互作用蛋白1(pi3k interacting protein1，pik3ip1)是一个新近报道的能与pi3k的p110亚基结合的蛋白，可以下调pi3k活性，抑制丝氨酸苏氨酸激酶(akt，rac-alphaserine/threonine-proteinkinase)的活化。2012年，有研究报道了pik3ip1蛋白可在t细胞上表达。通过在人白血病细胞系jurkat和小鼠th2细胞系d10细胞上过表达pik3ip1蛋白，抑制了t细胞活化相关的转录信号分子nfat、ap-1的活化。相反，用sirna在上述细胞系沉默掉pik3ip1基因，能够增强akt的磷酸化、促进t细胞的活化和il-2的分泌。说明，pik3ip1可能抑制t细胞的活化。但对于pik3ip1与自身免疫性疾病之间的关系还有待进一步研究。


技术实现要素：

10.本发明发明人对pik3ip1在自身免疫性疾病患者的pbmc(外周血单个核细胞)中的表达进行了检测和分析，发现其pbmc中pik3ip1
+
t细胞的比例显著降低，且pik3ip1的表达与疾病严重程度密切相关。
11.本发明对比研究了t细胞特异性pik3ip1敲除小鼠(cd4
cre
pik3ip1
fl/fl
小鼠，cko)和同笼pik3ip1
fl/fl
小鼠(下文以“control”表示，与cko小鼠形成对照组小鼠)的实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型的疾病进程，发现pik3ip1敲除小鼠的eae病程较control小鼠更为严重，进展更快，也更容易导致t细胞向促炎t细胞亚群分化。
12.本发明对比研究了wt小鼠脾脏中pik3ip1
+
t细胞和pik3ip1-t细胞的转录谱。发现pik3ip1-t细胞上调了激活相关基因，而下调了静止相关基因，尤其是参与oxphos的基因显著下调，而参与糖酵解的基因上调。由此表明，pik3ip1的表达与t细胞代谢重编程之间有很强的关系。
13.本发明进一步研究了pik3ip1在t细胞代谢稳态中的作用，发现pik3ip1的消融可以诱导t细胞代谢从oxphos向糖酵解转变，从而达到激活的平衡状态。
14.本发明发明人还具体研究了重编程介导因子，缺氧诱导因子1α(hif1α)在pik3ip1缺失导致的代谢重编程中作用。结果发现，hif1α的升高对于pik3ip1缺失的t细胞的糖酵解
代谢重编程是必不可少的，抑制hif1α是对抗这种改变的有效策略。
15.本发明发明人还研究了pik3ip1、pik3ip1ecd(pik3ip1的细胞外结构域)、包含pik3ip1ecd的融合分子在治疗或预防自身免疫性疾病方面的应用，所述自身免疫性疾病包括但不限于多发性硬化(ms)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、脊椎关节炎、系统性红斑狼疮(sle)、白癜风、类风湿性关节炎(ra)、幼年特发性关节炎(jia)(例如斯蒂尔病(still’s disease)又称儿童活动期全身型幼年特发性关节炎(sjia))、银屑病、干燥综合征(ss)、肠易激综合征(ibs)、皮肌炎和过敏性哮喘。
16.在此基础上，本发明提出如下技术方案：
17.本发明的一个方面提供，pik3ip1在制备用于检测自身免疫性疾病的试剂中的用途。
18.一种用于自身免疫性疾病诊断的生物标志物，其包含基因pik3ip1，或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
19.所述诊断包括判断患者是否患有自身免疫性疾病，自身免疫性疾病的严重程度，自身免疫性疾病患者药物治疗后疾病状态改善，所述疾病状态改善包括t细胞活性程度的改善，t细胞的代谢状态由糖酵解向oxphos转变等。
20.本发明研究发现，pik3ip1与自身免疫性疾病的存在与否，疾病进展和治疗结果关系密切，pik3ip1在自身免疫性疾病的晚期疾病患者中表达更低，在自身免疫性疾病症状缓解后pik3ip1的表达恢复，在接受了相应治疗药物后，患者体内的pik3ip1表达上调。通过roc曲线分析证明，pik3ip1可作为自身免疫性疾病的诊断性生物标志物。
21.在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自多发性硬化、肠易激综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、脊椎关节炎、系统性红斑狼疮、白癜风、类风湿性关节炎、银屑病、干燥综合征、幼年特发性关节炎(jia)(例如儿童活动期全身型幼年特发性关节炎(sjia))、皮肌炎和过敏性哮喘。
22.一种用于自身免疫性疾病诊断的检测试剂，所述检测试剂包含能与基因pik3ip1或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。
23.根据本发明，所述结合剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体等。
24.在本发明的一个实施方式中，所述核酸是能与pik3ip1基因杂交的核酸探针。
25.在本发明的一个实施方式中，所述核酸是能扩增pik3ip1基因的引物序列。
26.可以采用本领域已知的探针和引物序列的设计方法，根据所述目标基因的序列，设计并合成所述的核酸探针和引物序列，例如采用本领域已知的设计软件包括但不限于oligo、primerpremier、dna man等。
27.在本发明的一个实施方式中，所述抗体是能与蛋白pik3ip1或蛋白pik3ip1的片段相结合的抗体。优选所述抗体为单克隆抗体(例如santa cruz的cat#sc-365777抗人pik3ip1抗体)。可以采用本领域已知的抗体制备方法制备获得相应的抗体，包括但不限于抗原免疫法、杂交瘤技术、噬菌体展示技术等。
28.根据本发明，所述结合剂可进一步结合指示分子，所述指示分子例如：荧光物质、放射性物质和/或酶等。
29.一种用于自身免疫性疾病诊断的检测试剂盒，其包含前述所述的检测试剂。
30.所述检测试剂盒进一步包含用于检测的其他辅助性试剂，包括但不限于，pcr用辅
助性试剂(例如，聚合酶、dntp、扩增缓冲液等)，elisa用辅助性试剂(例如底物溶液、第二抗体、缓冲液等)或west-blot用辅助性试剂(例如第二抗体、缓冲液)等。
31.根据本发明，所述试剂盒进一步包括盛装一种或多种所述结合剂的一个容器或多个容器。进一步优选，还包含使用所述试剂盒的指导材料，例如说明书。
32.能够检测基因pik3ip1或其编码的蛋白或蛋白片段的检测试剂在制备自身免疫性疾病的诊断试剂中的用途。
33.在本发明的一个实施方式中，所述检测试剂包含能与pik3ip1基因杂交的核酸探针。
34.在本发明的一个实施方式中，所述检测试剂包含能扩增pik3ip1基因的引物序列。
35.在本发明的一个实施方式中，所述检测试剂包含能与蛋白pik3ip1或蛋白pik3ip1的片段相结合的抗体。优选所述抗体为单克隆抗体。
36.在本发明的一个实施方式中，基因pik3ip1编码的蛋白是pik3ip1，基因pik3ip1编码的蛋白片段是pik3ip1的胞外域(pik3ip1ecd)。
37.一种自身免疫性疾病患者的诊断方法，该方法包括以下步骤：
38.1)获取受试者的外周血单核细胞或病损组织；
39.2)检测所述细胞或组织中pik3ip1基因的表达水平；
40.任选包括，3)判断其表达水平是否降低。
41.所述判断根据对应基因表达水平的阈值进行，低于阈值的判断为表达量低，表达量低的受试者患有自身免疫性疾病，越低则疾病严重程度越高。
42.优选，所述阈值是相应基因在给定人群中的平均表达水平。
43.优选，所述表达水平是pik3ip1基因的mrna表达水平。
44.优选，所述表达水平是pik3ip1基因的蛋白质水平。
45.该诊断方法可以在受试者接受治疗之前和/或治疗之后进行。例如治疗后，检测患者外周血单核细胞中目标基因的mrna水平或蛋白水平，如果患者体内目标基因的mrna表达量增高，则表示治疗起效，患者的t细胞过激状态得到缓解。
46.本发明的第二个方面提供，pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
47.在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自多发性硬化、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎(jia)(例如儿童活动期全身型幼年特发性关节炎(sjia))、干燥综合征(ss)、银屑病、皮肌炎和过敏性哮喘。
48.根据本发明，包含pik3ip1ecd的融合分子包括但不限于pik3ip1ecd-fc。
49.根据本发明，pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合蛋白可以降低自身免疫性疾病的炎性反应。
50.根据本发明，pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合蛋白可以将t细胞的代谢状态由糖酵解向oxphos转变。
51.pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子还可以联合其他的自身免疫性疾病的标准治疗方法，用于治疗自身免疫性疾病。
52.因此，本发明的一个实施方式提供，pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子单独或者和另一种或多种治疗剂联合在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
53.本发明的第三个方面是提供一种药物组合物，其包含pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子，和药学上可接受的载体。
54.根据本发明，该药物组合物用于治疗自身免疫性疾病。所述治疗自身免疫性疾病通过抑制t细胞代谢从oxphos向糖酵解转变来抑制t细胞的过度活化，从而达到治疗效果。
55.根据本发明，所述药物组合物还可以以联合疗法的方式施用，即联合其他治疗剂，例如，其他的免疫调节剂。
56.单剂量形式的药物组合物中活性成分的量，可以根据受试者及具体的给药途径而变化。一般而言，在药物组合物中，pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子的重量百分比为大约0.01％到大约99％，优选大约0.1％到大约70％，最优选大约1％到大约30％。
57.对于pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子，其剂量范围为大约0.0001-100mg/kg，更通常为0.01-5mg/kg体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。例示性的治疗方案可以是每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。
58.本发明药用组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，从而获得对于特定患者和给药途径能有效实现治疗性应答而对患者无毒的活性成分用量。选定的剂量水平将取决于多种药动学因素，包括给药途径，用药时间，药物代谢情况，所治疗患者的年龄、性别、体重、大体健康状态和既往病史等。
59.本发明的一个实施方式还提供，包含pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子的药物试剂盒。
60.该试剂盒还可以进一步包含用于治疗自身免疫性疾病的说明书。
61.在本发明的一个具体实施方案中，所述药物试剂盒中将pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子和其他的免疫调节剂以单位剂量形式共同包装。
62.在本发明的另一个具体实施方案中，所述药物试剂盒中分别将pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子和其他的免疫调节剂以各自的单位剂量形式分别包装。
63.本发明的第四个方面是提供一种调控自身免疫性疾病患者免疫应答的方法，其包括给受试者施用pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子，使得受试者的免疫应答得到调控。优选的是，pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子抑制t细胞的过度活化。优选的是，pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子抑制t细胞的增殖，所述t细胞选自cd4
+
t细胞和cd8
+
t细胞。优选的是，pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子抑制t细胞分泌免疫因子(例如il-2、ifn-γ和tnf-α等)。根据本发明，所述抑制t细胞的过度活化包括但不限于，抑制t细胞代谢从oxphos向糖酵解转变。
64.本发明的第五个方面是提供，一种在个体中治疗自身免疫性疾病或延缓自身免疫性疾病进展的方法，所述方法是给所述个体治疗有效量的pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子。
65.根据本发明，所述方法还包括给予所述个体另一种或多种治疗剂。
66.根据本发明，所述另一种或多种治疗剂包括但不限于其他的免疫调节剂等。
67.根据本发明，所述pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子和另一种或多种治疗剂各自在单独的组合物中同时施用，所述pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子和另一种治疗剂在同一个组合物中同时施用，或者，所述pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子和另一种治疗剂各自在单独的组合物中间隔一段时间先后施用或顺序施用。
68.根据本发明，其中施用所述pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子相比于未经治疗的个体或用其他治疗剂的单一疗法治疗的个体，抑制t细胞的过度活化，或者抑制t细胞的增殖，所述t细胞选自cd4
+
t细胞和cd8
+
t细胞，或者抑制t细胞分泌免疫因子(例如il-2、ifn-γ和tnf-α等)。
69.在以上描述的技术方案的一些实施方式中，pik3ip1包含选自seq id no.1、2、3、4、5、6、7、8和/或17的序列；在一些实施方式中，pik3ip1由选自seq id no.1至8之一的序列组成。
70.在以上描述的技术方案的一些实施方式中，pik3ip1ecd包含选自seq id no.9和/或10的序列；在一些实施方式中，pik3ip1ecd由选自seq id no.9或10的序列组成。
71.在以上描述的技术方案的一些实施方式中，包含pik3ip1ecd的融合分子包含选自seq id no.9和/或10的序列。在一些实施方案中，包含pik3ip1ecd的融合分子的至少一个融合伴侣选自fc、白蛋白和聚乙二醇。在一些实施方案中，包含pik3ip1ecd的融合分子的至少一个融合伴侣是fc。在一些实施方案中，包含pik3ip1ecd的融合分子的至少一个融合伴侣是igg fc。在一些实施方案中，所述igg fc的碱基序列由选自seq id no.15或16的序列组成。在一些实施方案中，包含pik3ip1ecd的融合分子的碱基序列由选自seq id no.11至14之一的序列组成。
72.本技术中的序列和描述
73.74.75.76.[0077][0078]
术语
[0079]
为了使本发明更加容易理解，首先对一些术语进行定义。如本技术中使用的，除非在本文中有明确描述，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。其它定义在本技术全文中给出。
[0080]
术语“任选”、“任选地”或“任选存在”是指随后描述的事件或情形可以但不一定出现，并且该描述包括其中所述事件或情形出现的情况和不出现的情况。
[0081]
术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。应当理解，术语“包含”可以涵盖封闭式的含义，即“由
…
组成”。
[0082]“免疫应答”是指脊椎动物体内针对外来作用介质的生物学应答，该应答可保护生物体免于被这些作用介质或者由其造成的疾病的伤害。免疫应答是由免疫系统的细胞(例如，t淋巴细胞，b淋巴细胞，自然杀伤nk细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，树突细胞
或嗜中性粒细胞)和由这些细胞的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体，细胞因子和补体)的作用介导的，其导致脊椎动物机体入侵病原体、细胞或被病原体感染的组织、癌细胞或其它异常细胞，或者，在自身免疫性或病理性炎症中，针对正常的人细胞或组织的选择性靶向、结合、损害、破坏，和/或消除。
[0083]
术语“标志物”、“标记”或“细胞标记”含义相同，表示处于化学或生物实体形式的任何性状或特征。标记可以在性质上是形态的、功能的或生物化学的。
[0084]
术语“结合剂”、“结合分子”和“结合实体”是同义的，可以互换使用。在本发明的上下文中，结合剂结合、识别本发明所述的生物标志物，与之相互作用、反应或以别的方式发生关联，但基本上不识别或结合除所述生物标志物之外的其他分子。示例性结合剂可以包括但不限于抗体或其片段、适配体、核酸(例如dna和rna)、蛋白质(例如受体、酶、酶抑制剂、酶底物、配体)、肽、凝集素、脂肪酸或脂质和多糖。同样，术语“结合”是指结合剂识别并粘附所述生物标志物，但基本上不识别或粘附其他分子。
[0085]
术语“抗体”以最宽泛的意义使用，具体地涵盖合成抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、灵长类化抗体、fab片段、f(ab')片段、单链fvfc(scfvfc)、单链fv(scfv)、抗独特型(抗id)抗体和任何其他免疫活性抗体片段，只要它们展示出所希望的生物活性(即，标记相关或结合)即可。
[0086]
分子的“片段”意思是指分子的任何连续多肽或核苷酸子集。例如跨膜蛋白的片段可以包括仅包含胞外结构域或其某个部分的构建体。就本发明而言，标记片段或衍生物可以包括选择标记的任何免疫反应性或免疫活性部分。
[0087]
术语“诊断剂”、“诊断试剂”在本发明中具有相同含义，是指用于诊断疾病或失调目的的任何分子、化合物、和/或物质。在优选的实施例中，诊断剂应当包含与报告分子结合的结合剂。
[0088]
术语“报告分子”是指通过本领域技术人员可获得的任何方法学可检测的任何分子、化合物、和/或物质，非限制性实例包括染料、荧光标记、气体、金属、或放射性同位素。
[0089]
术语“检测试剂”是指能检测到目标物质的试剂，其包含能结合目标物质的结合剂(例如探针、引物或抗体等)，显示或指示出所述结合的报告分子(例如酶、显色剂、荧光物质、放射性物质等)，任选还包含能放大所述结合的化学物质(例如pcr用试剂)等。本发明可采用本领域已知的各种检测rna或蛋白质的方法以及相应的检测试剂，来检测本发明所述的生物标志物组存在与否以及量的多少，例如采用定量rt-pcr、基因芯片、northern印迹法、原位杂交、狭缝印迹法、酶联免疫吸附法、免疫组化法、west-blot、流式细胞技术、蛋白质组技术、二维凝胶电泳、质谱法等。
[0090]
术语“表达”和“基因表达”含义相同，是指细胞在生命过程中，把储存在dna顺序中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
[0091]
术语“表达增高”、“高表达”和“表达上调”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高。根据本发明，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高为正常水平至少1.3倍，例如，至少2、3、4、5、10、20或更多倍。
[0092]
术语“表达降低”、“低表达”和“表达下调”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数降低，和/或翻译降低。根据本发明，基因转录的拷贝数降低，和/或翻译降低为
不超过正常水平的0.9倍，例如，不超过0.8、0.7、0.6、0.5、0.33、0.25、0.1或更少倍。
[0093]
本文所用的术语“pik3ip1”是指磷脂酰肌醇3激酶相互作用蛋白1(pi3k interacting protein1，pik3ip1)，其能与磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，pi3k)的p110亚基结合，可以下调pi3k活性，抑制丝氨酸苏氨酸激酶的活化，包含其天然存在的等位基因形式和经加工的各种同工型。
[0094]
术语“pik3ip1”还指来自人物种和非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类的pik3ip1。
[0095]
术语“人pik3ip1蛋白”是指由seq id no:1-3任一编码的蛋白质及其变体。在一些实施方案中，人pik3ip1蛋白变体可以是天然存在的变体。
[0096]
术语“小鼠pik3ip1蛋白”是指由seq id no:4-8任一编码的蛋白质及其变体。在一些实施方案中，小鼠pik3ip1蛋白变体可以是天然存在的变体。
[0097]
有时通过诸如用于人pik3ip1的h pik3ip1、用于鼠pik3ip1的m pik3ip1等术语来指示来自特定物种的pik3ip1。
[0098]
术语“pik3ip1胞外域”(pik3ip1 extracellular domain“pik3ip1ecd”)包括全长pik3ip1ecd、pik3ip1ecd片段和pik3ip1ecd变体。如本文所用的，术语“pik3ip1ecd”指pik3ip1多肽，其缺少胞内域和跨膜域，具有或没有信号肽。如本文所用的，术语“全长pik3ip1ecd”指延伸至胞外域的最后氨基酸的pik3ip1ecd，并且可以包括或不包括n-末端信号肽。
[0099]
当pik3ip1ecd由选自seq id no.9和10的序列组成时，pik3ip1ecd可含有或不含有多种翻译后修饰，诸如糖基化和唾液酸化。换言之，当pik3ip1ecd由特定的氨基酸序列组成时，其在连续的氨基酸序列中不含有另外的氨基酸，但可能含有对氨基酸侧链、n末端氨基和/或c-末端羧基的修饰。
[0100]
如本文所用的，术语“pik3ip1ecd片段”指从全长ecd的n和/或c末端缺失一个或多个残基并保持和全长pik3ip1ecd相同结合能力的pik3ip1ecd。pik3ip1ecd片段可以包括或不包括n-末端信号肽。
[0101]
如本文所用的，术语“pik3ip1ecd变体”指含有氨基酸添加、缺失和取代并保持和亲代pik3ip1ecd相同结合能力的pik3ip1ecd。此类变体可与亲代pik3ip1ecd具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性。两个多肽的同一性可通过相似性得分来测量，所述测量方法是本领域已知的，例如使用确定相似性的具有缺省设置的bestfit程序来比较两个多肽的氨基酸序列的同一性或相似性。
[0102]
术语“包含pik3ip1ecd的融合分子”指包含pik3ip1ecd和一个或多个“融合伴侣”的分子。在一些实施方案中，pik3ip1ecd和融合伴侣是共价连接的。若融合伴侣也是多肽(“融合伴侣多肽”)，则pik3ip1ecd和融合伴侣多肽可以是连续的氨基酸序列的部分，且融合伴侣多肽可与pik3ip1ecd的n末端或c末端相连接。在这样的情况下，pik3ip1ecd和融合伴侣多肽可自编码pik3ip1ecd和融合伴侣多肽两者的编码序列被翻译为单一的多肽(“pik3ip1ecd融合蛋白”)。在一些实施方案中，pik3ip1ecd和融合伴侣通过其他方式共价连接，诸如，除肽键外的化学键。在另外的实施方案中，pik3ip1ecd和融合伴侣可通过“接头”来融合，所述接头由至少一个氨基酸或化学部分组成。这些融合伴侣可促进纯化，或者使包含pik3ip1ecd的融合分子的体内半衰期延长。为了本发明的治疗目的，所述的融合伴侣不会产生中和抗原性反应或其他不利反应。
[0103]
在一些实施方案中，pik3ip1ecd多肽和融合伴侣是非共价连接的，例如使用结合对将它们连接。示例性的结合对包括但不限于，生物素和亲和素或链霉亲和素、抗体和其抗原等。
[0104]
在一些实施方案中，包含pik3ip1ecd的融合分子包含信号肽。在一些实施方案中，包含pik3ip1ecd的融合分子缺少信号肽。并且，因为pik3ip1ecd与融合分子相连接，在pik3ip1ecd的n末端和/或c末端可能存在另外的氨基酸，但那些氨基酸并非来自pik3ip1序列，但可来自，例如，接头序列或融合伴侣序列。
[0105]
pik3ip1ecd的合适的融合伴侣包括例如，聚合物，诸如水溶性聚合物，免疫球蛋白的恒定结构域；人血清白蛋白(hsa)的全部或部分；胎球蛋白a；胎球蛋白b；亮氨酸拉链结构域；四连接素三聚化结构域；甘露糖结合蛋白(也称作甘露糖结合凝集素)，例如，甘露糖结合蛋白1；和fc区。
[0106]
聚合物，例如，水溶性的聚合物，作为融合伴侣使用以降低包含pik3ip1ecd的融合分子在水性环境中(诸如生理环境中)的沉淀。本发明所采用的聚合物是药学上可接受的聚合物，包括但不限于，羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(无论是均聚物或无规共聚物)、聚乙二醇(peg)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(ppg)和其他聚氧化烯(polyakylene oxide)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇(pog)(例如，甘油)和其他聚氧乙烯化的多元醇。通常，可在使蛋白质与活化的聚合物分子反应的任何合适的条件下进行化学衍生。可用于将聚合物与活性部分连接的活化的基团包括砜、硫醇、三氟甲基磺酸盐、三氟乙基磺酸酯、氮丙啶(azidirine)、马来酰亚胺、巯基、环氧乙烷和5-吡啶基。通常将本发明的聚合物在氨基酸的α或ε氨基或反应性硫醇基上与pik3ip1ecd连接。
[0107]
可将本发明的pik3ip1ecd与标记物序列融合。标记物氨基酸序列可以是六聚组氨酸肽，六聚组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。
[0108]
在不同的实施方案中，寡聚化对融合蛋白提供了一些功能优点，包括但不限于，多价、增加的结合强度和不同的结构域的组合功能。因此，在一些实施方案中，融合伴侣包含寡聚化结构域，例如，二聚化结构域。示例性的寡聚化结构域包括但不限于，卷曲螺旋结构域，包括α-螺旋卷曲螺旋结构域；胶原蛋白结构域；胶原蛋白样结构域；和某些免疫球蛋白结构域。示例性的卷曲螺旋多肽融合伴侣包括但不限于，血管生成素卷曲螺旋结构域；四连接素卷曲螺旋结构域；软骨寡聚基质蛋白的卷曲螺旋结构域；和亮氨酸拉链结构域。
[0109]
可用作融合伴侣的许多fc结构域是本领域中已知的。在一些实施方案中，融合伴侣是fc免疫球蛋白结构域。fc融合伴侣可以是在天然存在的抗体中发现的野生型fc、其变体或其片段。非限制性的示例性fc融合伴侣包括包含人igg(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4)的铰链结构域以及ch2和ch3恒定结构域的fc。另外的示例性fc融合伴侣包括但不限于，人iga和igm。
[0110]
术语“pik3ip1ecd-fc”代表由pik3ip1胞外区和fc构成的融合蛋白。
[0111]
在一些实施方案中，融合伴侣是白蛋白。示例性的白蛋白包括但不限于，人血清白蛋白(hsa)和能够增加与其融合的多肽的血清半衰期或生物利用率的hsa片段。
[0112]
融合伴侣的示例性的连接
[0113]
可将融合伴侣共价地或非共价地与pik3ip1ecd的n末端或c末端连接。连接还可发生在pik3ip1ecd中除n末端或c末端的位置，例如，通过氨基酸侧链(例如，半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸的侧链)来连接。
[0114]
在共价的或非共价的连接的实施方案中，接头可含于融合伴侣和pik3ip1ecd之间。此类接头可以由至少一个氨基酸或化学部分组成。将融合伴侣与pik3ip1ecd共价连接的示例性方法包括但不限于，将融合伴侣和pik3ip1ecd作为单一的氨基酸序列来翻译和将融合伴侣与pik3ip1ecd化学连接。当融合伴侣和pik3ip1ecd作为单一的氨基酸序列来翻译时，在融合伴侣和pik3ip1ecd之间可包括另外的氨基酸作为接头。在一些实施方案中，基于编码接头的多核苷酸序列来选择接头，以有利于将融合伴侣和/或pik3ip1ecd克隆到单个表达构建体中(例如，可将含有特定的限制位点的多核苷酸置于编码融合伴侣的多核苷酸和编码pik3ip1ecd的多核苷酸之间，其中含有限制位点的多核苷酸编码短的氨基酸接头序列)。当通过化学方式将融合伴侣和pik3ip1ecd共价偶联时，在偶联反应过程中通常可包括不同大小的接头。
[0115]
pik3ip1ecd和包含pik3ip1ecd的融合分子的表达和生产载体：此类载体包括但不限于，dna载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。
[0116]
宿主细胞：在不同的实施方案中，pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子可在原核细胞中表达，诸如细菌细胞；或在真核细胞中表达，诸如真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于，cos细胞，293细胞，cho细胞和nso细胞。将核酸导入到期望的宿主细胞中可通过本领域中已知的任何方法来实现，这些方法包括但不限于，磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。
[0117]
pik3ip1ecd多肽的纯化：可通过本领域中已知的多种方法纯化pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子。此类方法包括但不限于，亲和基质或疏水作用色谱的使用。合适的亲和配体包括pik3ip1ecd或融合伴侣的任何配体。例如，蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或抗体亲和柱可用于与fc融合伴侣结合以纯化包含pik3ip1ecd的融合分子。
[0118]
术语“信号肽”指位于多肽的n末端的氨基酸残基的序列，其促进多肽从哺乳动物细胞中分泌。在将多肽从哺乳动物细胞中运出之后可将信号肽裂解，形成成熟蛋白质。信号肽可以是天然的或合成的，并且它们对于其所连接的蛋白质可以是异源的或同源的。
[0119]“药学上可接受的载体”包括任何和全部的生理上相容的溶剂、分散介质、防腐剂、等渗剂、缓释剂、包衣等等。优选地，载体适合于静脉内、皮下、肌内、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。本发明的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐、抗氧化剂、水和非水性载体，和/或佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
[0120]
药物或治疗剂(例如本发明的pik3ip1)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物的任何如下所述的量，当单独使用或与另一种治疗剂组合使用该量的药物时，可促进疾病消退，疾病消退表现为疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、或者防止由患病导致的障碍或失能。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，“预防有效量”或“预防有效剂量”是药物的任何如下所述的量，当将该量的药物单独施用或者与另一种治疗剂组合施用于具有发生疾病的风险或者遭受疾病复发的受试者时，可抑制疾病的发生或复发。治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力可以用技术
人员已知的各种方法进行评估，例如在人类受试者的临床试验中，在可预测在人类中的效力的动物模型系统中，或者通过在体外测定系统中测定试剂的活性。
[0121]“自身免疫性疾病”是多种因素引起体内病理性自身免疫反应，通过自身免疫反应，破坏和损伤自身组织和细胞成分，导致组织损害和器官功能障碍所引起的疾病，包括器官特异性自身免疫性疾病和系统性自身免疫性疾病。它通常累及血液、关节、肌肉、骨骼及关节周围的软组织等。
[0122]“受试者”是指接受本发明活性物质作用的生命体，在本技术中可与“用药者”或“患者”互换使用。受试者可以是人或者动物，例如猴、大鼠、小鼠、狗、兔等。
[0123]
通过以下实施例进一步举例说明本发明，这些实施例不应当被解释为具有限制作用。本技术明确地通过提述并入本技术全文中引用的所有图和所有参考文献、专利和被公开专利申请的内容。
附图说明
[0124]
图1a显示了自身免疫性疾病患者(系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)、多发性硬化(ms))较之健康者(hd)pbmc中pik3ip1
+
t细胞的比例显著降低。
[0125]
图1b显示了pik3ip1基因在sle、ra、ms和ss患者中的表达较之健康者(hd)显著降低；随着sle疾病程度从1进展到3，pik3ip1的表达逐步减少；ms患者的症状缓解pik3ip1表达的恢复，接受治疗的ms患者pik3ip1表达高于未接受治疗的；ra患者在抗肿瘤坏死因子治疗后pik3ip1表达上调，在抗风湿药治疗后pik3ip1表达上调。
[0126]
图1c显示了自身免疫性疾病患者常见的临床检测指标(crp、esr、eoss和dsdna)表达的增加与pik3ip1
+
t细胞的比例呈负相关。
[0127]
图1d显示pik3ip1在sle(左)、ra(中)、ms(右)潜在诊断价值的roc曲线。
[0128]
图1e显示了在cd4
+
t细胞中，pik3ip1
+
t细胞比例与tn比例成正比，而与tem比例呈负相关；cd4
+
t细胞上pik3ip1表达的减少与促炎细胞因子(il-2、il-17、inf-γ和tnf-α)的增加有关。
[0129]
图1f显示了在cd8
+
t细胞中，pik3ip1
+
t细胞比例与tn比例成正比，而与tem和temra比例呈负相关；cd8
+
t细胞上pik3ip1表达的减少与促炎细胞因子(il-2、inf-γ和tnf-α)的增加有关。
[0130]
图1g显示了sle、ra、ms和ss患者和hd pbmc的单细胞rna-seq数据集，通过聚类分析发现pik3ip1聚集与静息基因相关。
[0131]
图1h显示了与正常人相比，ss病人组中效应t细胞表达较高，pik3ip1表达较低。
[0132]
图2a显示了t细胞上pik3ip1基因特异性敲除小鼠(cko)的实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型的构建流程。
[0133]
图2b显示了cko小鼠比对照组小鼠表现出更严重的eae病程，其特征是临床评分显著增加。
[0134]
图2c显示了与对照组小鼠相比，cko小鼠cns和脾脏有更多的cd4
+
t细胞、th1、th17和cd8
+
t细胞。
[0135]
图2d显示了在脑组织和脊髓he染色中，cko小鼠中观察到比对照组更多的炎症灶。
[0136]
图2e显示了cko小鼠cns和脾脏t细胞中tem(cd44
+
cd62l-)表型的频率高于对照组
小鼠；相应地，cko小鼠cns和脾脏t细胞中tn(cd44-cd62l
+
)表型的频率较对照组小鼠低。
[0137]
图2f显示了cko小鼠cns和脾脏中产生il-17的cd4
+
t细胞的比例显著高于对照组小鼠。
[0138]
图2g显示了cko小鼠cns和脾脏中产生ifn-γ的cd4
+
t细胞的比例显著高于对照组小鼠。
[0139]
图2h显示了cko小鼠中枢神经系统中产生tnf-α的cd4
+
t细胞的频率高于对照组小鼠。
[0140]
图2i显示了cko小鼠中枢神经系统中产生il-2的cd4
+
t细胞的频率高于对照组小鼠。
[0141]
图2j显示了cko小鼠中枢神经系统中产生ifn-γ的cd8
+
t细胞的频率高于对照组小鼠。
[0142]
图2k显示了cko小鼠中枢神经系统中产生tnf-α的cd8
+
t细胞的频率高于对照组小鼠。
[0143]
图2l显示了cko小鼠中枢神经系统中产生il-2的cd8
+
t细胞的频率高于对照组小鼠。
[0144]
图3a显示了在pik3ip1-t细胞中，参与oxphos的基因显著下调，参与糖酵解的基因上调。
[0145]
图3b显示了pik3ip1-t细胞中表达下调的差异基因富集oxphos和线粒体电子传递通路，而pik3ip1-t细胞中表达上调的差异基因富集免疫效应因子和细胞因子信号通路。
[0146]
图3c显示cko t细胞的基础ocr、最大呼吸速率、呼吸潜力和atp产量低于对照组t细胞。
[0147]
图3d显示与对照组t细胞相比，cko t细胞表现出ecar增加，这是因为cko t细胞的糖酵解能力和储备增加。
[0148]
图3e显示与对照组t细胞相比，cko t细胞的线粒体膜电位显著降低。
[0149]
图3f显示与对照t细胞相比，cko t细胞中没有嵴的线粒体比例更大，每个线粒体中嵴的数量和长度也显著减少。
[0150]
图3g显示与对照组t细胞相比，cko t细胞中关键oxphos基因，chchd3和cox4i1的表达量减少，而负责将丙酮酸转化为乙酰辅酶a的线粒体酶丙酮酸脱氢酶的重要调节因子pdk1的表达显著增加。
[0151]
图3h显示cko t细胞中乙酰辅酶a的水平显著低于对照组t细胞。
[0152]
图3i显示与对照组t细胞相比，糖酵解相关分子glut1、pfkfb3、hk2和ldha在cko t细胞中表达上调。
[0153]
图3j显示用糖酵解抑制剂2-脱氧-d-葡萄糖(2dg)治疗cko小鼠后，抑制了异常的t细胞激活，并增加了pik3ip1缺失导致的促炎细胞因子的产生。
[0154]
图4a显示与对照组t细胞相比，pik3ip1-t细胞中代谢重编程相关的基因如缺氧诱导因子1α(hif1α)、myc原癌基因(myc)、干扰素调节因子4(irf4)和高迁移率组蛋白1(hmgb1)的表达显著增加，其中，hif1α增加最明显。
[0155]
图4b显示在sle、ra、ms、ss或sjia患者中，hif1α的表达与t细胞中pik3ip1的表达呈显著负相关。
[0156]
图4c显示与对照组t细胞相比，cko t细胞中hif1α和pi3k-akt-mtor通路分子的蛋白水平显著上调。
[0157]
图4d显示在使用雷帕霉素(mtor抑制剂)后，cko t细胞中hif1α的增加显著减少，甚至低于对照组t细胞中的水平。
[0158]
图4e显示在bay87-2243(hif1α抑制剂)存在的情况下，cko t细胞严重受损的线粒体膜电位完全恢复。
[0159]
图4f显示在bay87-2243处理后，cko t细胞线粒体基因pdk1表达的差异消失。
[0160]
图4g显示在bay87-2243处理后，hif1α和糖酵解相关基因glut1、hk2、pfkfb3和ldha的增加被减弱，在对照组和cko+bay87-2243组之间的水平相似。
[0161]
图4h显示bay87-2243处理可以部分消除pik3ip1缺乏对t细胞分泌乳酸的影响。
[0162]
图4i显示与对照组t细胞相比，cko t细胞具有更大比例的tem，较小比例的tn，激活后产生更多的促炎细胞因子。bay87-2243和雷帕霉素降低cko t细胞过度活跃表型的能力明显，可减少促炎细胞比例到与对照组相似。
[0163]
图5a显示了在对照组、cko组和cko+bay87-2243组小鼠上构建eae模型的流程。
[0164]
图5b显示了与cko小鼠相比，cko+bay87-2243小鼠的临床评分显著下降，表明对cko小鼠使用hif1α抑制剂可以在很大程度上减轻临床疾病。
[0165]
图5c显示了cko+bay87-2243小鼠cd4
+
t细胞、th1、th17和cd8
+
t细胞的数量，特别是cko+bay87-2243小鼠中枢神经系统中的数量，明显降低到对照组水平，然而，bay87-2243不足以抑制脾脏t细胞浸润。
[0166]
图5d显示bay87-2243处理后，脑和脊髓的促炎细胞形态减少。
[0167]
图5e显示在bay87-2243的作用下，cko小鼠cns t细胞和脾t细胞呈现tem表型的频率降低，而tn表型的频率则呈现相反的趋势。
[0168]
图5f显示在bay87-2243的作用下，cko小鼠cns中cd4
+
t细胞产生的ifn-γ、il-17和tnf-α也减少。
[0169]
图5g显示cko和cko+bay87-2243小鼠产生ifn-γ或tnf-α的cd8
+
t细胞和产生il-2的t细胞的百分比没有显著差异。
[0170]
图5h显示经bay87-2243处理后，cko小鼠脾脏中t细胞乳酸(代表糖酵解)产量显著减少。图6a显示了在对照组、cko组、cko+flag-mig组和cko+pikip3-mig组小鼠上构建eae模型的流程。
[0171]
图7a显示pik3ip1-hig处理后，t细胞活化受到抑制。
[0172]
图7b显示pik3ip1-hig处理组cd4
+
和cd8
+
t细胞的增殖远低于pbs组和flag-hig组，且具有显著性差异。
[0173]
图7c显示pik3ip1-hig处理组的t细胞分泌il-2、ifn-γ和tnf-α的量远低于pbs组和flag-hig组，且具有显著性差异。
[0174]
图8a显示了在wt小鼠上构建eae模型并用mpikip3-mig给药治疗的实验流程。
[0175]
图8b显示了在wt小鼠的eae模型中，mpikip3-mig可以降低小鼠的疾病临床评分。
具体实施方式
[0176]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
[0177]
以下实施例中：
[0178]
材料和方法
[0179]
1)临床样本
[0180]
系统性红斑狼疮(sle,57例)、类风湿关节炎(ra,28例)和多发性硬化(ms,28例)患者来自中山大学第三附属医院。入选标准：排除乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)或其他细菌感染患者。患者临床病理资料见表1。同时，纳入年龄和性别匹配的健康捐赠者(hd,n＝10)。治疗开始前和治疗4周后采集全血样本(6例匹配的治疗后ms患者除外，以评估治疗对pik3ip1表达的影响)。本研究经中山大学口腔医院伦理委员会和中山大学第三附属医院伦理委员会批准。根据《赫尔辛基宣言》，所有受试者都获得了书面知情同意。
[0181]
表1：sle患者、ra患者、ms患者及健康者(hd)的临床特点
[0182][0183][0184]
2)小鼠
[0185]
c57bl/6小鼠(文中以“wt鼠”指代)购自中山大学实验动物中心(中国广东广州)。pik3ip1
flox/flox
(control)鼠是在c57bl/6小鼠背景下通过在pik3ip1基因外显子两侧插入flox来构建(由南京大学-南京生物医药研究院构建)。cd4
cre
小鼠是中山大学周洁赠送。t细胞特异性pik3ip1敲除小鼠(cd4
cre
pik3ip1
flox/flox mice，cko)是通过pik3ip1
flox/flox
小鼠与cd4
cre
小鼠杂交获得。所有小鼠均在中山大学spf级设施中饲养。所有动物研究都是根据机构动物护理和使用委员会(iacuc)的指导方针批准和实施的。
[0186]
3)eae模型的建立
[0187]
将不完全弗氏佐剂与结核菌素(8mg/ml)充分混匀得到完全弗氏佐剂再与溶解在pbs中的mog35-55蛋白(2mg/ml)按1:1比例在三通管中置于冰上充分混匀，最终制成油包水的乳化剂。6～8周龄雌性cko小鼠和对照组小鼠(control)，每只小鼠用胰岛素针背部皮肤均匀三点注射，225μl/只，75μl/点。进针方法：皮下进针，深约2cm，针头朝内侧，勿挑起针
头，注射完后立即抽出针头，并检查有无漏出。2h后和48h后腹腔注射ptx 0.1ml(1500ng/ml)/只。eae免疫后临床体征按以下标准：0分，没有临床症状；0.5分，尾尖无力；1分，尾端无力；2分，共济失调，后肢轻度瘫痪；2.5，一后肢完全瘫痪；3，双后肢完全瘫痪；3.5，后肢瘫痪合并前肢无力；4，前后肢完全瘫痪；5，死亡。28天后，小鼠腹腔注射戊巴比妥(100mg/kg体重)，心脏灌注30ml pbs后直至血水变清，肝脏变白后，解剖出脊髓、脑和脾脏，用4％多聚甲醛固定，进行石蜡包埋或单细胞悬液制作。
[0188]
4)流式细胞术和细胞分选
[0189]
细胞悬液用含2％血清的pbs和fcblock(10μg/ml)(2.4g2,bioxcell)冰上孵育10分钟进行封闭，然后进行抗体染色。用100μlpbs配置的ghost dye死活染料(1:200)，室温孵育15分钟。表面标记物在含2％胎牛血清的pbs中4℃染色30分钟。细胞内细胞因子染色时用加入200μl完全培养基配置的1
×
cell stimulation cocktail，在37℃、5％co2条件下体外刺激细胞5小时后，然后用200μl ic fixation工作液进行细胞固定，4℃，30分钟；1
×
破膜试剂终止固定，然后按厂家说明加入破膜终止液配置的胞内因子流式抗体悬液染色。对于核内染色，据制造商的说明书使用foxp3/转录因子染色缓冲液进行固定破核。所有的分析都是在bd lsrfortessa仪器上进行的。分选是在bd facsaria仪器上进行。数据分析和处理采用flowjo软件。使用的抗体和试剂见表2。
[0190]
5)geo数据库中单细胞和bulk rna测序数据的基因特征分析
[0191]
使用的单细胞测序数据来自gse157278(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝gse157278)并使用seurat包进行处理。线粒体基因和小于1000个阳性计数的细胞数据被删除。sle、ra、ms和ss的bulk rna测序数据(图1b)分别来自gse61635、gse93272、gse146383和gse66795。sle、ra和ms的bulk rna测序数据(图1b)分别来自gse65391、gse45291和gse146383。sle、ra和ms的bulk rna测序数据(图1g)分别来自gse61635、gse45291和gse24427。sle、ra、ss和sjia的批量rna测序数据(图4b)分别来自gse61635、gse45291、gse66795和gse80060。
[0192]
6)mrna-rna测序和分析
[0193]
采用流式分选出3只小鼠脾脏的pik3ip1
+
或pik3ip1-t细胞，送广州美格生物科技有限公司进行总rna测序。通过omicstudio(https://www.omicstudio.cn/tool)对pik3ip1
+
或pik3ip1-t细胞转录组进行主成分分析和基因集富集分析。用pheatmap r软件包完成热图。每组去除fpkm＜1的基因后完成文氏图。
[0194]
7)代谢分析
[0195]
在xfe96 extracellular flux分析仪上进行线粒体压力测试与糖酵解速率测试。使用xf cell mito stress kit，在添加10mm葡萄糖、2mm l-谷氨酰胺和1mm丙酮酸钠的seahorse xf base medium中，用对照组和cko小鼠的纯cd4
+
和cd8
+
t细胞进行线粒体压力测试。使用xf cell glycolytic stress kit，在添加2mm l-谷氨酰胺和1mm丙酮酸钠的seahorse xf base medium中，对刺激过的cd4
+
和cd8
+
t细胞进行糖酵解应激试验。所有xfe96 fluxpask在接种细胞前都进行了多聚l-赖氨酸处理并进行300g离心1分钟。用乳酸含量检测试剂盒对刺激后的t细胞进行乳酸检测。采用液相色谱法检测乙酰辅酶a。
[0196]
8)线粒体功能和结构研究
[0197]
从cko或对照组中纯化的cd4
+
和cd8
+
t细胞，用四甲基罗丹明甲酯(tmrm)染色，通过
共聚焦和流式细胞术以测定线粒体膜电位(δψm)。用透射电镜(tem)观察cko和对照组纯化的t细胞的线粒体嵴的形态。线粒体嵴的平均数量和长度由两名独立的观察者进行分析统计，用到的抗体见表2。
[0198]
9)rna提取和rt-qpcr
[0199]
使用rneasy mini kit(omega，r6834-01)收集总rna，用nano-drop定量。用primescript rt master mix(takara,cat.no.rr037a)从分离的rna中合成cdna。rt-qpcr采用abi quantstudio5系统。所有rt-qpcr引物序列见表2。
[0200]
10)共聚焦染色
[0201]
为了进行线粒体膜电位分析，从cko小鼠或对照小鼠中纯化的cd4
+
和cd8
+
t细胞用tmrm和hoechst33342染色。对于pik3ip1和adam17的检测，用cd3/cd28、il21或p38mapk抑制剂(sb203580)或不用cd3/cd28、il21或p38 mapk抑制剂(sb203580)处理cko或对照小鼠纯化的cd4
+
和cd8
+
t细胞1小时，然后用抗体染色。样品采用olympus fv3000共聚焦显微镜检测。所有用于共聚焦显微镜的抗体都列在表2。
[0202]
11)western blot
[0203]
分别从cko小鼠和对照组小鼠脾脏中提取纯化t细胞。加入100μl ripa冰上裂解细胞30min，8000r/min离心20min，取上清，bca蛋白定量试剂盒定量蛋白，100℃水浴蛋白变性。上样后行10％sds-page凝胶电泳，转膜，封闭，抗体孵育后进行曝光显影。用到的抗体信息见表2。
[0204]
12)刺激和抑制实验
[0205]
il-2 20u/ml、ifn-α500u/ml、anti-cd3/cd28 3μg/ml、il21 30ng/ml刺激纯化的t细胞0、15、30、45、60min后，pik3ip1表达下调。为了在体外激活t细胞进行流式细胞术，将纯化的t细胞(每孔20万细胞)置于扣有1.5μg/ml抗cd3/cd28抗体的96孔平板上培养3天，然后进行相应抗体染色。用3μg/ml抗cd3/cd28抗体培养4小时，用于体外激活t细胞进行rt-qpcr或代谢检测。体外用浓度为1μm的hif1a抑制剂(bay872243)，体内用bay872243灌胃4mg/kg/d。对于mtor抑制，使用10nm雷帕霉素治疗t细胞3天。采用20μm p38 mapk抑制剂sb203580对p38 mapk进行体外抑制。用到的抗体和细胞因子信息见下表2。
[0206]
表2：试剂列表
[0207]
[0208]
[0209]
[0210][0211]
实施例1 pik3ip1的下调与多种自身免疫性疾病的进展相关
[0212]
为了确定pik3ip1在自身免疫性疾病中的作用，我们首先收集113例自身免疫性疾病患者(sle 57例、ra 28例、ms 28例)和10例健康者(hd)的pbmc进行流式细胞术分析检测pik3ip1的表达。
[0213]
我们发现，与健康者相比，所有患者pbmc中pik3ip1
+
t细胞的比例显著降低(图1a)。文献报道pd-1、ctla-4和vista等其他负免疫调节因子在自身免疫性疾病患者t细胞上的表达是升高的，这表明在自身免疫过程中，pik3ip1
+
t细胞的表达模式与其他经典的负性免疫调节因子不同。
[0214]
此外，我们分析了rna-seq数据库，也发现pik3ip1基因在sle、ra、ms和ss患者中显著降低(图1b)。进一步分析pik3ip1与自身免疫性疾病进展和治疗的关系发现：pik3ip1在晚期疾病患者表达更低，随着sle疾病活动从1进展到3，pik3ip1的表达逐步减少；相反，pik3ip1表达的恢复与ms患者的症状缓解相关。ra患者在抗肿瘤坏死因子治疗后pik3ip1表达上调，在抗风湿药治疗后pik3ip1表达上调。roc曲线分析表明，pik3ip1可作为sle、ra和ms的强有力的诊断性生物标志物(图1d)。
[0215]
t细胞的异常激活和功能障碍与许多自身免疫疾病的发展有关(图1c)。鉴于pik3ip1表达下调与疾病进展之间的密切关系，我们接下来探讨了pik3ip1表达下调是否与自身免疫条件下的t细胞过度活跃有关。在cd4
+
和cd8
+
t中，pik3ip1
+
t细胞比例与tn比例成正比，而与tem和temra比例呈负相关(图1e和图1f)，这支持了我们的假设。此外，t细胞上pik3ip1表达的减少与t细胞产生的促炎细胞因子(包括il-17、tnf-α、inf-γ和il-2)的增加有关(图1e和图1f)。ss患者和hd pbmc的单细胞rna-seq数据集也进一步证实这些发现，通过聚类分析发现pik3ip1聚集与静息基因相关(图1g)。与正常人相比，ss病人组中效应t细胞表达较高，pik3ip1表达较低(图1h)。总之，我们观察到在多种自身免疫性疾病中pik3ip1表达的一致下调，并且pik3ip1的表达与疾病严重程度、治疗反应、t细胞激活状态和促炎谱高度相关。
[0216]
实施例2 t细胞缺乏pik3ip1可加重实验性自身免疫性脑脊髓炎
[0217]
我们构建了t细胞上pik3ip1基因特异性敲除小鼠(cko)的实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型(最常用的ms动物模型)，以进一步研究pik3ip1表达与自身免疫性病理之间的因果关系(图2a)。正如预期的那样，我们发现cko小鼠比对照组(control)小鼠表现出更严重的eae病程，其特征是临床评分显著增加(图2b)。
[0218]
此外，eae是一种以中枢神经系统(cns)慢性炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫性疾病，活化的th1和th17细胞的浸润被认为在中枢神经系统炎症和疾病发病机制中起重要作用。因此，我们检测了这两组免疫后中枢神经系统和脾脏中浸润t细胞亚群的数量。我们发现，与对照组小鼠相比，cko小鼠cns和脾脏产生了更多的cd4
+
t细胞、th1、th17和cd8
+
t细胞(图2c)。我们还对两组的脑组织和脊髓切片进行了he染色，在cko小鼠中观察到比对照组更多的炎症灶(图2d)。接下来，我们比较了两组eae中t细胞激活状态和促炎细胞因子的产生。我们观察到cko小鼠cns和脾脏t细胞显示tem(cd44
+
cd62l-)表型的频率高于对照组小鼠。相应地，cko小鼠cns和脾脏t细胞表现出tn(cd44-cd62l
+
)表型的频率较对照组小鼠低(图2e)。此外，cko小鼠cns和脾脏中产生il-17和ifn-γ的cd4
+
t细胞的比例显著高于对照组小鼠(图2f和2g)。此外，我们还观察到cko小鼠中枢神经系统中产生il-2和tnf-α的t细胞和产生ifn-γ的cd8
+
t细胞的频率高于对照组小鼠(图2h-图2l)。这些数据表明，pik3ip1缺失导致t细胞向促炎t细胞亚群分化，这有助于引发自身免疫反应和促进免疫病理。
[0219]
实施例3 pik3ip1缺失的t细胞过度活化的表型是由氧化磷酸化(oxphos)减少和糖酵解增加引起的
[0220]
为了阐明pik3ip1在t细胞激活和功能中的潜在机制，我们从wt小鼠脾脏中对pik3ip1
+
t细胞和pik3ip1-t细胞进行了测序。很明显，pik3ip1
+
t细胞与pik3ip1-t细胞转录谱有很大程度上不同。我们发现pik3ip1-t细胞上调了激活相关基因，而下调了静止相关基因。值得注意的是，在pik3ip1-t细胞中，参与oxphos的基因显著下调，参与糖酵解的基因上
调，从而促进代谢调节的基因发生了显著变化(图3a)。基因集富集分析(gsea)显示，pik3ip1-t细胞中表达下调的差异基因也富集oxphos和线粒体电子传递通路，而pik3ip1-t细胞中表达上调的差异基因富集免疫效应因子和细胞因子信号通路(图3b)。这些结果表明pik3ip1表达与t细胞代谢重编程之间有很强的关系。
[0221]
为了进一步证明pik3ip1在t细胞代谢稳态中的作用，我们通过seahorse线粒体应激试验和糖酵解应激试验，我们发现cko t细胞的基础ocr、最大呼吸、多余呼吸能力和atp产量低于对照组(control)t细胞(图3c)。相反，与对照组t细胞相比，cko t细胞表现出ecar增加，这明显是因为cko t细胞的糖酵解能力和储备增加(图3d)。线粒体被认为是oxphos和细胞atp产生的主要场所。接下来，我们研究了pik3ip1缺失t细胞中oxphos的减少是否归因于线粒体功能受损。从对照组或cko小鼠脾脏中分离的cd4
+
和cd8
+
t细胞用tmrm染色(tmrm是一种用于标记活性线粒体的细胞浸润荧光染料)。通过使用荧光显微镜和流式细胞术测量tmrm的荧光强度(图3e)，我们观察到与对照组t细胞相比，cko t细胞的线粒体膜电位显著降低。与对照t细胞相比，cko t细胞中没有嵴的线粒体比例更大。与对照t细胞相比，cko t细胞中每个线粒体中嵴的数量和长度也显著减少(图3f)。
[0222]
接下来，我们使用实时定量pcr(rt-qpcr)分析了pik3ip1缺失后t细胞的转录谱。我们的研究结果一致表明，与对照组t细胞相比，cko t细胞中关键oxphos基因，如chchd3和cox4i1的表达量减少。相比之下，在cko t细胞中，负责丙酮酸转化为乙酰辅酶a的线粒体酶丙酮酸脱氢酶的重要调节因子pdk1的表达显著高于对照组t细胞(图3g)。支持这一观点的是，cko t细胞中乙酰辅酶a的水平显著低于对照组t细胞(图3h)。另一方面，与对照组t细胞相比，糖酵解相关分子glut1、pfkfb3、hk2和ldha在cko t细胞中表达上调。这些增加在刺激后的t细胞中更为明显(图3i)。
[0223]
为了阐明代谢重编程在pik3ip1缺失t细胞激活平衡状态中的重要性，我们用糖酵解抑制剂2-脱氧-d-葡萄糖(2dg)治疗cko小鼠后，测量了t细胞的激活状态和细胞因子的产生。与我们的假设相支持，2-dg治疗显著抑制了异常的t细胞激活，并增加了pik3ip1缺失导致的促炎细胞因子的产生，其水平甚至与对照组小鼠的t细胞相似(图3j)。总的来说，这些发现强烈表明，pik3ip1的消融可以诱导t细胞代谢从oxphos向糖酵解转变，从而达到激活的平衡状态。
[0224]
实施例4在pik3ip1缺失的t细胞中，hif1α是代谢重编程所必需的
[0225]
我们已经证明，与对照组(control)t细胞相比，cko t细胞的oxphos减少糖酵解增强。然后，我们的目标是研究驱动这种代谢重编程的分子机制。使用大剂量rna测序，我们发现pik3ip1-t细胞中几个先前报道的重编程介导因子的表达显著增加，如缺氧诱导因子1α(hif1α)、myc原癌基因(myc)、干扰素调节因子4(irf4)和高迁移率组蛋白1(hmgb1)。其中，hif1α呈现出最大的增加量(图4a)。此外，在sle、ra、ms、ss或sjia患者中，hif1α的表达与t细胞中pik3ip1的表达呈显著负相关，提示在自身免疫条件下，hif1α也可能受到pik3ip1表达水平的负相关影响(图4b)。如前所述，pik3ip1可作为pi3k-akt-mtor通路的抑制剂，并被证明在hif1α和mtor信号通路之间有很强的联系。为了更好地理解pik3ip1和hif1α之间的关系，我们分析了在对照组和cko t细胞中存在或不存在雷帕霉素(一种特异性mtor抑制剂)时hif1α的表达情况。正如预期的那样，与对照组t细胞相比，cko t细胞中hif1α和pi3k-akt-mtor通路分子的蛋白水平显著上调(图4c)。然而，在使用雷帕霉素后，cko t细胞中观
察到的增加显著减少，甚至低于对照组t细胞中观察到的水平，这表明pik3ip1在mtor信号介导的hif1α表达中发挥直接调节作用(图4d)。因此，我们假设hif1α可能在pik3ip1缺失导致的代谢重编程中发挥重要作用。
[0226]
为了验证这一假设，我们使用hif1α抑制剂bay87-2243评估了对照组和cko t细胞的代谢活动。tmrm分析显示，在bay87-2243存在的情况下，cko t细胞严重受损的线粒体膜电位完全恢复(图4e)；我们在rt-qpcr研究中观察到的对照组和cko t细胞线粒体基因pdk1表达的差异在bay87-2243处理后消失(图4f)。提示pik3ip1缺失后cko t细胞中oxphos的减少主要依赖于hif1α/pdk1轴的上调。另一方面，hif1α和糖酵解相关基因glut1、hk2、pfkfb3和ldha的增加被减弱，在对照组和cko+bay87-2243组之间的水平相似(图4g)。此外，我们发现，与对照组t细胞相比，cko t细胞表现出更多的乳酸积累，这可能是由于cko t细胞的糖酵解升高，因为乳酸是糖酵解的最终产物。如预期的那样，bay87-2243处理可以部分消除pik3ip1缺乏对t细胞乳酸分泌的影响(图4h)。
[0227]
接下来，我们研究了hif1α抑制对体外耗尽pik3ip1后t细胞激活状态和细胞因子产生的影响。我们的结果表明，与对照组t细胞相比，cko t细胞具有更大比例的tem，较小比例的tn，激活后产生更多的促炎细胞因子。更重要的是，我们还证明了hif1α抑制剂和雷帕霉素降低cko t细胞过度活跃表型的能力是明显的，减少到促炎细胞比例与对照组t细胞相似(图4i)；总之，这些发现表明hif1α的升高对于pik3ip1缺失的t细胞的糖酵解代谢重编程是必不可少的，抑制hif1α是对抗这种改变的有效策略，从而逆转pik3ip1缺失后的促炎t细胞表型。
[0228]
实施例5抑制hif1α可有效降低pik3ip1缺陷小鼠增加的eae严重程度
[0229]
为了进一步探讨pik3ip1/hif1α/糖酵解轴在自身免疫环境中的作用，我们在对照组(control)、cko组和cko+bay87-2243组小鼠上进行了上述eae模型(图5a)。我们发现，与cko小鼠相比，cko+bay87-2243小鼠的临床评分显著下降，这表明对cko小鼠使用hif1α抑制剂可以在很大程度上减轻临床疾病(图5b)。此外，cko+bay87-2243小鼠cd4
+
t细胞、th1、th17和cd8
+
t细胞的数量，特别是在cko+bay87-2243小鼠中枢神经系统中的数量，明显降低到对照组水平。然而，尽管hif1α抑制剂对中枢神经系统有完全的抑制作用，但它不足以抑制脾脏t细胞浸润(图5c)。eae病变中炎症浸润的逆转被发现与改善疾病预后相关。he染色进一步显示bay87-2243处理后，脑和脊髓的促炎细胞形态减少(图5d)。
[0230]
同样，为了确定hif1α抑制剂是否可以抑制自身免疫性疾病中t细胞的过度活跃，我们使用相同的eae模型，比较了bay87-2243治疗前后t细胞的激活状态和细胞因子的产生。在bay87-2243的作用下，cko小鼠cns t细胞和脾t细胞呈现tem表型的频率降低，而tn表型的频率则呈现相反的趋势(图5e)。与此一致的是，抑制hif1α也能减少cko小鼠cns中cd4
+
t细胞产生的ifn-γ、il-17和tnf-α。需要注意的是，脾脏中t细胞产生的细胞因子没有改变，这表明对脾脏炎症反应的影响很小(图5f)。然而，cko和cko+bay87-2243小鼠产生ifn-γ或tnf-α的cd8
+
t细胞和产生il-2的t细胞的百分比没有显著差异(图5g)。此外，我们观察到经bay87-2243处理后，cko小鼠脾脏中t细胞糖酵解显著减少，这是由乳酸产生所显示的(图5h)。这些结果表明，抑制hif1α可以通过恢复t细胞代谢稳态和减少促炎t细胞浸润来减轻pik3ip1缺失导致的eae严重程度的增加。
[0231]
实施例6包含pik3ip1ecd的融合分子体外功能验证实验
[0232]
研究包含pik3ip1ecd的融合分子在体外对免疫细胞的活性影响。flag-hig(flag-hig为无序对照序列与人igg fc的融合蛋白)和pik3ip1-hig(pik3ip1-hig为人pik3ip1胞外区和人igg fc构成的融合蛋白)的合成方法参见中国专利申请201810112922.x。
[0233]
anti-hcd3扣板：anti-hcd3单克隆抗体，配成终浓度0.125μg/ml，按50μl/孔加入96孔板，封板，4℃过夜；吸去孔内未结合的蛋白溶液，按100μl/孔加入冷的pbs清洗，并重复洗板至少3遍。
[0234]
pik3ip1-hig和flag-hig扣板：pik3ip1-hig和flag-hig分别配成终浓度5μg/ml，按50μl/孔加入96孔板中pik3ip1实验孔和flag对照孔，另留一组洗板后加50μl pbs的孔，封板，4℃过夜；使实验孔分为三组：分别是anti-hcd3+flag-hig，anti-hcd3、anti-hcd3+pik3ip1-hig，每组三样本，每样本三副孔。
[0235]
采用梯度离心法分离得到健康人的pbmc。
[0236]
a:10％fbs 1640培养基重悬细胞，按每孔3.5
×
105细胞/孔200μl培养基，加入各孔。在37℃，5％co2培养箱培养2-4天；流式检测：
①
细胞培养2天后，取出一块96孔板，吹打相应细胞至流式管。pbs洗涤细胞，离心弃上清后，流式检测早期活化标记cd69，cd25，
②
细胞培养4天后，取出另一块96孔板，吹打相应细胞至流式管。pbs洗涤细胞，离心弃上清后，流式检测晚期活化标记cd95，hla-dr。
[0237]
b:用磁珠分选出cd4
+
或cd8
+
t细胞；进行cfse标记：1mm cfse标记cd4
+
t和cd8
+
t细胞，37℃细胞培养箱中标记10min。10-20ml pbs终止反应，洗三遍。流式检测细胞是否标记上cfse；按每孔3.5
×
105个细胞加入cd4
+
t和cd8
+
t细胞，37℃，5％co2培养箱培养2天；转移细胞：轻吹起将上述96孔板细胞，按相应组别移至只扣了anti-hcd3(0.125μg/ml的)的板，继续培养3天；流式检测增殖。
[0238]
c:收集anti-hcd3+flag-hig，anti-hcd3、anti-hcd3+pik3ip1-hig处理cd3
+
t细胞1天和3天的细胞培养上清，采用elisa试剂盒检测细胞因子il-2(24小时)、ifn-γ和tnf-α(72小时)在细胞培养上清中的含量。
[0239]
结果如图7a-7c所示。图7a显示pik3ip1-hig处理组的t细胞的早期活化标记cd69，cd25和晚期活化标记cd95，hla-dr，表达量均低于flag-hig处理组，说明pik3ip1-hig处理抑制了t细胞活化。图7b显示pik3ip1-hig处理组cd4
+
和cd8
+
t细胞的增殖远低于pbs组和flag-hig组，且具有显著性差异。图7c显示pik3ip1-hig处理组的t细胞分泌il-2、ifn-γ和tnf-α的量远低于pbs组和flag-hig组，且具有显著性差异。由此可见，pik3ip1-hig能够抑制t细胞的增殖、活化及其免疫因子的分泌能力。
[0240]
实施例7 pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验方法
[0241]
为了探讨pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗，我们在wt小鼠上进行上述eae模型，并将小鼠分为两组，每组各8只，分别从0天开始经腹腔给予200μg flag-mig、200μg mpik3ip1-mig，一周2次，期间进行临床评分，评分同前述(图8a)。所述flag-mig(flag-mig为无序对照序列与鼠igg fc的融合蛋白)和mpik3ip1-mig(mpik3ip1-mig为小鼠pik3ip1胞外区和小鼠的igg fc构成的融合蛋白)的合成方法参见中国专利申请201810112922.x。
[0242]
结果如图8b所示，eae小鼠模型在造模用药10天之后开始出现临床评分可见的改
变，而mpik3ip1-mig给药组相比于flag-mig给药组，随时间推移，临床评分是低的，且有显著性差异，表明mpik3ip1-mig对eae有治疗和改善作用。
[0243]
实施例8 pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验方法
[0244]
为了进一步探讨pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗，我们在对照组(control)、cko组、cko+flag-mig组(flag-mig为无序对照序列与鼠igg fc的融合蛋白)和cko+mpik3ip1-mig(mpik3ip1-mig为小鼠pik3ip1胞外区和小鼠的igg fc构成的融合蛋白)小鼠上进行上述eae模型(图6a)。所述flag-mig和mpik3ip1-mig的合成方法参见中国专利申请201810112922.x。
[0245]
给药方式：day0开始给药，control和cko组经腹腔给予300μl pbs，治疗组分别给予300μl pbs配制的蛋白溶液，分别含200μgflag-mig、200μg mpik3ip1-mig，一周2次，期间进行临床评分，day28天处死小鼠，通过he和流式细胞技术评估脾和cns组织中t细胞的活化程度和炎症细胞因子表达。
[0246]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.pik3ip1在制备用于诊断自身免疫性疾病的试剂中的用途，优选所述pik3ip1包含选自seq id no.1、2、3、4、5、6、7和/或8的序列。2.一种用于自身免疫性疾病诊断的生物标志物，其包含基因pik3ip1，或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。3.一种用于自身免疫性疾病诊断的检测试剂，所述检测试剂包含能与基因pik3ip1或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。4.能够检测基因pik3ip1或其编码的蛋白或蛋白片段的检测试剂在制备自身免疫性疾病的诊断试剂中的用途。5.根据权利要求3所述的检测试剂或者权利要求4所述的用途，其特征在于，所述结合剂或检测试剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体；优选，所述核酸是能与pik3ip1基因杂交的核酸探针；优选，所述核酸是能扩增pik3ip1基因的引物序列；优选，所述抗体是能与蛋白pik3ip1或蛋白pik3ip1的片段相结合的抗体；优选所述抗体为单克隆抗体。6.根据权利要求5所述的检测试剂或用途，其特征在于，所述结合剂进一步结合指示分子，优选，所述指示分子是荧光物质、放射性物质和/或酶。7.pik3ip1、pik3ip1ecd或包含pik3ip1ecd的融合分子在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述pik3ip1包含选自seq id no.1、2、3、4、5、6、7和/或8的序列；所述pik3ip1ecd包含选自seq id no.9和/或10的序列；所述包含pik3ip1ecd的融合分子包含选自seq id no.9和/或10的序列；优选，所述pik3ip1由选自seq id no.1、2、3、4、5、6、7或8的序列组成；优选，所述pik3ip1ecd由选自seq id no.9或10的序列组成；优选，所述包含pik3ip1ecd的融合分子的至少一个融合伴侣选自fc、白蛋白和聚乙二醇；优选，所述包含pik3ip1ecd的融合分子的至少一个融合伴侣是fc；优选，所述包含pik3ip1ecd的融合分子的至少一个融合伴侣是iggfc；更优选所述iggfc的碱基序列由选自seq id no.15或16的序列组成；优选，所述包含pik3ip1ecd的融合分子的碱基序列由选自seq id no.11、12、13或14的序列组成。9.根据权利要求1-8任一项所述的检测试剂或用途，其特征在于：所述自身免疫性疾病选自多发性硬化(ms)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、脊椎关节炎、系统性红斑狼疮(sle)、白癜风、类风湿性关节炎(ra)、幼年特发性关节炎(jia)(例如斯蒂尔病(still’s disease)又称儿童活动期全身型幼年特发性关节炎(sjia))、银屑病、干燥综合征(ss)、肠易激综合征(ibs)、皮肌炎和过敏性哮喘。

技术总结
本发明研究发现PIK3IP1与自身免疫性疾病的存在与否，疾病进展和治疗结果关系密切。PIK3IP1在自身免疫性疾病的晚期疾病患者中表达更低，在自身免疫性疾病症状缓解后PIK3IP1的表达恢复，在接受了相应治疗药物后，患者体内的PIK3IP1表达上调。通过ROC曲线分析证明，PIK3IP1可作为自身免疫性疾病的诊断性生物标志物。此外，本发明还发现PIK3IP1能够抑制T细胞增殖、活化和分泌免疫因子，在EAE小鼠模型中给予PIK3IP1ECD融合蛋白可以改善EAE的临床评分。在此基础上，本发明提供了PIK3IP1蛋白在诊断和治疗自身免疫性疾病中的应用，包括能够结合PIK3IP1蛋白或基因的结合剂在制备自身免疫性疾病的诊断试剂中的应用，包括PIK3IP1ECD在内的蛋白质在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，以及由此获得的组合物和试剂盒产品。品。品。


技术研发人员：王智 房娟 邹兆磊 单忠艳 谢文强 郭君怡
受保护的技术使用者：中山大学附属口腔医院
技术研发日：2022.06.27
技术公布日：2023/9/22