来自古柯的芽子酮甲基转移酶EnEMT1和EnEMT2及其基因和应用

来自古柯的芽子酮甲基转移酶enemt1和enemt2及其基因和应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及来自古柯的芽子酮甲基转移酶enemt1和enemt2及其基因和应用。


背景技术：

2.托品烷生物碱(tropane alkaloids)是一类含有8-氮杂双环[3.2.1]辛烷为骨架的生物碱，主要分布于古柯科(erythroxylaceae)，茄科(solanaceae)，旋花科(convolvulaceae)，红树科(rhizophoraceae)，十字花科(brassicaceae)等植物，现已鉴定出300多种托品烷生物碱。植物源托品烷生物碱具有很好的生理活性，如：古柯科中分离得到的可卡因能阻断神经纤维之间的传导及具有术后血管收缩作用，可作为鼻、喉咙和下呼吸道等区域外科手术的局部麻醉药；茄科中分离得到的莨菪碱和东莨菪碱可阻断副交感神经或抑制中枢神经系统等，从而用于止痛、解痉等。
[0003]
托品烷生物碱因其结构具有多个手性中心，直接通过化学手段合成工艺复杂且成本高，现阶段医疗使用的托品烷生物碱多是从植物中分离；而可卡因等托品烷生物碱的生物合成途径不清楚，无法解除可卡因等托品烷生物碱体内合成的限速步骤，限制了植物中托品烷生物碱产量的提高。此外，通过植物分离托品烷生物碱受到植物生长、气候变动等各种因素影响，也限制了可卡因等托品烷生物碱的供应。现代分子生物学和合成生物学的发展，使得可卡因等药用天然产物脱离原植物，在微生物中生产成为了可能。可卡因生物合成途径的解析及生物合成基因的挖掘作为其进行代谢工程的基础，是微生物生产中最重要的基本元件。
[0004]
基于现有同位素前体标记实验等推测可卡因的生物合成路径如下：由鸟氨酸起始，经历n-甲基吡咯阳离子、4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸、甲基芽子酮等中间体；最后，甲基芽子碱在cs酶的作用下与苯甲酰coa缩合形成可卡因。但在现有技术中，没有相关甲基芽子酮合成的酶enemt1和enemt2及其编码基因的鉴定，以及芽子酮甲基转移酶(enemt1和enemt2)相关应用的报道。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术中的上述不足，本发明提供来自古柯的芽子酮甲基转移酶enemt1和enemt2及其基因和应用。
[0006]
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0007]
提供芽子酮甲基转移酶，其具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
[0008]
a)具有seq id no.4或seq id no.8所示的氨基酸残基序列的蛋白质；
[0009]
b)将seq id no.4或seq id no.8中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a)酶功能的由a)衍生的氨基酸序列；
[0010]
c)与a)或b)限定的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且具有a)酶功能的由a)衍
生的蛋白质；
[0011]
d)序列中含有a)、b)或c)氨基酸序列的衍生蛋白质。
[0012]
提供芽子酮甲基转移酶基因，其具有下述核苷酸序列之一的多核苷酸：
[0013]
a)核苷酸序列如seq id no.3或seq id no.7所示的多核苷酸；
[0014]
b)编码如seq id no.4或seq id no.8所示的氨基酸序列的多核苷酸；
[0015]
c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有80％以上的同源性且编码具有权利要求1所述芽子酮甲基转移酶功能的多核苷酸；
[0016]
d)与a)、b)或c)序列互补的多核苷酸。
[0017]
提供包含芽子酮甲基转移酶基因的重组表达载体。
[0018]
进一步地，重组表达载体为将芽子酮甲基转移酶基因插入原核或真核表达载体得到表达芽子酮甲基转移酶的重组表达载体。
[0019]
进一步地，将芽子酮甲基转移酶基因构建到pet28a载体而得。
[0020]
提供包含芽子酮甲基转移酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系。
[0021]
进一步地，转基因重组菌为细菌和真菌，细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。
[0022]
提供芽子酮甲基转移酶在体内或体外催化生成甲基芽子酮及其衍生物的应用。
[0023]
提供芽子酮甲基转移酶在体内或体外催化生产托品烷生物碱中的应用，托品烷生物碱包括但不限于可卡因。
[0024]
提供包含芽子酮甲基转移酶基因的重组表达载体在不具有甲基芽子酮及其衍生物生物合成途径的原核生物或真核生物中构建甲基芽子酮及其衍生物合成途径，或是在提升甲基芽子酮及其衍生物在具有甲基芽子酮及其衍生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。
[0025]
提供包含芽子酮甲基转移酶基因的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物中构建托品烷生物碱的生物合成途径中或是在提升托品烷生物碱在具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。
[0026]
提供包含芽子酮甲基转移酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系在催化芽子酮及其衍生物甲基化中的应用。
[0027]
本发明的有益效果为：
[0028]
本发明公开了芽子酮甲基转移酶，其氨基酸序列分别是，enemt1如seq id no.4所示，enemt2如seq id no.8所示，其编码的核苷酸分别是，enemt1如seq id no.3所示，enemt2如seq id no.7所示，将芽子酮甲基转移酶进行原核表达后能够催化芽子酮生成甲基芽子酮。芽子酮甲基转移酶的发现为天然产物的合成生物学提供了更多基础元件，并且为这类酶的理性设计提供了指导和依据，具有很好的工业化前景。
附图说明
[0029]
图1为本发明实施例提供的enemt1和enemt2催化的酶化学反应方程式；
[0030]
图2为本发明实施例提供的enemt1-pet28a的质粒图谱；
[0031]
图3为本发明实施例提供的enemt2-pet28a的质粒图谱；
[0032]
图4为本发明实施例提供的enemt1和enemt2蛋白的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
no.10)
[0053]
enemt2-af:5
’‑
tggtgccgcgcggcagccatatggcaattgatcaagtacttc-3’(seq id no.11)
[0054]
enemt2-ar:5
’‑
cggagctcgaattcggatcctcaatccatatcaactacagtt-3’(seq id no.12)
[0055]
将构建好的enemt1-pet28a和enemt2-pet28a质粒转化原核表达菌株bl21(de3)，涂布含有卡那霉素的lb固体平板，挑取单菌落培养，提取质粒进行酶切验证，筛选阳性克隆子，获得原核表达工程菌enemt1-pet28a-bl21(de3)和enemt2-pet28a-bl21(de3)。取菌液20μl接种到含50μg/l卡那霉素的20ml lb液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。再按1：100比例接种量分别接种到2l lb液体培养基中37℃，200rpm进行培养，培养至od
600
＝0.8左右时，冰浴十分钟，加入iptg至终浓度0.2mm。在16℃，200rpm条件下继续培养18h。将收获的菌液4000rpm离心，去掉上清。再把菌体用蛋白纯化buffer重悬，并在超声破碎后，用镍柱进行蛋白纯化获得enemt1和enemt2蛋白。得到的蛋白用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如图3所示。
[0056]
enemt1和enemt2催化的酶化学反应方程式如图1所示，enemt1和enemt2催化的体外酶反应的体系如下：50mm磷酸钾缓冲盐(ph 7.5)，1mm芽子酮，1mm sam，300ngμl-1
enemt1或enemt2蛋白，总体积100μl，30℃，孵育1h后，加等量乙腈终止反应。
[0057]
酶反应产物用lc-ms进行分析，液质联用仪为agilent 1290/6530system，色谱柱为ymc-triart c
18
(i.d.4.6
×
250mm)，柱温30℃，流速1ml/min，流动相洗脱程序为：90％a相(含0.1％甲酸的水)，10％b相(乙腈)，等度洗脱6min，质谱仪为电喷雾离子源(esi)，进行正离子模式扫描，扫描范围(m/z)：50-400。
[0058]
检测结果显示，enemt1和enemt2催化芽子酮生产甲基芽子酮(m/z:198.1125[m+h]
+
)，在分析条件下保留时间为3.7min如图4所示。
[0059]
本发明公开了芽子酮甲基转移酶，其氨基酸序列分别是，enemt1如seq id no.4所示，enemt2如seq id no.8所示，其编码的核苷酸分别是，enemt1如seq id no.3所示，enemt2如seq id no.7所示，将芽子酮甲基转移酶进行原核表达后能够催化芽子酮生成甲基芽子酮。芽子酮甲基转移酶的发现为天然产物的合成生物学提供了更多基础元件，并且为这类酶的理性设计提供了指导和依据，具有很好的工业化前景。
[0060]
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0061]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.芽子酮甲基转移酶，其特征在于，具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：a)具有seq id no.4或seq id no.8所示的氨基酸残基序列的蛋白质；b)将seq id no.4或seq id no.8中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a)酶功能的由a)衍生的氨基酸序列；c)与a)或b)限定的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且具有a)酶功能的由a)衍生的蛋白质；d)序列中含有a)、b)或c)氨基酸序列的衍生蛋白质。2.芽子酮甲基转移酶基因，其特征在于，具有下述核苷酸序列之一的多核苷酸：a)核苷酸序列如seq id no.3或seq id no.7所示的多核苷酸；b)编码如seq id no.4或seq id no.8所示的氨基酸序列的多核苷酸；c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有80％以上的同源性且编码具有权利要求1所述芽子酮甲基转移酶功能的多核苷酸；d)与a)、b)或c)所述的序列互补的多核苷酸。3.含有权利要求2所述芽子酮甲基转移酶基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将芽子酮甲基转移酶基因插入原核或真核表达载体得到表达芽子酮甲基转移酶的重组表达载体。5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将芽子酮甲基转移酶基因构建到pet28a载体而得。6.含有权利要求2所述芽子酮甲基转移酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系。7.根据权利要求6所述的芽子酮甲基转移酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系，其特征在于，所述转基因重组菌为细菌和真菌，所述细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。8.权利要求1所述芽子酮甲基转移酶在体内或体外催化生成甲基芽子酮及其衍生物的应用。9.权利要求1所述芽子酮甲基转移酶在体内或体外催化生产托品烷生物碱中的应用，所述的托品烷生物碱包括但不限于可卡因。10.权利要求3-5任一所述的重组表达载体在不具有甲基芽子酮及其衍生物生物合成途径的原核生物或真核生物中构建甲基芽子酮及其衍生物合成途径，或是在提升甲基芽子酮及其衍生物在具有甲基芽子酮及其衍生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。11.权利要求3-5任一所述的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物中构建托品烷生物碱的生物合成途径中或是在提升托品烷生物碱在具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。12.权利要求6所述的转基因重组菌或转基因细胞系在催化芽子酮及其衍生物甲基化中的应用。

技术总结
本发明公开了来自古柯的芽子酮甲基转移酶EnEMT1和EnEMT2及其基因和应用。EnEMT1氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；EnEMT2氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。经大肠杆菌表达后的蛋白质能够催化芽子酮生成甲基芽子酮。芽子酮甲基转移酶的发现为天然产物的合成生物学提供了更多基础元件，并且为这类酶的理性设计提供了指导和依据，具有很好的工业化前景。前景。前景。


技术研发人员：黄胜雄 杨静 王永江 黄建萍 罗剑英 颜一军
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：2022.07.13
技术公布日：2023/9/22