一种河流弧菌恒温荧光（RAA）快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法与流程

一种河流弧菌恒温荧光(raa)快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法
技术领域
1.本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及一种河流弧菌恒温荧光(raa)快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法。


背景技术：

2.河流弧菌(vibrio fluvialis)为革兰氏阴性、弧状短杆菌，单个或成双存在，菌体大小为0.5～0.8μm
×
1.8～2.5μm可致水生动物如鱼类、虾蟹类和贝类等感染，引起败血症、腐皮病和脓包病等症状，对水产养殖业造成巨大经济损失。河流弧菌常见于海水养殖动物，具有较强的致病性，致死率高。
3.河流弧菌作为一种细菌病是当前水产养殖主要病害之一，但是当前该病主要采用，普通pcr和荧光pcr开展检测，虽然特异性强、灵敏度高，但是仪器昂贵、检测耗时长、需要专门的实验场地、检测人员要求高的问题。在海关快速通关的背景下，快速检测显得尤为重要，raa恒温荧光检测仅需要20min，该方法可以大大压缩检测时长，因此希望开发一种河流弧菌的raa快速检测方法，并且应用于进出口水产品、养殖场等河流弧菌的现场快速检测中。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种快速检测河流弧菌恒温荧光(raa)检测方法，适用于养殖场监控、海关、水产技术推广站等部门，对河流弧菌病原菌的检测，用于解决水产养殖中河流弧菌流行、传播、预防和控制的问题。
5.本发明首先提供了一种河流弧菌恒温荧光(raa)引物探针，优选的，所述引物和探针为针对溶血素基因(hemolysin gene)中的保守序列seq id no:4设计；
6.更优选的，所述上游引物f为seq id no:1，下游引物r为seq id no:2，探针p为seq id no:3。
7.优选的，所述的荧光探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基基数29bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团和淬灭基团之间间隔1个碱基，且探针的31位的a用四氢呋喃残基替换。
8.更优选的，所述荧光探针的荧光报告基团为fam；荧光淬灭基团为bhq1；
9.其次，本发明提供了一种对河流弧菌恒温荧光(raa)快速检测的试剂盒，所述的检测试剂盒包含所述的引物和探针和其他raa检测试剂。
10.另外，本发明提供了一种河流弧菌快速检测的方法；
11.优选的，所述方法用于非诊断目的，其包括如下步骤：
12.(1)提取待检测对象的核酸样品。
13.(2)试剂配制：
14.a.向装有干粉酶制剂的检测单元管中先加入25μl a buffer、2μl上游引物f(10μm)、2μl下游引物r(10μm)，0.6μlp探针(10um)、12.9ul的水；
15.b.再向检测单元管中加入5ul待检dna核酸；c.在检测单元管盖上加入2.5ul的b buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀6次，随后低速离心10sec。
16.(3)采用abi荧光pcr仪，对参数进行设置，荧光通道选择fam通道，淬灭基团为none，反应程序为39℃60sec；39℃30sec，40个循环。
17.(4)结果判定：
18.阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出锋时间≤15min，为有效结果；
19.阴性对照：无扩增曲线出现，或出锋时间≥20min，为有效结果；
20.有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤18min，判定为阳性；
21.无明显扩增曲线，出峰时间＞18min，判定为阴性。
22.与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
23.河流弧菌-raa检测方法操作简便、快速、灵敏度高，仅仅20min就可以出结果，检测限达10copies/μl，相对于传统的荧光pcr、普通pcr而言，大大提高了检测效率，在快速通关的背景下，可高效运用于现场河流弧菌快速筛查，有效压缩通关时长，对于进出口水产品中河流弧菌防控具有重大意义。
附图说明
24.图1本发明引物探针组合筛选结果图。1-9：引物组合1-9；n：阴性对照，p：阳性对照。
25.图2 hemolysingene保守序列筛选的组合4引物探针与toxr基因的引物探针序列的比对；4：引物组合4；10：引物组合10；p：阳性对照；n：阴性对照；
26.图3基于河流弧菌-raa检测方法的灵敏性试验结果。
27.图4基于河流弧菌-raa检测方法特异性试验结果。1-4分别表示河流弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌；n：阴性对照，p：阳性对照。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.以下实施例中所用的材料、试剂等，无特殊说明，均为常规方法。
30.以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
31.以下实施例中raa扩增基础试剂盒购自于杭州众测生物科技有限公司。
32.以下实施例中引物、探针和质粒均是委托湖州河马生物科技有限公司合成。
33.以下实施例中溶血素基因阳性质粒克隆在puc57载体中。
34.实施例1河流弧菌-raa引物和探针的设计、筛选和试剂盒的建立
35.运用dnastar软件进行同源性分析和blast序列分析，筛选出河流弧菌溶血素基因中的保守序列如下seq id no:4：
36.taaaactaaattcttatgcagcaacaacgttggcgttatgttcactctctgcgagtggcaatgtatttgccgatattcacgaccctgtaggcgcagcggtatctattttaagtcaggtttctgattcgagtcaggtcaattattataacgcgcaatattggcaggcaaacgataccgatatgccaactctggcgcaattacgtc；
37.以筛选获得的高度保守序列204bp作为检测目的的基因片段，并进行引物、探针设计筛选检测。
38.(1)引物和探针设计
39.根据hemolysin gene保守序列，上游引物和下游引物、探针序列如下：
40.f1：5
’‑
gcagcaacaacgttggcgttatgttcactc-3’41.f2:5
’‑
taaaactaaattcttatgcagcaacaacgt-3’42.f3:5
’‑
ttatgttcactctctgcgagtggcaatgta-3’43.r1：5
’‑
cgccagagttggcatatcggtatcgtttgc-3’44.r2:5
’‑
catatcggtatcgtttgcctgccaatattg-3’45.r3:5
’‑
gacgtaattgcgccagagttggcatatcgg-3’46.探针p1：5
’‑
cgatattcacgaccctgtaggcgcagcgg[fam-dt][thf][bhq-dt]ctattttaagtcaggt-c3-3’[0047]
将上述引物组合成9个引物组合，而且这9个引物组合都共用同一探针序列，引物组合见表1。
[0048]
表1：河流弧菌特异性引物序列信息
[0049]
[0050][0051]
如图1所示，在9个引物探针组合中，组合1、2、4、5在同一质粒浓度下，出峰时间和荧光值相对较高(图1)；通过对1、2、4、5组合的灵敏性检测评估，更优选为组合4，具体为：
[0052]
seq id no:1：f2：5
’‑
taaaactaaattcttatgcagcaacaacgt-3’；
[0053]
seq id no:2：r1：5
’‑
cgccagagttggcatatcggtatcgtttgc-3’；
[0054]
seq id no:3：探针p1：5
’‑
cgatattcacgaccctgtaggcgcagcgg[fam-dt][thf][bhq-dt]ctattttaagtcaggt-c3-3’。
[0055]
其中，探针以fam为荧光报告基团，bhq-1为荧光淬灭基团。
[0056]
其中，探针荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基基数29bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团和淬灭基团之间间隔1个碱基a，碱基a用四氢呋喃残基替换。
[0057]
(2)hemolysin gene保守序列筛选的组合4引物探针toxr基因的引物探针序列的比对。
[0058]
运用dnastar软件进行同源性分析和blast序列分析，根据河流弧菌的toxr基因(选择保守序列seq id no:4以外的区域)筛选出了引物和探针序列如下：
[0059]
toxr基因的引物和探针序列如下，为引物组合10:
[0060]
f4:5
’‑
ccttctgtagactcgacacctgcggcacca-3’；
[0061]
r4:5
’‑
tgagatccgggtgattgattggcgtgctga-3’；
[0062]
探针p2：5
’‑
tgattctgttggttgccgtcatactgccta[fam-dt]t[thf]g[bhq-dt]gtcattttgttta-c3-3’；
[0063]
在同一质粒浓度下，比较引物组合4、引物组合10，结果引物组合4的出峰时间和荧光值相对较高，见图2；因此优选引物组合4。
[0064]
(3)raa基础荧光反应试剂盒包括冻干粉、a buffer、b buffer、c buffer、阴性对照、阳性对照和纯化水，购自杭州众测生物科技有限公司，货号为s002zc；引物和探针，浓度均为10μm。
[0065]
实施例2raa-河流弧菌检测方法
[0066]
所述方法用于非诊断目的；
[0067]
包括如下步骤：
[0068]
(1)样品处理：取凡纳滨对虾虾肉剪碎后，添加碱性蛋白胨水，在37℃条件，震荡6小时进行初步富集培养，然后取1ml菌液在12000rpm/min离心2min，留菌泥，加500μlpbs，用
于河流弧菌检测。
[0069]
(2)核酸提取：采用abi商品化试剂盒进行核酸提取，依据说明书操作来提取基因组dna。提取的核酸作为模板。
[0070]
(3)raa反应体系的配制：见表2
[0071]
表2：raa反应体系的配制
[0072]
raa反应体系组分体积(ul)反应干粉1管abuffer25上游引物(10um)2下游引物(10um)2探针(10um)0.6水12.9dna样本5bbuffer2.5
[0073]
(4)反应程序：采用abi荧光pcr仪，对参数进行设置，荧光通道选择fam通道，淬灭基团为none，反应程序为39℃60sec；39℃30sec，40个循环。
[0074]
(5)结果判定：
[0075]
阳性：有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤18min，判定为阳性；
[0076]
无明显扩增曲线，出峰时间＞18min，判定为阴性。
[0077]
实施例3本发明所述试剂盒的灵敏度试验
[0078]
制备puc57-溶血素基因标准溶液，分别根据puc57-河流弧菌溶血素基因，质粒计算拷贝数，puc57-溶血素基因质粒拷贝数起始拷贝数均为10
10
copies/μl,对两种质粒进行稀释，分别取104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、5copies/μl浓度的标准品作模板；
[0079]
(2)用puc57-溶血素基因的104copies/μl、、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、5copies/μl标准品作为模板进行扩增，按试剂盒的反应体系配置试剂和设置反应程序。
[0080]
(3)检测结果如图3所示，本试剂盒的最低检测限为101copies/μl(图3)。
[0081]
实施例4本发明所述试剂盒的特异性试验
[0082]
为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实施例2中的检测方法，分别对常见病副溶血性弧菌(vp)、创伤弧菌、霍乱弧菌的阳性样本进行检测，分析试剂盒对水产养殖中其他常见细菌病的检测情况。
[0083]
检测结果表：仅河流弧菌阳性样品出现正常扩增，对其他副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的阳性样品均未出现扩增(图4)。上述结果说明了，本发明能特异扩增河流弧菌的溶血素基因，而不与其它细菌病核酸发生交叉反应，本发明的试剂盒特异性好。
[0084]
实施例5本发明raa-河流弧菌快速检测试剂盒在临床样品中的应用。
[0085]
利用本发明中实施例3的raa-河流弧菌检测方法对送检的南美白对虾产品45份开展检测。
[0086]
检测结果显示raa-河流弧菌检测方法检测出阳性样品2份，阴性样品43份，与荧光
定量pcr方法结果一致，两种方法的阳性符合率为100％。
[0087]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种河流弧菌恒温荧光(raa)快速检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包含了引物上游f、下游引物r和探针p组成，所述引物和探针为针对溶血素基因中的保守序列seq id no:4设计。2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述上游引物f为seq id no:1，下游引物r为seq id no:2，探针p为seq id no:3。3.如权利要求1或2所述探针，其特征在于，所述的荧光探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5
，
端碱基基数29bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3
，
端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团和淬灭基团之间间隔1个碱基，且探针的31位的a用四氢呋喃残基替换。4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为fam；荧光淬灭基团为bhq1。5.一种河流弧菌恒温荧光(raa)快速检测的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包含权利要求1-4任一项所述的引物和探针和其他raa检测试剂。6.一种河流弧菌恒温荧光(raa)快速检测的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，其包括如下步骤：(1)提取待检测对象的核酸样品。(2)试剂配制：a.向装有干粉酶制剂的检测单元管中先加入25μlabuffer、2μl上游引物f(10μm)、2μl下游引物r(10μm)，0.6μlp探针(10um)、12.9μl的水；b.再向检测单元管中加入5ul待检dna核酸；c.在检测单元管盖上加入2.5μl的b buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀6次，随后低速离心10sec。(3)采用abi荧光pcr仪，对参数进行设置，荧光通道选择fam通道，淬灭基团为none，反应程序为39℃60sec；39℃30sec，40个循环。(4)结果判定：阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出锋时间≤15min，为有效结果；阴性对照：无扩增曲线出现，或出锋时间≥20min，为有效结果；有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤18min，判定为阳性；无明显扩增曲线，出峰时间＞18min，判定为阴性。

技术总结
本发明公开了一种河流弧菌恒温荧光(RAA)快速检测的引物探针组合和试剂盒，可实现39℃条件下20min内完成河流弧菌的检测；与常见的创伤弧菌、拟态弧菌、副溶血性弧菌均无交叉反应，特异性达100％。检测方法快速、可靠、操作简便，弥补了传统检测技术的不足，可用于现场快速检测。本发明提供的基于RAA荧光法快速检测河流弧菌的方法，灵敏度高，达10copies/uL。达10copies/uL。达10copies/uL。


技术研发人员：李家侨 刘骁 谢艳辉 张娜 唐媛媛 尹伟力 杨金金 刘荭 斯泽恩 郑舒尹 梁君妮 杨柏
受保护的技术使用者：湛江海关技术中心
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/9/22