一种诱导性释放CBLB502的CAR-NK细胞及其制备方法与应用与流程

一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及嵌合抗原受体修饰免疫细胞疗法技术领域，具体涉及一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞及其制备方法与应用。


背景技术：

2.随着研究的进展，免疫疗法与手术、化疗及放疗一样，被认为是肿瘤治疗的重要支柱，为癌症患者带来新的希望。其中，car-t细胞疗法(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy)是一种精准靶向免疫疗法，该疗法是通过基因工程手段对t细胞进行修饰，在体外进行大量的扩增，表达具有识别肿瘤细胞抗原能力的特异性受体，然后应用到患者体内来靶向杀伤肿瘤细胞。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)主要由细胞外抗原识别域、t细胞受体跨膜和铰链域及细胞内信号转导域三部分组成。car-t细胞疗法的基本原理是通过其受体特异性识别肿瘤相关抗原(taa)，并通过信号转导和铰链域将信号传导至胞内从而激活t细胞，引起特异性免疫应答来杀伤肿瘤细胞。由于car-t细胞抗原识别基于其表达的单链可变片段与肿瘤表面抗原的结合，因此不受组织相容性复合体(mhc)限制，也不依赖于抗原的加工与呈递。
3.然而，car-t对于实体肿瘤的治疗效果却比较有限，原因在于缺乏理想的靶向肿瘤抗原；car-t细胞在体内的持久性和增殖受限；治疗后无法避免的复发及肿瘤特殊的免疫抑制微环境的影响。许多临床前研究正在探索克服上述挑战和提高car-t细胞在实体恶性肿瘤中的疗效的策略。采用其他免疫细胞代替t细胞作为car载体，也是克服car-t细胞治疗出现的抗原阴性肿瘤细胞免疫逃逸现象的策略。其中，自然杀伤细胞(nk细胞)作为天然免疫细胞，其杀伤肿瘤细胞活性不依赖于抗原识别，而是可通过调节激活和抑制受体的平衡或者释放颗粒酶等毒性颗粒才发挥抗瘤活性。因此，nk细胞有利于杀伤靶抗原阴性表达的肿瘤细胞。另外，nk细胞作为car载体的另一个好处是来源丰富，容易获取。如nk92细胞系是目前唯一一株被临床批准可在体内应用的细胞系。针对不同靶点的嵌合抗原受体修饰的nk92细胞也被证实具有有效杀伤肿瘤细胞活性。car-nk是将嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)表达于nk细胞中，使之能通过car依赖的机制杀伤表达肿瘤相关抗原的靶细胞。与car-t细胞相比，car-nk细胞作用更广，不良反应更小，因此nk细胞是car的更优负载细胞。
4.发明人尝试将car整合于nk细胞中，用于结直肠癌的治疗，但是，由于适当的car-nk细胞疗法的结直肠癌治疗靶点尚未明确，并且现有技术的嵌合抗原受体的nk-92细胞(car-nk细胞)仍然存在免疫细胞无法充分地激活的问题。亟需对结直肠癌的car-nk细胞疗法的治疗靶点进行进一步研究，以及找到一种能够有效充分激活nk细胞的活性的方法。


技术实现要素：

5.本发明意在提供一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，以解决现有技术的car-nk细胞针对结直肠癌等实体瘤的治疗效果有限的技术问题。
6.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其包括细胞膜上整合有car133嵌合抗原受体的能够分泌cblb502蛋白的自然杀伤细胞。
8.本方案还提供了一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
9.本方案的原理及优点是：
10.临床上使用的car-t/nk细胞(嵌合抗原受体胸腺淋巴细胞，或者嵌合抗原受体自然杀伤细胞)仅仅在血液系统恶性肿瘤患者的治疗中获得了显著的治疗疗效，对于实体肿瘤的治疗效果有限，其原因包括缺乏理想的靶向肿瘤抗原，car-t/nk细胞在体内的持久性和增殖受限，以及肿瘤特殊的免疫抑制微环境的影响等。本方案为克服上述car-t/nk细胞对于实体肿瘤治疗的缺陷，将免疫激动剂cblb502与car133-nk92细胞共表达，成功构建诱导性释放cblb502的car-nk细胞(本技术方案具体为：car133-i502-nk92细胞)，在car133-nk92细胞杀伤抗原阳性肿瘤细胞的同时释放cblb502。cblb502可以诱导活化nk细胞，促进nk细胞增殖，还可以诱导内源性免疫细胞(非car133-nk92细胞)杀伤抗原阴性肿瘤细胞，从而增强car-nk92细胞免疫疗法在实体瘤中的应用疗效。发明人进行了car133-i502-nk92细胞杀瘤活性分析：采用与肿瘤细胞共培养的方法，在体外元整car133-i502-nk92对于肿瘤细胞的杀伤活性；利用皮下注射cd133阳性肿瘤细胞的方法建立小鼠肿瘤模型，在体内验证car133-i502-nk92细胞的杀瘤活性。实验证明，无论是体内还是体外，相比于car133-nk92细胞与nk92细胞，car133-i502-nk92细胞对cd133阳性肿瘤细胞都具有更强的杀伤能力。因此，添加诱导性释放免疫激动剂cblb502的表达框，能够显著增强car133-nk92细胞的增殖与活化，也能够显著增强car133-nk92细胞在体内外对于肿瘤细胞的杀伤活性。
11.除此之外，本技术方案使用cd133蛋白作为结直肠癌治疗靶点，可以有效靶向结直肠癌细胞，而对实验动物的其他组织(例如胃组织)没有破坏作用。发明人利用免疫组化，分析结直肠癌患者的癌组织中cd133蛋白表达，同时也对cd133蛋白在人体正常组织中的表达情况进行分析。在结直肠癌患者中，相比较癌旁组织，所有结直肠癌样本中表现为cd133阳性表达。在健康人中，大多数组织均呈现cd133阴性表达。相比他组织，胃组织中cd133蛋白表达为阳性，提示利用cd133蛋白为靶点治疗结直肠癌时，可能会存在对胃组织的靶向-非瘤的毒副反应。但是，使用car133-i502-nk92细胞处理结直肠癌模型动物时，car133-i502-nk92细胞治疗并未导致小鼠体内重要内脏器官的病理改变，尤其胃组织呈现完整性，进一步说明了使用本技术方案的car133-i502-nk92细胞对结直肠癌进行治疗具有组织特异性，不存在对胃组织的靶向-非瘤的毒副反应。
12.综上，本方案有望为设计免疫激活型car133-nk92细胞治疗方案提供新的策略，为复发难治性结直肠癌治疗的临床研究提供一种增效型免疫细胞潜力药物，也为后续临床研究提供必要的研究基础。
13.进一步，car133嵌合抗原受体的序列包括如seq id no.3所示的cd133抗体的scfv序列。cd133抗体的scfv序列可保证对结直肠癌的特异性抗原的识别，实现对癌症的靶向治疗。
14.进一步，car133嵌合抗原受体的序列还包括如seq id no.4所示的cd8α铰链序列、如seq id no.5所示的跨膜结构域序列、如seq id no.6所示的共刺激分子4-1bb序列和如
seq id no.7所示的cd3ζ信号域序列。
15.本技术方案优化了car的载体结构，为了构建表达识别cd133抗原受体的car，采用了第二代car133结构，主要包括抗cd133抗体的scfv序列、cd8α铰链(cd8 hinge)、跨膜结构域(cd8α-tm)、共刺激分子4-1bb和cdζ信号域。
16.进一步，所述cblb502蛋白的表达受序列如seq id no.11所示的启动子控制。
17.在识别cd133抗原受体的基础上，为了实现抗原依赖性诱导表达cblb502，采用了第四代car研究中的成熟nfat/il-2启动子表达框，将cblb502序列与nfat/il-2启动子表达框连接。本方案在表达识别cd133抗原受体的car基础上，添加诱导性释放免疫激动剂cblb502的表达框。通过流式细胞术分析，发现该表达框的加入并未影响慢病毒对nk92细胞的感染效率。
18.发明人进行了car133-i502-nk92细胞抗原依赖性诱导表达释放cblb502的分析，将cd133阳性结直肠癌细胞系sw620与cd133阴性结直肠癌细胞系sw480经过丝裂霉素c预处理后(目的是抑制肿瘤细胞的分裂，使其作为饲养层细胞存在)，与car133-i502-nk92细胞和car133-nk92细胞共培养，收集上清并通过elisa分析上清中cblb502释放水平。在与cd133阳性的结直肠癌细胞共培养过程中，car133-i502-nk92细胞的上清中都检测到cblb502，并且随着培养时间的延长，cblb502在上清中的浓度也显著增高，证实了car133-i502-nk92细胞具有抗原依赖性的释放cblb502的功能。
19.进一步，一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其由如下方法制备而成：
20.s1基因合成：合成序列如seq id no.1所示的car133嵌合抗原受体基因；合成序列如seq id no.2所示的含有启动子的cblb502基因；
21.s2表达载体构建：将car133嵌合抗原受体基因和含有启动子的cblb502基因整合到空载慢病毒表达载体上，获得表达载体；
22.s3慢病毒包装：将表达载体包装于病毒外壳中，获得慢病毒；
23.s4感染：使用慢病毒感染自然杀伤细胞，获得诱导性释放cblb502的car-nk细胞。
24.在本技术方案中，将seq id no.1所示的car133嵌合抗原受体基因和序列如seq id no.2所示的含有启动子的cblb502基因整合到空表达载体中，在将表达载体包装成慢病毒，使用慢病毒感染nk92细胞，获得诱导性释放cblb502的car-nk细胞(本技术方案具体为：car133-i502-nk92细胞)。
25.进一步，在s4中所述自然杀伤细胞为nk92细胞。
26.nk细胞作为car载体的另一个好处是来源丰富，容易获取。如nk92细胞系是目前唯一一株被临床批准可在体内应用的细胞系。针对不同靶点的嵌合抗原受体修饰的nk92细胞也被证实具有有效杀伤肿瘤细胞活性。
27.进一步，所述cblb502蛋白的c端带有寡聚组氨酸标签。为便于cblb502蛋白在体内外释放水平的检测，添加了oligo-his标签。
28.进一步，所述肿瘤为结直肠癌。
29.本技术方案的诱导性释放cblb502的car-nk细胞可选择性结合并杀伤cd133阳性的结直肠癌细胞。同时诱导cblb502的释放，能够显著增强car133-nk92细胞的增殖与活化，也能够显著增强car133-nk92细胞在体内外对于肿瘤细胞的杀伤活性。另外，释放cblb502，诱导内源性免疫细胞(非car-nk92细胞)杀伤抗原阴性肿瘤细胞，从而增强car-nk92细胞免
疫疗法在实体瘤中的应用疗效。本方案提供了一种新型的免疫激活型car133-nk92细胞治疗方案，为复发难治性结直肠癌治疗的临床研究提供一种增效型免疫细胞潜力药物，也为后续临床研究提供必要的研究基础。
30.进一步，所述药物为t细胞和诱导性释放cblb502的car-nk细胞形成的组合。在使用本方案的car-nk细胞治疗结直肠时，同时施加t细胞，可以显著控制cd133阳性与阴性混合型肿瘤生长。cblb502对t细胞具有激活作用，cd133阴性肿瘤细胞的清除更多的依赖于t细胞。
附图说明
31.图1为本发明实施例1的免疫组化分析癌组织及人体正常组织cd133蛋白表达情况的实验结果图像。
32.图2为本发明实施例2的表达载体结构以及产物示意图。
33.图3为本发明实施例3的car133-i502-nk92细胞制备及感染效率检测结果。
34.图4为本发明实施例4的car133-i502-nk92细胞释放cblb502分析的实验结果。
35.图5为本发明实施例5的car133-i502-nk92细胞在体外的增殖及激活能力分析的实验结果。
36.图6为本发明实施例6的car133-i502-nk92细胞对肿瘤细胞的杀伤活性分析的实验结果。
37.图7为本发明实施例7的car133-i502-nk92细胞的体内毒副反应分析的实验结果。
38.图8为本发明实施例8的car133-i502-nk92细胞在cd133阳性结直肠癌小鼠模型中的杀瘤活性分析的实验结果。
39.图9为本发明实施例9的car133-i502-nk92细胞释放cblb502对t细胞激活效应分析的实验结果。
40.图10为本发明实施例10的car133-i502-nk92细胞在cd133阳性/阴性混合型结直肠癌模型中的杀瘤活性分析的实验结果。
41.图11为本发明实施例11的car133-i502-nk92细胞在体内对t细胞动员分析的实验结果。
具体实施方式
42.实施例1：免疫组化分析癌组织及人体正常组织cd133蛋白表达情况
43.采用免疫组化，对76例患者的结直肠癌组织和正常人体组织芯片，分析cd133蛋白表达。结果显示，相比较癌旁组织，所有结直肠癌样本中表现为cd133阳性表达。具体操作步骤为:
44.脱蜡：预先包埋组织并切片约为4μm，将载玻片整齐地置于玻片架，放入60℃烤箱2-4h，取出后依次浸泡并通过二甲苯、无水乙醇、95％酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精和蒸馏水5-10min。抗原修复：预先配置抗原修复液并倒入高压锅中，将前一步处理完成的载玻片置于抗原修复液中，高压锅加热后冒热气并开始计时2min后停止加热。将载玻片静置3-5h至冷却至室温。将玻片架浸泡于pbs中5min，并重复3次。内源性过氧化物阻断：取出载玻片并放置在湿盒，加3％过氧化氢孵育覆盖组织，室温15min后，pbs进行清洗5min，并重
复3次。封闭：尽量去除组织表面的pbs液体，使用组化笔将组织画好，在室温非特异性封闭孵育30min，注意观察防止组织干燥。一抗孵育：将封闭血清轻轻甩去，无需pbs浸泡清洗，配置cd133蛋白浓度(1:100稀释)并滴加在组织上，使组织完全浸湿，将载玻片摆放在湿盒中并放置在普通冰箱4℃孵育过夜。二抗孵育：将湿盒取出放置于室温1-2h以使载玻片复温，滴加pbs于组织上使其浸泡清洗5min，并重复3次，将pbs废液尽量去除干净后，加入二抗并确保覆盖全部组织，室温孵育30-60min，避光。显色：滴加pbs于组织上，浸泡清洗5min，并重复3次后，去除残留的pbs废液并加入dab溶液，显微镜下密切观察，适时停止染色。复染：滴加pbs于组织并浸泡，清洗3次，去除残留废液后滴加苏木素，持续1min，后将载玻片通过盐酸酒精进行分化，再次滴加pbs浸泡5min，重复3次。脱水：将载玻片依次反向浸泡于新的步骤(1)中所涉及液体。封片：滴加中性树脂，盖玻片覆盖后晾干。
45.结果显示(图1中a和b)，相比较癌旁组织，所有结直肠癌样本中表现为cd133阳性表达。cd133蛋白免疫染色主要分布在细胞膜和腺样结构的腔内，根据同型匹配的阴性对照单抗的染色判断，该染色具有cd133蛋白特异性。以cd133表达的中位值来定义高低表达水平后，发现cd133高表达患者占43.4％(33/76)，而cd133低表达患者占56.6％(43/76)。分析cd133蛋白在人正常组织芯片中表达情况(图1中c)，在25例正常组织中，大多数组织均呈现cd133阴性表达，如甲状腺、舌、十二指肠、食管、空肠、回肠、膀胱、延髓、皮肤和肺组织等。然而相比其他组织，胃组织中cd133蛋白表达为阳性。提示利用cd133蛋白为靶点治疗结直肠癌时，可能会存在对胃组织的靶向-非瘤的毒副反应。
46.实施例2：cra133的载体优化
47.为了构建表达识别cd133抗原受体的car，采用了第二代car133结构，主要包括抗cd133抗体的scfv序列、cd8α铰链(cd8 hinge)、跨膜结构域(cd8α-tm)、共刺激分子4-1bb和cdζ信号域(图2中a)。在识别cd133抗原受体的基础上，为了实现抗原依赖性诱导表达cblb502，沿用第四代car(truck)在nfat-il2最小启动子的控制下释放cblb502(图2中b)。人工合成含有nfat-il-2启动子的cblb502开放阅读框序列，再将合成的nfat-il-2-cblb502基因克隆到pwpxl-ef1-car133慢病毒表达载体，获得pwpxl-ef1-i502-car133慢病毒重组质粒(图2中c)。
48.更具体地，将car133整合到pwpxl空载(购自addgene，hg-vma0376)上形成pwpxl-ef1-car133慢病毒表达载体。具体是先委托生物技术公司全基因合成car133结构的核苷酸序列(由上海和元生物科技公司合成)，其5’端含有mlui酶切位点，3’端含有ecori酶切位点。将前述合成基因克隆在pgsi质粒中(购自北京天一辉远生物科技有限公司，该质粒为分子克隆常用质粒，可从多家供应商获取，并且该质粒作为现有技术已经大量应用于专利技术方案中，例如cn103468830b)，命名为pgsi-car133。将pwpxl质粒及pgsi-car133质粒用mlui/ecori双酶切，胶回收酶切片段后，用t4dna连接酶连接形成。car133结构的基因序列主要包括cd133抗体的scfv序列(为了提高cd133抗体的表达量，我们使用的序列是根据人体密码子偏好进行改造后的序列)、cd8α铰链(cd8 hinge)、跨膜结构域(cd8α-tm)、共刺激分子4-1bb和cd3ζ信号域。接下来，再将合成的nfat-il-2-cblb502基因克隆到pwpxl-ef1-car133慢病毒表达载体(为了提高cblb502蛋白的表达量，我们使用序列是根据人体密码子偏好进行改造后的序列)，获得pwpxl-ef1-i502-car133慢病毒重组质粒。合成的nfat-il-2-cblb502序列5’端含有ecori酶切位点，3’端含有ndei酶切位点，将nfat-il-2-cblb502基
因克隆在pgsi质粒中，命名为pgsi-nfat-il-2-cblb502。将pwpxl-car133质粒及pgsi-nfat-il-2-cblb502质粒用ecori/ndei双酶切，胶回收酶切片段后，用t4 dna连接酶连接形成。nfat-il-2-cblb502结构包括6
×
nfat、il-2最小启动子和cblb502。
49.car133融合基因序列(seq id no.1，5
’→3’
)：
50.ggccccggcggccgggcccggcactgctccctgcccgtgtccagcaaccacgtgtgcatctccagaggcgagggccaccacatcctgcagtgccagctgaagtgcaagttgtacgtgctggtgcccgccgagcccggctcctcccccaagccctggatctaccggacctccaacctggcctccggcgtgcccgcccggttcagcggcagcggctccggcacctcctactccctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtaccacagctacccccccaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaagtcctccggcggcggcggctccggcggcggcggcggcggctcctccagatcctccctggaggtgaagctggtggagtccggccccgagctgaagaagcccggcgagaccgtgaagatctcctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactactccatgcactgggtgaaccaggcccccggcaagggcttgaagtggatgggctggatcaacaccgagaccggcgagccctcctacgccgacgacttcaagggccggttcgccttctccttggagacctccgccagcaccgcctacttgcagatcaacaacctgaagaacgaggacaccgccacctacttctgcgccaccgactacggcgactacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtcctccgccaagaccacccccccctccgtgaccagcggccaggccggccagcaccaccaccaccaccacggcgcctacccctacgacgtgcccgactacgcctcctagaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcacagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
51.nfat-il-2-cblb502核苷酸序列(seq id no.2，5
’→3’
)：
52.ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgcattttgacacccccataatatttttccagaattaacagtataaattgcatctcgcccaggtgatcaacaccaacagcctgtccctgttgacccagaacaacctgaacaagtcccagtcctccctgagctccgccatcgagcggctgtcctccggcctgcggatcaacagcgccaacgacgacgccgccggccaggccatcgccaaccggttcacctccaacatcaacggcctgacccaggcctcccggaacgccaacgacggcatctccatcgcccagaccaccgagggcgccctgaacgagatcaacaacaacctgcagcgggtgcgggagttgtccgtgcaggccaccaacggcaccaactccgactccgacctgaactccatccaggacgagatccagcagcggctggaggagatcgaccgggtgtccaaccagacccagttcaacggcgtgaaggtgctgtcccaggacaaccagatgaagatccaggtgggcgccaacgacggcgagaccatcaccatcgacctgcagaagatcgacgtgaagagcctgggcctggacggcttcaacgtgaacttgatcaacgaggacgccgccgccgccaagaagagcaccgccaaccccctggcctccatcgactccgccttgtccaaggtggacgccgtgcggtcctccctgggcgccatccagaaccggttcgactccgccatcaccaacctgggcaacaccgtgaccaacctgaactccgcccggagccggatcgaggacgccgactacgccaccgaggtgtccaacatgtccaa
ggcccagatcctgcagcaggccggcacctccgtgctggcccaggccaaccaggtgccccagaacgtgctgtccttgctgcggtaa。
53.cd133抗体的scfv基因序列(seq id no.3，5
’→3’
，抗cd133单链抗体的genbank登录号为hw350341.1)：
54.ggccccggcggccgggcccggcactgctccctgcccgtgtccagcaaccacgtgtgcatctccagaggcgagggccaccacatcctgcagtgccagctgaagtgcaagttgtacgtgctggtgcccgccgagcccggctcctcccccaagccctggatctaccggacctccaacctggcctccggcgtgcccgcccggttcagcggcagcggctccggcacctcctactccctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtaccacagctacccccccaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaagtcctccggcggcggcggctccggcggcggcggcggcggctcctccagatcctccctggaggtgaagctggtggagtccggccccgagctgaagaagcccggcgagaccgtgaagatctcctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactactccatgcactgggtgaaccaggcccccggcaagggcttgaagtggatgggctggatcaacaccgagaccggcgagccctcctacgccgacgacttcaagggccggttcgccttctccttggagacctccgccagcaccgcctacttgcagatcaacaacctgaagaacgaggacaccgccacctacttctgcgccaccgactacggcgactacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtcctccgccaagaccacccccccctccgtgaccagcggccaggccggccagcaccaccaccaccaccacggcgcctacccctacgacgtgcccgactacgcctcctag。
55.cd8α铰链基因序列(seq id no.4，5
’→3’
)：
56.accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcacagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat。
57.cd8atm跨膜结构域基因序列(seq id no.5，5
’→3’
)：
58.atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc。
59.共刺激分子4-1bb(seq id no.6，5
’→3’
)：
60.aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg。
61.cd3ζ信号域基因序列(seq id no.7，5
’→3’
)：
62.agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
63.nfat基因序列(seq id no.8，5
’→3’
)：
64.ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg。
65.il-2最小启动子基因序列(seq id no.9，5
’→3’
)：
66.cattttgacacccccataatatttttccagaattaacagtataaattgcatctc。
67.cblb502的基因序列(seq id no.10，5
’→3’
)：
68.gcccaggtgatcaacaccaacagcctgtccctgttgacccagaacaacctgaacaagtcccagtcctccctgagctccgccatcgagcggctgtcctccggcctgcggatcaacagcgccaacgacgacgccgccggccaggccatcgccaaccggttcacctccaacatcaacggcctgacccaggcctcccggaacgccaacgacggcatctccatcg
cccagaccaccgagggcgccctgaacgagatcaacaacaacctgcagcgggtgcgggagttgtccgtgcaggccaccaacggcaccaactccgactccgacctgaactccatccaggacgagatccagcagcggctggaggagatcgaccgggtgtccaaccagacccagttcaacggcgtgaaggtgctgtcccaggacaaccagatgaagatccaggtgggcgccaacgacggcgagaccatcaccatcgacctgcagaagatcgacgtgaagagcctgggcctggacggcttcaacgtgaacttgatcaacgaggacgccgccgccgccaagaagagcaccgccaaccccctggcctccatcgactccgccttgtccaaggtggacgccgtgcggtcctccctgggcgccatccagaaccggttcgactccgccatcaccaacctgggcaacaccgtgaccaacctgaactccgcccggagccggatcgaggacgccgactacgccaccgaggtgtccaacatgtccaaggcccagatcctgcagcaggccggcacctccgtgctggcccaggccaaccaggtgccccagaacgtgctgtccttgctgcggtaa。
69.nfat-il-2启动子表达框基因序列(seq id no.11，5
’→3’
)：
70.ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgcattttgacacccccataatatttttccagaattaacagtataaattgcatctc。
71.实施例3：car133-i502-nk92细胞制备及感染效率检测
72.3.1慢病毒包装与浓缩
73.取传代数10代以内的293t细胞于37℃，5％co2细胞培养箱培养；观察细胞生长融合度达80％-90％左右，将细胞消化后计数；计数后取6
×
106细胞量接种于新的的75cm2细胞培养瓶中培养；密切关注细胞生长状态，约24h后细胞生长融合达75％左右，更换新鲜培养基，等待病毒感染；将包装慢病毒所需的质粒(目的质粒、pmd2.g、pspax2)以4：1：2的比例转染至293t细胞；转染后48h及72h时，观察细胞状态并收集细胞上清，并2000g离心10min，4℃；将所得到的上清液通过滤器过滤后待用；上清：5
×
peg6000-nacl＝4：1，按照以上比例将液体混匀，静置2h，4℃；静置后10000g离心25min，4℃，弃去上清废液；加入1ml消毒的pbs吹打沉淀并充分溶解；将制备的慢病毒进行分装标记，-80℃保存，待用。
74.3.2病毒滴度的测定
75.待293t细胞生长状态良好，提前4h收集细胞并计数。按照每孔5
×
104的细胞数量接种于96孔板中的10孔并做好标记。取10个新的消毒过的ep管，按顺序做好标记，并加入90μl/孔。取10μl慢病毒液体并加入1号ep管，混匀(稀释10倍)。再取10μl混匀液加入2号ep管，直至3-10号ep管。将预先准备的96孔板中吸去90μl培养基，并吸取90μl 1-10号ep管中的液体，加入原标记好的1-10号孔，培养并观察72h。待72h后观察细胞，计数并计算病毒滴度。
76.3.3病毒感染nk92细胞
77.nk92细胞培养并密切观察。在细胞培养基中加入慢病毒，polybrene感染试剂2μl rhil-2(终浓度250u/ml)后，于培养箱感染12h。12h后收集细胞，1200g，离心10min，弃去培养基上清。加入1ml细胞培养液，吹打混匀，按照3倍扩增比例接种于新的无菌培养瓶中，并补齐培养液。将细胞于细胞培养箱中培养72h，即获得慢病毒感染的目的细胞(car133-nk92细胞和car133-i502-nk92细胞)。
78.3.4慢病毒表达载体对nk92细胞的感染效率检测
79.细胞样品准备：收集经过病毒感染72h的nk92细胞，离心去除培养基废液，加入pbs重悬，1200rpm，5min离心2次后，加入100μl pbs重悬细胞。一抗的孵育：加入1μl荧光标记的
rpim1640完全培养基。待细胞贴壁后，加入终浓度为10μg/ml丝裂霉素c预处理2h。然后，弃掉上清，pbs清洗5遍后，在培养孔中加入1
×
106个/孔car133-i502-nk92细胞或者car133-nk92细胞，每孔含有500μlα-mem完全培养基，共培养3d、5d及7d后收集效应细胞。通过细胞计数分析细胞的增殖水平，同时利用流式细胞术分析效应细胞增殖标志蛋白ki67、细胞活化标志cd69蛋白、抑制性受体nkg2a和激活受体nkp46、nkp44和nkg2d的表达水平。另外，为了研究car133-i502-nk92细胞是否存在因过度激活而导致细胞耗竭的现象。我们对nk细胞耗竭标志蛋白，包括程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(lag-3)和t细胞免疫球蛋白结构域和含黏蛋白结构域蛋白3(tim-3)的表达水平进行分析。实验结果显示：
88.(1)与cd133阳性细胞共培养3d、5d、7d以后，car133-i502-nk92细胞相比于car133-nk92细胞以及nk92细胞的增殖水平显著增强(图5中a)，而与cd133阴性细胞共培养以后，三组细胞的增殖水平在各个时间点均无显著差异(图5中b)。
89.(2)共培养3d时，流式结果显示，与sw620细胞共培养的car133-i502-nk92细胞ki67蛋白表达水平显著高于car133-nk92细胞和nk92细胞(图5中c)；而与sw480细胞共培养的三组细胞ki67蛋白表达无差异(图5中d)。提示，在cd133阳性抗原刺激下car133-i502-nk92细胞的增殖水平显著增强。
90.(3)cd69蛋白作为细胞的共刺激信号具有诱导细胞活化和增殖的功能。因此，cd69蛋白作为细胞活化的重要标志之一。sw620细胞共培养3d，流式细胞术分析细胞活化标志cd69蛋白的表达。结果显示，nk92细胞cd69蛋白表达为5.85％，car133-nk92细胞cd69蛋白表达为8.17％，car133-i502-nk92细胞cd69蛋白表达为18.81％。即，与nk92细胞和car133-nk92细胞相比，car133-i502-nk92细胞cd69蛋白的表达水平显著升高(p《0.001)，差异有统计学意义(图5中e，f)。然而与经过丝裂霉素c处理过的靶细胞sw480共培养的car133-i502-nk92细胞、car133-nk92细胞和nk92细胞激活蛋白cd69表达并无明显差异(图5中g，h)。说明car133-i502-nk92细胞接触cd133阳性肿瘤抗原具有增强的活化能力。
91.(4)因nk细胞的活化主要通过调控抑制性和激活受体之间的平衡来实现，即，如果激活受体表达占主导地位，那么nk细胞的功能会被激活；而如果抑制受体表达占主导地位，那么nk细胞的功能将会被抑制。结果显示，与car133-nk92细胞相比，与sw620细胞共培养的car133-i502-nk92抑制性受体nkg2a的表达水平显著降低，而激活受体nkp46、nkp44和nkg2d的表达水平增加(图5中i)。同样，未发现与sw480细胞共培养的car133-nk92细胞和car133-i502-nk92细胞之间激活和抑制受体表达的差异(图5中j)。
92.(5)为了研究car133-i502-nk92细胞是否存在因过度激活而导致细胞耗竭的现象。对nk细胞耗竭标志蛋白，包括程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(lag-3)和t细胞免疫球蛋白结构域和含黏蛋白结构域蛋白3(tim-3)的表达水平进行分析。结果显示，不管是在与sw620细胞共培养还是与sw480细胞共培养的两组细胞中，三种耗竭蛋白的表达均无统计学差异(图5中i，j)。另外，在基因水平也得到了相同的结果(图5中k，l)。以上结果说明，与car133-nk92细胞相比，car133-i502-nk92细胞具有增强的细胞激活能力，而未出现因过度激活而导致细胞耗竭的现象。
93.实施例6：car133-i502-nk92细胞对肿瘤细胞的杀伤活性分析
94.为了分析car133-i502-nk92细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，利用cd133阳性的结直
肠癌细胞系sw620和hct116及cd133阴性的结直肠癌细胞系sw480作为靶细胞，与nk92细胞、car133-i502-nk92细胞和car133-nk92细胞以10：1的效靶比共培养24h。首先通过检测效应细胞cd107a的表达水平来评估杀伤活性，其次检测上清中乳酸脱氢酶(ldh)水平来分析效应细胞杀伤活性。最后，采用实时无标记动态细胞分析技术(rtca)检测与nk92细胞、car133-nk92细胞和car133-i502-nk92细胞共培养过程中三种靶细胞的数目变化，来显示三种效应细胞对于靶细胞的杀伤活性。实验结果显示：
95.(1)与car133-nk92细胞和nk92细胞相比，car133-i502-nk92细胞与sw620和hct116细胞共培养后细胞的cd107a表达水平显著增强，差异有统计学意义(图6中a，b)。而与sw480细胞共培养的三种效应细胞cd107a表达水平无统计学差异(图6中a，b)。以上结果证实，car133-i502-nk92细胞与抗原阳性表达靶细胞共培养后产生较强的脱颗粒效应，提示car133-i502-nk92细胞具有增强的杀瘤活性。
96.(2)通常肿瘤细胞在正常生长的情况下，细胞浆内的ldh不能透过细胞膜。而当肿瘤细胞遭到效应细胞杀伤，细胞发生膜破裂现象，导致细胞浆内的ldh释放到细胞培养液中。研究证明ldh释放水平与细胞凋亡或者坏死数目成正比。在效应细胞与cd133阳性肿瘤细胞sw620细胞共培养第1d，未发现三组效应细胞对sw620细胞杀伤活性差异。而在效应细胞与sw620细胞共培养的第3d，与nk92细胞和car133-nk92细胞相比，car133-i502-nk92细胞对sw620细胞具有较高的杀伤活性，差异有统计学意义(p＜0.05)。在共培养的第5d，car133-i502-nk92细胞与car133-nk92细胞对sw620细胞杀伤活性差异性更大(p＜0.001)(图6中c)。对cd133阴性表达的细胞系sw480，在共培养的不同天数，两组效应细胞的杀伤活性未发现显著差异(图6中d)。提示，随着共培养时间的延长，car133-i502-nk92细胞对抗原阳性表达肿瘤细胞具有较强的特异性杀伤活性。
97.(3)rtca结果显示，随着共培养时间的延长，与nk92细胞、car133-i502-nk92细胞和car133-nk92细胞共培养的cd133阴性表达sw480细胞数目变化不存在统计学差异；而较与nk92细胞和car133-nk92细胞共培养的cd133阳性表达sw620和hct116细胞相比，与car133-i502-nk92细胞共培养的靶细胞数目随着共培养时间的延长而显著减少(图6中e)。以上结果表明，car133-i502-nk92细胞对cd133阳性表达肿瘤细胞系具有较强的杀瘤活性，而且存在杀伤特异性。
98.实施例7：car133-i502-nk92细胞的体内毒副反应分析
99.实施例1中发现cd133抗原除了在结直肠肿瘤样本阳性表达之外，也在人正常胃组织阳性表达。由于人和鼠的cd133抗原具有高度的同源性，因此，识别人cd133抗原的scfv片段同样具有识别小鼠cd133抗原的能力，提示检测小鼠胃组织cd133抗原表达的必要性。通过免疫组化分析小鼠正常胃组织cd133抗原表达。接着，分别于第0d、3d和5d通过尾静脉注射5
×
106nk92细胞、car133-i502-nk92细胞及car133-nk92细胞至荷瘤小鼠体内，在此期间每只小鼠隔一天注射1000uil-2。并于治疗后的15天取小鼠的正常脏器如脾、肺、心、肝、肾、大脑、小脑、胃和小肠等组织进行he染色。实验结果发现：与人正常胃组织的结果一致(参见实施例1)，cd133抗原在小鼠正常胃组织同样呈现阳性表达(图7中a)。鉴于人及小鼠正常胃组织中cd133蛋白表达为阳性，故需要验证具有car133结构的免疫细胞是否会对正常机体组织造成损伤，实验结果发现，与不含有car133结构的细胞一致，car133-nk92细胞和car133-i502-nk92细胞治疗并未导致小鼠体内重要内脏器官的病理改变，尤其胃组织呈现
完整性(图7中b)。证实了car133-i502-nk92细胞未对正常脏器造成毒性损伤，car133-i502-nk92细胞不会对cd133抗原阳性的结直肠肿瘤外的其他组织造成伤害，进一步证明了cd133可以作为car133-i502-nk92细胞治疗结直肠肿瘤的作用靶点。发明人进而分析了造成上述现象的原因，由于本技术方案采用免疫细胞治疗的方式，胃粘膜保护层可能会妨碍效应细胞向胃组织的浸润，最终导致car133-nk92细胞与car133-i502-nk92细胞中的car133结构，都未能识别胃组织细胞中的cd133蛋白，进而保证了car133-i502-nk92细胞治疗结直肠癌的特异性。因此，将car133-i502-nk92细胞作为治疗结直肠癌的药物，不但能够靶向目的组织，还能够避免对正常脏器造成毒性损伤，这是发明人在实验之前未能预料的。
100.实施例8：car133-i502-nk92细胞在cd133阳性结直肠癌小鼠模型中的杀瘤活性分析
101.利用荧光素酶慢病毒质粒构建了表达荧光素酶的sw620-luc细胞系，通过皮下输注1
×
106cd133阳性的结直肠癌细胞系sw620-luc细胞，制备裸鼠结直肠癌皮下移植瘤模型。对造模成功的小鼠随机分配为三组：car133-i502-nk92细胞组、car133-nk92细胞组和nk92细胞治疗组，以5
×
106的细胞量分别尾静脉注射至荷瘤小鼠体内，每组注射5只小鼠。因为先前已经证实nk92细胞和感染空载体的nk92细胞对靶细胞具有一致的杀瘤活性，这儿我们仅采用nk92细胞作为对照组效应细胞。以注射第一天定为d0，并于d3和d6再次注射效应细胞，共注射3次。在此期间每只小鼠隔一天注射1000u il-2。于第0d和第15d通过腹腔注射d-荧光素酶底物，用活体成像仪分析肿瘤的生长变化；并利用游标卡尺记录肿瘤体积变化；观察并记录小鼠的生存时间。为了进一步验证car133-i502-nk92细胞在小鼠体内的存活状况，于效应细胞治疗后第15d，通过眼球取血的方式收集小鼠外周血，利用流式细胞术分析外周血中cd56阳性效应细胞的数目，cd56是nk细胞的特异性标志物。另外，于效应细胞治疗后第15d，取小鼠肿瘤组织，利用免疫组化分析组织中cd56阳性细胞数目。
102.结果发现：nk92细胞治疗组小鼠肿瘤体积迅速增大，car133-nk92细胞治疗组肿瘤缓慢增长，car133-i502-nk92细胞治疗组小鼠肿瘤生长缓慢并逐渐得到控制(图8中a，b)。对三组小鼠的生存期进行统计分析，结果发现，car133-i502-nk92细胞治疗组小鼠生存期明显高于car133-nk92细胞和nk92细胞治疗组(图8中c)。以上结果说明，car133-i502-nk92细胞具有有效的控制cd133阳性结直肠癌生长的功能。car133-i502-nk92细胞治疗组小鼠外周血中cd56阳性细胞数目显著高于car133-nk92细胞和nk92细胞治疗组(图8中d)。肿瘤组织中cd56阳性细胞数目与外周血中cd56阳性细胞比率分析结果一致，我们发现，与car133-nk92细胞和nk92细胞治疗组相比，car133-i502-nk92细胞治疗组小鼠肿瘤组织中cd56阳性细胞显著增加(图8中e)。以上结果提示，car133-i502-nk92细胞在体内具有增强的增殖水平和浸润肿瘤组织能力。
103.实施例9：car133-i502-nk92细胞释放cblb502对t细胞激活效应分析
104.将效应细胞car133-nk92和car133-i502-nk92细胞与经过丝裂霉素处理过sw620细胞共培养3d(具体培养方法参见实施例4)，收集细胞上清，离心去除细胞碎片，制备成条件培养基。分离人外周血t细胞，利用car133-i502-nk92细胞和car133-nk92细胞的条件培养基进行刺激培养24h。并按照分组添加anti-tlr5用于阻断条件培养基中发挥功能的激动剂cblb502对免疫细胞表达tlr5受体的识别，并设置anti-igg抗体组作为阴性对照。将上述处理组免疫细胞置于5％co2细胞培养箱，培养24h后，离心收集细胞，利用流式细胞术分析
细胞激活蛋白cd69和增殖标志蛋白ki67的表达情况。实验结果发现：car133-nk92细胞的条件培养基刺激后，t细胞cd69阳性的细胞比例为10.54％；car133-i502-nk92细胞条件培养基刺激后，t细胞cd69阳性的细胞比例为17.88％。说明car133-i502-nk92细胞的条件培养基显著促进t细胞的激活(p《0.05差异有统计学意义)。在car133-i502-nk92细胞的条件培养基中添加抗tlr5中和抗体后，t细胞cd69阳性的细胞比例为12.07％(图9中a)；即，抗tlr5中和抗体阻断了car133-i502-nk92细胞的条件培养基对t细胞激活的功能，说明car133-i502-nk92细胞释放的cblb502具有激活t细胞能力。通过流式细胞术分析条件培养基对t细胞增殖标志ki67蛋白的表达水平。结果显示，car133-nk92细胞的条件培养基刺激后，t细胞ki67表达为5.21％；car133-i502-nk92细胞的条件培养基刺激后，t细胞ki67表达为30.82％(图9中b)。说明car133-i502-nk92细胞的条件培养基显著促进t细胞的增殖(p《0.05，差异有统计学意义)。加入抗tlr5中和抗体，阻断car133-i502-nk92细胞的条件培养基对t细胞ki67表达的促进功能，提示car133-i502-nk92细胞释放cblb502促进t细胞增殖。
105.实施例10：car133-i502-nk92细胞在cd133阳性/阴性混合型结直肠癌模型中的杀瘤活性分析
106.通过皮下输注cd133阳性sw620-luc细胞和cd133阴性sw480-luc细胞按照1：1混合型结直肠癌细胞系，制备裸鼠结直肠癌异质性皮下移植瘤模型，并按照car133-i502-nk92细胞组、car133-nk92细胞组、pre-t细胞+car133-nk92组和pre-t细胞+car133-i502-nk92组，以1
×
106的细胞量分别尾静脉注射至荷瘤小鼠体内，以注射第一天定为第0天，分别注射天数为第0天，第3天和第6天，共注射3次，在此期间每2天注射1000u il-2/只小鼠。其中pre-t细胞回输组为在输注上述效应细胞前24h，腹腔注射1
×
105t细胞悬液(研究证实给裸鼠补充人源性淋巴细胞可用于模拟含有t淋巴细胞的免疫微环境)。并分别于第0d和第15d通过腹腔注射d-荧光素酶底物，通过活体成像仪分析肿瘤的生长变化。利用游标卡尺记录肿瘤体积变化，观察并记录小鼠的生存时间。实验结果发现：四组治疗组小鼠的体重变化都比较平缓，而且未发现预先回输t细胞对小鼠体重的影响；提示car133-i502-nk92细胞、car133-nk92细胞及预先回输t细胞的两组细胞治疗方案都未对小鼠的体重产生影响(图10中a)。活体成像分析小鼠肿瘤的生长变化，结果发现，与其他组相比，pre-t细胞+car133-i502-nk92细胞治疗组显著抑制小鼠肿瘤的生长(图10中b)。对上述治疗组小鼠的生存时间进行统计分析，结果发现，pre-t细胞+car133-i502-nk92细胞治疗组小鼠的生存期显著高于其他治疗组(图10中c)。对小鼠肿瘤体积进行统计分析，也得到与图10中b一致的结果，即pre-t细胞+car133-i502-nk92细胞治疗组小鼠肿瘤体积显著减少，而其他三组小鼠肿瘤体积未得到控制(图10中d)。与car133-i502-nk92细胞相比，pre-t细胞+car133-i502-nk92细胞显著抑制cd133阳性与阴性混合型结直肠癌的生长，说明外周血t细胞的存在是car133-i502-nk92细胞抑制cd133阳性与阴性混合型肿瘤生长的关键因素。而与pre-t细胞+car133-nk92细胞相比，pre-t细胞+car133-i502-nk92细胞显著抑制cd133阳性与阴性混合型结直肠癌的生长，说明在存在t细胞的前提下，cblb502对于增强car133-nk92细胞抑制cd133阳性与阴性混合型肿瘤生长的关键作用。以上结果提示，外周血t细胞和cblb502两个因素对于提高car133-nk92细胞抑制cd133阳性与阴性混合型肿瘤生长的能力的关键性。猜测是因为car133-i502-nk92细胞在体内接触cd133阳性抗原以后，释放cblb502动员t细胞对cd133阴性肿瘤细胞的杀伤。
107.实施例11：car133-i502-nk92细胞在体内对t细胞动员分析
108.前述发现预先回输t细胞的car133-i502-nk92细胞显著控制cd133阳性与阴性混合型肿瘤生长，而由于car133-i502-nk92细胞只具有靶向杀伤cd133阳性肿瘤的能力。因此，猜测cd133阴性肿瘤细胞的清除可能更多的依赖于t细胞。我们利用免疫组化分析实施例10中四组细胞治疗组小鼠肿瘤组织中cd3+t细胞浸润情况。实验结果发现，与其他三组治疗组相比，pre-t细胞+car133-i502-nk92细胞治疗组肿瘤组织中cd3阳性t细胞数目显著增加(图11中a，b)。提示，car133-i502-nk92细胞在体内具有动员t细胞协同杀伤抗原阴性肿瘤细胞的功能。

技术特征：
1.一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其特征在于，其包括细胞膜上整合有car133嵌合抗原受体的能够分泌cblb502蛋白的自然杀伤细胞。2.根据权利要求1所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其特征在于，car133嵌合抗原受体的序列包括如seq id no.3所示的cd133抗体的scfv序列。3.根据权利要求2所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其特征在于，car133嵌合抗原受体的序列还包括如seq id no.4所示的cd8α铰链序列、如seq id no.5所示的跨膜结构域序列、如seq id no.6所示的共刺激分子4-1bb序列和如seq id no.7所示的cd3ζ信号域序列。4.根据权利要求1所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其特征在于，所述cblb502蛋白的表达受序列如seq id no.11所示的启动子控制。5.根据权利要求1所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其特征在于，其由如下方法制备而成：s1基因合成：合成序列如seq id no.1所示的car133嵌合抗原受体基因；合成序列如seq id no.2所示的含有启动子的cblb502基因；s2表达载体构建：将car133嵌合抗原受体基因和含有启动子的cblb502基因整合到空载慢病毒表达载体上，获得表达载体；s3慢病毒包装：将表达载体包装于病毒外壳中，获得慢病毒；s4感染：使用慢病毒感染自然杀伤细胞，获得诱导性释放cblb502的car-nk细胞。6.根据权利要求5所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其特征在于，在s4中所述自然杀伤细胞为nk92细胞。7.根据权利要求5所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞，其特征在于，所述cblb502蛋白的c端带有寡聚组氨酸标签。8.表达如权利要求1-7中任一项所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌。10.根据权利要求9所述的一种诱导性释放cblb502的car-nk细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述药物为t细胞和诱导性释放cblb502的car-nk细胞形成的组合。

技术总结
本发明涉及嵌合抗原受体修饰免疫细胞疗法技术领域，具体涉及一种诱导性释放CBLB502的CAR-NK细胞及其制备方法与应用。该CAR-NK细胞为细胞膜上整合有CAR133嵌合抗原受体的能够分泌CBLB502蛋白的自然杀伤细胞。本技术方案将免疫激动剂与CAR133在NK92细胞中共表达。在效应细胞杀伤抗原阳性肿瘤细胞的同时释放免疫激动剂，增强效应细胞的增殖与活化，还可以诱导内源性免疫细胞杀伤抗原阴性肿瘤细胞。本技术方案解决了现有技术的CAR-NK细胞针对结直肠癌的治疗效果有限的问题，为复发难治性结直肠癌治疗提供一种增效型免疫细胞潜力药物，也为后续临床研究提供必要的研究基础。也为后续临床研究提供必要的研究基础。也为后续临床研究提供必要的研究基础。


技术研发人员：刘昊宇 邵文陶 李伟强 龙皎月
受保护的技术使用者：重庆睿仕康生物医药有限公司
技术研发日：2022.10.31
技术公布日：2023/9/22