一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体指涉及一种具有抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞凋亡的鲟鱼鱼鳔寡肽及其应用。


背景技术：

2.肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，发病率和死亡率增长最快，对人民群众的健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。研发预防或治疗肺癌的药物或其功能产品至关重要。


技术实现要素：

3.本技术发明人经过反复研究，以鲟鱼鱼鳔为原料，利用酶解工艺和色谱制备技术制备得到具有显著抑制人肺癌细胞增殖和促进人肺癌细胞凋亡的抗肿瘤寡肽，该抗肿瘤寡肽可用于制备预防或治疗肺癌相关的药物和功能产品。
4.一方面，本发明一种具有显著抑制人肺癌细胞增殖和促进人肺癌细胞凋亡的鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽，该抗肿瘤寡肽为五肽化合物，其氨基酸序列为gln-pro-his-asp-lys(qphdk)，esi-ms测定其分子量为623.66da。
5.另一方面，本发明提供了上述鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽的制备方法，其包括以下步骤：
6.1)鲟鱼鱼鳔的预处理：将鲟鱼鱼鳔解冻，将乙酸乙酯加入到鲟鱼鱼鳔中，组织捣碎机匀浆，然后于40khz超声脱脂，干燥；
7.2)鲟鱼鱼鳔蛋白的酶解：将上述脱脂鲟鱼鱼鳔粉末加入到甘氨酸-naoh缓冲液中，溶液调温至50～60℃，调节ph值至8.6～10.6，加入碱性蛋白酶，水解4～6h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，离心，收集上清液，即鲟鱼鱼鳔酶解液。
8.3)鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽的制备：将鲟鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为1.0kda、3.5kda和5.0kda的超滤膜进行分级，收集分级组分，测定其抑制人肺癌细胞株(a549)增殖的能力，选择对人肺癌细胞株(a549)增殖抑制能力最强的组分冻干，得鲟鱼鱼鳔超滤酶解物，该超滤酶解物溶液并依次经过凝胶柱层析和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，得到具有显著抑制人肺癌细胞增殖和促进人肺癌细胞凋亡活性的鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽。
9.作为优选，所述步骤1)中的鲟鱼为西伯利亚鲟(acipenser baerii)。
10.作为优选，所述步骤1)中的鲟鱼鱼鳔与乙酸乙酯的料液比为1g:8～10ml。
11.作为优选，所述步骤2)中甘氨酸-naoh缓冲液的浓度为0.05mol/l，ph为9.6。
12.作为优选，所述步骤2)中脱脂鲟鱼鱼鳔粉末与0.05mol/l的甘氨酸-naoh缓冲液的料液比为1g:12～15ml。
13.作为优选，所述步骤2)中碱性蛋白酶的添加量为鲟鱼鱼鳔粉末重量2.0～3.0％。
14.作为优选，所述步骤3)的凝胶柱层析和rp-hplc纯化的具体过程为：
15.凝胶柱层析：将上述鲟鱼鱼鳔超滤酶解物溶解于双蒸水配成浓度为30～40mg/ml的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱层析分离，用磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，
ph 7.0)进行洗脱，流速0.8～1.2ml/min，根据220nm下的吸光值绘制色谱图，收集各色谱峰，测定各色谱峰组份对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力，选择抑制能力最强的色谱峰组分，冻干，得鲟鱼鱼鳔凝胶层析酶解物。
16.rp-hplc纯化：将上述鲟鱼鱼鳔凝胶层析酶解物用双蒸水配成50～60μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化，根据色谱峰分离制备寡肽组份，然后测定各组份对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力，得1个高活性抗肺癌寡肽gln-pro-his-asp-lys(qphdk)，esi-ms测定分子量为623.66da。
17.作为进一步优选，所述rp-hplc条件为：进样量10～15μl；色谱柱zorbax,sb c-18(4.6
×
250mm，5μm)；流动相：梯度洗脱，乙腈浓度在30min内从0匀速提高至60％；洗脱速度1.0～1.5ml/min；紫外检测波长220nm。
18.再一方面，本发明提供上述鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽在制备预防治疗肺癌的药物中的用途。
19.本发明鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽gln-pro-his-asp-lys(qphdk)可以显著地抑制人肺癌细胞株a549、ncl-h460和h1299的增殖，促进人肺癌细胞株a549、ncl-h460和h1299的凋亡，具有显著的抗肺癌功效；具有安全无毒副作用、活性强等优点，可用于制备预防或治疗肺癌相关的药物或其功能产品。
附图说明
20.图1为本发明的鲟鱼鱼鳔酶解液(sbh)和超滤组分(sbh-i～sbh-iv)在4.0mg/ml浓度下对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力。
21.图2为本发明的鲟鱼鱼鳔酶解液超滤组分(sbh-i)经羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱层析得到色谱图。
22.图3为本发明的羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20制备酶解物组份(sbh-ia～sbh-ic)在2.0mg/ml浓度下对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力。
23.图4为本发明的羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20制备酶解物(sbh-ib)经rp-hplc分离得到的色谱图。
24.图5为本发明的rp-hplc分离组分(bp1～bp11)在2.0mg/ml浓度下对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力。
25.图6为本发明的抗肺癌寡肽gln-pro-his-asp-lys(qphdk)的质谱图。
26.图7为本发明的抗肺癌寡肽gln-pro-his-asp-lys(qphdk)的结构图。
27.图8为本发明的抗肺癌寡肽qphdk在0.5-2.5mg/ml浓度下对人肺癌细胞株a549、ncl-h460和h1299增殖的抑制效果。
28.图9为本发明的抗肺癌寡肽qphdk在0.5-2.5mg/ml浓度下对人肺癌细胞株a549、ncl-h460和h1299凋亡的促进效果。
具体实施方式
29.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
30.一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽，制备工艺流程如下：鲟鱼鱼鳔
→
预处理
→
碱性蛋白酶酶解
→
酶解物
→
超滤
→
凝胶过滤层析
→
高效液相色谱制备
→
具有抗肺癌功效的抗肿瘤寡
肽
→
功能评价。
31.具体步骤为：
32.1)鲟鱼鱼鳔的预处理：将鲟鱼鱼鳔解冻，按照料液比为1g:9ml将乙酸乙酯加入到鲟鱼鱼鳔中，组织捣碎机匀浆，然后于40khz超声脱脂2.5小时，干燥。
33.2)鲟鱼鱼鳔蛋白的酶解：将上述脱脂鲟鱼鱼鳔粉末按照料液比1g:15ml加入到0.05mol/l的甘氨酸-naoh缓冲液，ph为9.6；溶液调温至55℃，调节ph值至9.5，加入鲟鱼鱼鳔粉末重量2.5％的碱性蛋白酶，水解5h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，9000rmp离心20min，收集上清液，即鲟鱼鱼鳔酶解液(sbh)。
34.3)鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽的制备：将上述鲟鱼鱼鳔酶解液(sbh)经截留分子量为1.0kda、3.5kda和5.0kda的超滤膜进行分级，收集分级组分sbh-i(mw《1.0kda)、sbh-ii(1.0《mw《3.5kda)、sbh-iii(3.5《mw《5.0kda)和sbh-iv(mw》5.0kda)，测定其对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力(见图1)，选择对增殖抑制能力最强的组分冻干，得鲟鱼鱼鳔超滤酶解物(sbh-i)，该超滤酶解物(sbh-i)依次经过凝胶柱层析和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，得到具有显著抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞凋亡功效的鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽。
35.①
凝胶柱层析：将上述鲟鱼鱼鳔超滤酶解物(sbh-i)溶于双蒸水配成浓度为35mg/ml的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱层析分离，用磷酸盐缓冲液(0.2m，ph 7.0)进行洗脱，流速1.2ml/min，根据220nm下的吸光值绘制凝胶层析色谱图(见图2)，收集各色谱峰(sbh-ia、sbh-ib和sbh-ic)，测定各色谱峰组分对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力(见图3)，选择对人肺癌细胞株抑制能力最强的色谱峰组分，冻干，得鲟鱼鱼鳔凝胶层析酶解物(sbh-ib)。
36.②
rp-hplc纯化：将上述鲟鱼鱼鳔凝胶层析酶解物(sbh-ib)用双蒸水配成55μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化制备11个寡肽组分(bp1～bp11)(见图4)，根据对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力(见图5)，得1个高活性抗肺癌寡肽(bp6)。
37.③
结构检测：收集对人肺癌细胞株(a549)增殖抑制能力最强色谱峰组份(bp6)，经rp-hplc检测纯度达到98％，利用esi-ms测定分子量为623.66da(见图6)，蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为gln-pro-his-asp-lys(qphdk)(见图7)。
38.④
功能评价：
39.细胞增殖抑制率检测：取对数生长期的人肺癌细胞株，以1
×
105/ml细胞浓度种植96孔细胞培养板中，常规培养24h，样品组用dmem完全培养基稀释样品至设定浓度，空白对照组加入100μl dmem完全培养基，每组设3个复孔。样品加入96孔细胞培养板后，处理48h后，小心吸除上层含样品培养基。每孔加入10％ mtt的完全培养基继续培养4h，弃掉上清液，加入dmso，振荡溶解10min。在490nm波长处测定吸光度值(od值)。按下列公式计算细胞增殖抑制率：
40.细胞增殖抑制率(％)＝(1-实验组细胞od值/空白对照组细胞od值)
×
100％。
41.gln-pro-his-asp-lys(qphdk)对人肺癌细胞株(a549、ncl-h460和h1299)增殖的影响如图8所示：在0.5～2.5mg/ml的浓度范围内，gln-pro-his-asp-lys(qphdk)对人肺癌细胞株a549、ncl-h460和h1299显示出剂量依赖性的增殖抑制能力；在2.5mg/ml浓度下，gln-pro-his-asp-lys(qphdk)对人肺癌细胞株a549、ncl-h460和h1299的增值抑制率分别达到79.51
±
2.97％、64.56
±
4.96％和68.29
±
3.85％。
42.细胞凋亡检测：人肺癌细胞株种植于60mm细胞培养皿中，待细胞增长达对数生长期后，分别按照设定浓度加入样品，空白对照组加入100μl dmem完全培养基，每组设3个复孔。继续培养48h，以胰酶消化并收集细胞，用高速离心机3000r/min离心5min，磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，ph 7.0)清洗两次，以annexin v-fitc在暗室中孵育30min，然后加入2μl的pi(100μg/ml)，用流式细胞分析检测细胞的凋亡情况。
43.gln-pro-his-asp-lys(qphdk)对人肺癌细胞株(a549、ncl-h460和h1299)凋亡的影响如图9所示：在0.5～2.5mg/ml的浓度范围内，gln-pro-his-asp-lys(qphdk)剂量依赖性地促进人肺癌细胞株(a549、ncl-h460和h1299)凋亡；在2.5mg/ml浓度下，gln-pro-his-asp-lys(qphdk)处理的人肺癌细胞株a549、ncl-h460和h1299，其凋亡率分别达到34.59
±
3.19％、30.22
±
2.67％和36.87
±
3.41％。
44.最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽，其特征在于，所述抗肿瘤寡肽为五肽化合物，其氨基酸序列为gln-pro-his-asp-lys(qphdk)，esi-ms测定其分子量为623.66da。2.一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)鲟鱼鱼鳔的预处理：将鲟鱼鱼鳔解冻，将乙酸乙酯加入到鲟鱼鱼鳔中，组织捣碎机匀浆，然后于40khz超声脱脂，干燥；2)鲟鱼鱼鳔蛋白的酶解：将上述脱脂鲟鱼鱼鳔粉末加入到甘氨酸-naoh缓冲液中，溶液调温至50～60℃，调节ph值至8.6～10.6，加入碱性蛋白酶，水解4～6h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，离心，收集上清液，即鲟鱼鱼鳔酶解液。3)鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽的制备：将鲟鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为1.0kda、3.5kda和5.0kda的超滤膜进行分级，收集分级组分，测定其抑制人肺癌细胞株(a549)增殖的能力，选择对人肺癌细胞株(a549)增殖抑制能力最强的组分冻干，得鲟鱼鱼鳔超滤酶解物，该超滤酶解物溶液并依次经过凝胶柱层析和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，得到具有显著抑制人肺癌细胞增殖和促进人肺癌细胞凋亡活性的鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽。3.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的鲟鱼为西伯利亚鲟(acipenser baerii)。4.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的鲟鱼鱼鳔与乙酸乙酯的料液比为1g:8～10ml。5.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中甘氨酸-naoh缓冲液的浓度为0.05mol/l，ph为9.6。6.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中脱脂鲟鱼鱼鳔粉末与0.05mol/l的甘氨酸-naoh缓冲液的料液比为1g:12～15ml。7.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中碱性蛋白酶的添加量为鲟鱼鱼鳔粉末重量2.0～3.0％。8.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的凝胶柱层析和rp-hplc纯化的具体过程为：凝胶柱层析：将上述鲟鱼鱼鳔超滤酶解物溶解于双蒸水配成浓度为30～40mg/ml的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱层析分离，用磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，ph 7.0)进行洗脱，流速0.8～1.2ml/min，根据220nm下的吸光值绘制色谱图，收集各色谱峰，测定各色谱峰组份对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力，选择抑制能力最强的色谱峰组分，冻干，得鲟鱼鱼鳔凝胶层析酶解物。rp-hplc纯化：将上述鲟鱼鱼鳔凝胶层析酶解物用双蒸水配成50～60μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化，根据色谱峰分离制备寡肽组份，然后测定各组份对人肺癌细胞株(a549)增殖的抑制能力，得1个高活性抗肺癌寡肽gln-pro-his-asp-lys(qphdk)，esi-ms测定分子量为623.66da。9.如权利要求8所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述rp-hplc条件为：进样量10～15μl；色谱柱zorbax,sb c-18(4.6
×
250mm，5μm)；流动相：梯度洗脱，乙腈浓度在30min内从0匀速提高至60％；洗脱速度1.0～1.5ml/min；紫外检测波长220nm。10.如权利要求1所述的鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽在制备预防或治疗肺癌药物中的用途。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体指涉及一种具有抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞凋亡的鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽及其应用。本发明以鲟鱼鱼鳔为原料，通过超声波预处理脱脂、碱性蛋白酶酶解，膜超滤、色谱分离纯化得到具有抗肺癌功效的寡肽Gln-Pro-His-Asp-Lys(QPHDK)，ESI-MS测定分子量为623.66Da。本发明鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽可以显著地抑制人肺癌细胞株A549、NCL-H460和H1299的增殖，促进人肺癌细胞株A549、NCL-H460和H1299的凋亡，可应用于制备预防或治疗肺癌相关的药物或其功能产品。治疗肺癌相关的药物或其功能产品。


技术研发人员：王伶 王斌
受保护的技术使用者：浙江海洋大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/22