一种口蹄疫病毒样颗粒诱导表达型载体的构建方法

1.本发明涉及生物医学领域。具体涉及口蹄疫病毒颗粒样表达载体的构建方法。


背景技术：

2.口蹄疫(foot-and-mouth disease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，fmdv)引起的一种人畜共患的急性、热性、高度接触性传染病。fmdv属于小rna病毒科(picornaviridae)、口蹄疫病毒属(aphthotvrus)。fmdv呈球形，正二十面体对称直径25-30nm，无囊膜，由约8500bp的单股正链rna和衣壳蛋白组成，基因组rna包合5`非编码区(untranslation region，utr)、3`-utr和开放阅读框(open reading frame，orf)3个部分。orf编码一个大的多聚蛋白，可被病毒蛋白酶切割成4种结构蛋白(vp4、vp2、vp3、vp1)和8种非结构蛋白(l、2a、2b、2c、3a、3b、3c、3d)，其中各60个分子的4种结构蛋白组成病毒粒子的衣壳，8种非结构蛋白调节宿主中的病毒复制、蛋白质加工和蛋白质修饰。蛋白酶有前导蛋白l、2a、3c和未知酶类，其中3c蛋白酶(3cpro)在fmdv结构蛋白的切割中起着十分重要的作用。病毒翻译和修饰过程中，fmdv衣壳蛋白前体p12a被3cpr切割，产生1ab(vp0)、1c(vp3)、1d(vp1)和2a，基因组装过程中vp0被3cp进一步裂解为vp2和vp4。在病毒粒子的装配过程中，vp0、vp3和vp1先形成5s原体，再形成14s的五聚体，最后由12个五聚体组装成75s的fmdv空衣壳。vp0是一个前体蛋白，最终自身裂解成vp2和vp4，从而形成成熟的病毒粒子。研究表明，结构蛋白vp1能够诱导宿主细胞产生中和抗体，而vp2、vp3、vp4参与病毒颗粒的组装，并且影响病毒颗粒的免疫原性。fmdv衣壳蛋白前体p1-2a含有fmdv的主要抗原决定簇，可诱导机体产生体液免疫应答，从而保护动物免受fmdv的攻击。目前，国内外有关利用不同活载体构建fmdv衣壳蛋白活载体疫苗的报道较多，所用的病毒载体有鸡痘病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒和杆状病毒。其中以缺陷型腺病毒5型构建的fmdv衣壳蛋白活载体疫苗的研究最为深入，也取得了很好的免疫效果。
3.病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)由一个或多个重组表达的结构蛋白自我组装而成，能够快速的诱导体液免疫和细胞免疫。fmdv病毒样颗粒(virus like particles,vlps)不含病毒自身遗传物质，是由病毒成熟衣壳蛋白vp0、vp3、vp1组成的空心颗粒，与其他亚单位疫苗相比，其形态、构象与天然病毒最为接近，有着广泛的用途，例如疫苗和药物靶向递送载体(nooraei et al.,2021)。利用重组表达系统制造vlps是一个复杂的过程。载体构建，尤其是开放阅读框(open reading frame,orf)的构建是重组表达vlps的核心和难点之一。
4.在重组表达系统内表达p12a和3cpro既能实现p12a的切割，进而形成成熟衣壳蛋白vp0、vp3和vp1(roosien et al.,1990)。借助2a的“核糖体跳跃功能”将3c连接于p12a的下游构成p12a3c是常见的构建方式之一(li et al.,2008)，该构建方式以单个orf共表达p12a和3cpro，并能完全切除2a短肽，具有简便的特点。然而，2a上、下游蛋白的表达水平在不同细胞中表现不同为该构建方式增加了不确定性(li et al.,2008；mignaqui et al.,2013b)。将p12a、3c分别置于两个启动子下游分别进行转录是另外一种构建方式。在昆虫内
双启动子的构建方式显示比p12a3c更低的vlps产量(ruiz et al.,2014)，这种现象可能是置于p10启动子下游的3c基因早期大量转录抑制p12a翻译所致。核糖体内部进入位点元件(ires)也是双顺反子载体常用的构建方式，但ires的翻译启动活性较低。在昆虫细胞中将以ires启动3cpro的翻译明显增强了衣壳蛋白的表达(vivek srinivas et al.,2016)，说明在一定程度减少3cpro的翻译有利于vlps的表达。在哺乳动物细胞中也报道了类似的结果，他们有的通过质粒的共转染比例调节3cpro的表达水平(polacek et al.,2013)、有的ires元件减少3cpro的表达(gullberg et al.,2013b)从而增强成熟衣壳蛋白的表达。此外，有研究通过重组牛痘病毒-t7表达系统增强p12a的表达量从而获得大量vlps(porta et al.,2013a)。也有研究者通过引入突变降低3cpro的活性从而增强衣壳蛋白的表达水平。通过在2a下游相继连接hiv-1移码框和3c(c142t)突变体在昆虫细胞内高效vlps(porta et al.,2013a；porta et al.,2013b)。在p12a3c的构建方式下，引入3copti突变也显示vlps在哺乳动物细胞内高效表达(puckette et al.,2022)。由此可以看出，对于特定的3cpro(野生型、突变型)合理控制p12a和3cpro的表达水平是高效产生fmd vlps是前体。另外，除去3cpro也能产生vlps(cao et al.,2010)，但平衡vp0、vp3、vp1的表达水平往往成为难点。
5.在目前生产制备fmdv vlp的表达系统中主要有原核表达系统、真核表达系统以及无细胞表达系统。采用小泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier，sumo)融合共表技术，实现了fmdv的vp0、vp3和vp1结构蛋白在大肠杆菌中同水平、可溶性表达，并通过酶切、体外组装形成vlp。在真核表达系统中，通过共表达衣壳蛋白前体p12a和3c蛋白酶(3cpro)实现了vlps胞内自组装。3cpro已被报道对真核细胞具有强烈的毒性作用，未能实现以组成型启动子稳定强表达p12a和3cpro基因，且组成型表达p12a3c基因的bhk-21细胞系只能产生极低量的fmdv衣壳蛋白。目前，杆状病毒-昆虫细胞表达系统，哺乳动物表达系统等真核表达系统只能采用瞬时表达制备fmdv vlps。利用质粒转染的方式瞬时表达fmdv vlps主要以hek293细胞为宿主，虽然hek293细胞拥有强大的异源蛋白生产能力，且报道了以聚乙烯亚胺(pei)为转染试剂中等规模转染hek293-6e细胞生产fmdv vlps，但该方法耗时且使用成本高，不利于规模化生产应用。


技术实现要素：

6.本发明通过构建pb转座-四环素诱导表达系统，以期提高p12a和3c基因稳定整合至细胞基因组的成功率。
7.第一方面，本发明提供一种针对口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统，所述系统包括编码转座酶、反向反式激活因子、诱导剂、口蹄疫病毒样颗粒的核酸。
8.进一步的，所述转座酶可以是编码piggybac(pb)的转座酶及其变体。
9.进一步的，所述转座酶优选chypbase。
10.进一步的，所述反向反式激活因子为可以是反向反式激活因子本身及其变体。
11.进一步的，所述反向反式激活因子优选为rtta-advanced。
12.进一步的，所述诱导剂为四环素类物质及其衍生物。
13.进一步的，所述诱导剂优选为dox-hcl(盐酸多西环素)。
14.进一步，所述口蹄疫病毒样颗粒的核酸为优化后的序列p12a3coptiopti，如seq id no:3所示。
15.第二方面，本发明提供一种口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统的构建方法，所述方法包括如下步骤：
16.s01构建pb转座酶质粒；
17.s02构建反式激活因子质粒；
18.s03构建pb转座-诱导表达的口蹄疫病毒样颗粒的核酸的质粒；
19.s04将上述得到的质粒共同转染到宿主细胞中，得到完整的口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统。
20.进一步的，所述pb转座酶质粒的表达载体选自ptt5或pvax1。
21.进一步的，所述反向反式激活因子优选编码反向四环素的反式激活因子rtta。
22.进一步，所述口蹄疫病毒样颗粒的核酸为优化后的序列p12a3coptiopti，如seq id no:3所示。
23.进一步的，所述pb转座-诱导表达优选pb转座-四环素诱导表达。
24.第三方面，本发明提供一种口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统在制备口蹄疫生物制剂中的应用。
25.进一步的，所述生物制剂含有第一方面所述的口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统。
26.进一步的，所述生物制剂可以是口蹄疫疫苗制剂和/或口蹄疫疫苗疫苗制剂的组合物。
27.进一步的，所述疫苗可以是灭活苗、重组蛋白苗、合成肽苗、核酸苗和腺病毒载体苗。
28.进一步的，口蹄疫疫苗制剂的组合物是含有所述口蹄疫疫苗和免疫佐剂的组合物。
附图说明
29.图1.质粒ptt5-p12a3cwt、ptt5-p12a3coptiopti双酶切鉴定图。(wt(e-b)：质粒ptt5-p12a3cwt被ecorⅰ和bamhⅰ双酶切；wt：质粒ptt5-p12a3cwt，opti：质粒ptt5-p12a3coptiopti，opti(e-b)：质粒ptt5-p12a3coptiopti被ecorⅰ和bamhⅰ双酶切。)
30.图2.pcr扩增fra1、fra2片段鉴定图
31.图3.质粒pegfp-n1、pbbsd双酶切鉴定图(bamhⅰ、notⅰ)
32.图4.左：pcr扩增rtta基因；右：rtta基因、质粒pbbsd双酶切鉴定图
33.图5.pcr扩增bghp(a)片段
34.图6.pcr扩增mcherry基因
35.图7.pb转座-四环素诱导表达系统的功能验证。(a)chypbase转座活性检测；(b)质粒pbbsd转座功能的验证；(c)质粒pbtet诱导功能的验证；(d)质粒pbtet转座功能的验证；(e)rtta基因的扩增(左)，rtta、pbbsd双酶切鉴定(右)；(f)质粒pbbsd-rtta表达rtta蛋白的检验
36.图8.目的基因基因的插入及瞬转表达。(a)双酶切产物分析；(b)组成型表达目的基因的瞬转测试。(c)诱导型表达目的基因的瞬转测试
37.图9.表达目的基因细胞的生成。(a)组成型表达目的基因细胞的荧光观察。(b)诱
导型表达目的基因细胞的荧光观察。(c)基因组3c和rtta基因的pcr检测(d)添加诱导剂后诱导表达细胞的形态观察。
38.图10.细胞表达vlps的检测。(a)组成型表达目的基因细胞的western blot检测。(b)诱导型表达目的基因细胞的western blot检测。(c)图10b蛋白表达的量化。(d)vlps相对量的elisa检测(蛋白的表达量检测)。
具体实施方式
39.转座酶：执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的dna靶位点，无同源性要求。
40.在一种实施方式中，通过引物合成chypbase转座酶片段，通过hindⅲ和notⅰ内切酶连接至ptt5载体，命名为ptt5-chypbase。
41.本文所述“变体”：对原有的氨基酸序列做了突变，形成了新的氨基酸序列，所述突变可以是氨基酸的取代、缺失或添加。
42.实施例1pb转座-四环素诱导表达的杂交系统构建
43.本发明所用质粒ptt5、piggybac dual promoter(pbdp)购自广州萃本生物科技公司，pcdna6/v5-hisb购自北京华越洋生物科技公司，ptet-on-advanced购自长春市华益生物科技公司，pegfp-n1、pcs2+-mcherry由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫防控团队保存。
44.bhk-21细胞由本实验室保存，在含有10％fbs(gibco)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的培养基中培养。expi293f细胞购自赛默飞公司，293sfm完全培养基购自苏州天信和公司。o型fmd猪阳性血清由实验室保存。辣根过氧化物酶(hrp)标记的兔抗猪igg抗体、hrp标记的山羊抗小鼠igg抗体购自sigma公司。小鼠源抗β-actin单克隆抗体购自康为世纪公司购自sigma公司。
45.线性聚乙烯亚胺(pei)固体粉末购自polyscience，并依照说明书配置成1mg/ml水溶液。高保真dna聚合酶、dna maker购自宝生物工程(大连)公司。protein maker购自smobio公司。质粒提取试剂盒购自omega公司。dna同源重组酶连接酶购自诺唯赞公司。嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、盐酸强力霉素(dox-hcl)购自北京索莱宝公司。
46.1.1基因及引物合成
47.根据中国仓鼠卵巢(cho)细胞偏嗜性密码子对已报道的高活性pb转座酶进行密码子优化。合成的pb转座酶命名为chypbase。本发明使用引物详见表1。基因及引物合成由北京擎科生物公司完成。
48.表1引物及序列
[0049][0050]
1.2pb转座-组成型表达p12a3c质粒的构建
[0051]
1.2.1ptt5-chypbase质粒构建
[0052]
根据中国仓鼠卵巢(cho)细胞偏嗜性密码子对已报道的高活性pb转座酶进行密码子优化，将合成的转座酶chypbase片段通过hindⅲ和notⅰ内切酶连接至ptt5载体，命名为ptt5-chypbase。
[0053]
pb转座酶编码序列是高活性pb转座酶的氨基酸序列，并且经过密码子优化，其cdna序列如seq id no:1所示。
[0054]
seq id no:1：
[0055]
atgggcagcagcctggacgacgagcacatcctgagcgccctgctgcagagcgacgacgagctggtgggcgaggacagcgacagcgaggtgagcgaccacgtgagcgaggacgacgtgcagagcgacaccgaggaggccttcatcgacgaggtgcacgaggtgcagcccaccagcagcggcagcgagatcctggacgagcagaacgtgatcgagcagcccggcagcagcctggccagcaacaggatcctgaccctgccccagaggaccatcaggggcaagaacaagcactgctggagcaccagcaagcccacccggcggagccgggtgagcgccctgaacatcgtgcggagccagcggggccccaccaggatgtgccggaacatctacgaccccctgctgtgcttcaagctgttcttcaccgacgagatcatcagcgagatcgtgaagtggaccaacgccgagatcagcctgaagcggcgggagagcatgaccagcgccaccttcagggacaccaacgaggacgagatctacgccttcttcggcatcctggtgatgaccgccgtgcggaaggacaaccacatgagcaccgacgacctgttcgaccggagcctgagcatggtgtacgtgagcgtgatgagccgggaccggttcgacttcctgatccggtgcctgcggatggacgacaagagcatcaggcccaccctgcgggagaacgacgtgttcacccccgtgcggaagatctgggacctgttcatccaccagtgcatccagaactacacccccggcgcccacctgaccatcgacgagcagctgctgggcttccggggccggtgccccttccgggtgtacatccccaacaagcccagcaagtacggcatcaagatcctgatgatgtgcgacagcggcaccaagtacatgatcaacggcatgccctacctgggccggggcacccagaccaacggcgtgcccctgggcgagtactacgtgaaggagctgagcaagcccgtgcacggcagctgccggaacatcacctgcgacaactggttcaccagcatccccctggccaagaacctgctgcaggagccctacaagctgaccatcgtgggcaccgtgcggagcaacaagcgggagatccccgaggtgctgaagaacagccggagccggcccgtgggcaccagcatgttctgcttcgacggccccctgaccctggtgagctacaagcccaagcccgccaagatggtgtacctgctgagcagctgcgacgaggacgccagcatcaacgagagcaccggcaagccccagatggtgatgtactacaaccagaccaagggcggcgtggacaccctggaccagatgtgcagcgtgatgacctgcagccggaagaccaaccggtggcccatggccctgctgtacggcatgatcaacatcgcctgcatcaacagcttcatcatctacagccacaacgtgagcagcaagggcgagaaggtgcagagccggaagaagttcatgcggaacctgtacatgggcctgaccagcagcttcatgcggaagcggctggaggcccccaccctgaagcggtacctgcgggacaacatcagcaacatcctgc
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[0056]
1.2.2质粒pbdp-p12a3cwt和pbdp-p12a3copti的构建
[0057]
p12a3cwt、p12a3coptiopti基因由合成得到，并插入至质粒ptt5的hindⅲ和notⅰ酶切位点之间得到质粒ptt5-p12a3cwt、ptt5-p12a3copti。利用内切酶ecorⅰ和bamhⅰ对质粒ptt5-p12a3cwt、ptt5-p12a3copti进行双酶切，并设置质粒未酶切对照组。酶切鉴定结果见图1。将切下的基因片段用t4 dna连接酶插入至质粒pbdp的ecorⅰ和bamhⅰ位点，得到质粒pbdp-p12a3cwt和pbdp-p12a3copti。
[0058]
1.3pb转座-四环素诱导表达p12a3c质粒的构建
[0059]
1.3.1质粒pbbsd-rtta的构建
[0060]
(1)以质粒pbdp为模板、p3和p4为引物扩增目的片段fra1，以质粒pcdna6/v5-hisb为模板，p1和p2为引物扩增目的片段fra2，用dna同源重组酶重组fra1和fra2片段，得到质粒pbbsd。fra1、fra2片段pcr扩增鉴定见图2。
[0061]
(2)用内切酶bamhⅰ、notⅰ对质粒pegfp-n1、pbbbsd进行双酶切，回收egfp和pbbsd片段，用t4 dna连接酶进行连接，得到pbbsd-egfp，见图3。
[0062]
(3)以质粒ptet-on-advanced为模板，p5和p6为引物扩增rtta片段(见图4)；用内切酶kpnⅰ、bamhⅰ对rtta片段、质粒pbbbsd进行双酶切(见图4)，回收rtta和pbbsd片段，并用t4 dna连接酶进行连接，得到pbbsd-rtta。
[0063]
1.3.2诱导型质粒pbtet-p12a3c的构建方法
[0064]
(1)以质粒pbdp为模板，将cmv启动子替换为p-sgtre启动子，以pcdna3.1(+)为模板、p11和p12为引物扩增bghp(a)片段(见图5)，用内切酶bamhⅰ和notⅰ对bghp(a)片段进行双酶切，插入至更换启动子的载体pbdp中，得到质粒pbtet。
[0065]
(2)以pcs2+-mcherry为模板，p7和p8为引物扩增mcherry基因(见图6)，并插入至pbtet的ecorⅰ和bamhⅰ位点，得到质粒pbtet-mcherry。
[0066]
(3)用内切酶ecorⅰ和bamhⅰ进行双酶切ptt5-p12a3cwt和ptt5-p12a3copti(见图1)，并插入至pbtet的相应酶切位点，得质粒pbtet-p12a3cwt和pbtet-p12a3copti。
[0067]
实施例2pb转座-四环素诱导表达系统的功能验证
[0068]
2.1chypbase转座活性的验证
[0069]
质粒pbdp和ptt5-chypbase以9:1的质量比转染bhk-21细胞，转染后1天加入10μg/ml嘌呤霉素进行细胞筛选，每2天加入含抗生素的新鲜培养基。筛选12天后于荧光显微镜下观察阳性克隆数。
[0070]
2.2质粒pbbsd转座功能的验证
[0071]
质粒pbbsd-egfp和ptt5-chypbase以9:1的质量比转染bhk-21细胞，转染后1天加入10μg/ml杀稻瘟菌素进行细胞筛选，每2天加入含抗生素的新鲜培养基。筛选10天后于荧光显微镜下观察阳性克隆数。
[0072]
2.3质粒pbtet转座功能和诱导表达功能的验证
[0073]
质粒pbtet-mcherry和ptet-on-advanced以9：1的质量比转染bhk-21细胞，12小时后加入2μg/ml dox-hcl，转染36小时后于荧光显微镜下观察红色荧光。
[0074]
质粒pbtet-mcherry、pbbsd-rtta和ptt5-chypbase以8:1:1的质量比共转于bhk-21细胞，转染后1天加入10μg/ml嘌呤霉素和5μg/ml杀稻瘟菌素进行细胞筛选，每2天加入含抗生素的新鲜培养基。筛选10天后于荧光显微镜下观察阳性克隆数。
[0075]
2.4实验结果
[0076]
(1)对pb转座酶进行转座活性检查，质粒pbdp与质粒ptt5-chypbase共转，经高浓度嘌呤霉素筛选12天后产生大量阳性克隆，而对照组几乎无阳性克隆产生(见图7a)，说明构建的转座酶具有高活性。
[0077]
(2)为快速检测质粒pbbsd的转座元件功能，将pbbsd-egfp与ptt5-chypbase共转，经过杀稻瘟菌素筛选得到的细胞含有大量阳性克隆，而对照组几乎无阳性克隆(见图7b)，说明质粒pbbsd能与pb转座酶作用。
[0078]
(3)为快速验证质粒pbtet诱导型启动子的功能，将pbtet-mcherry与质粒ptet-on-advanced共转，加入诱导剂dox-hcl后显示强烈的红色荧光(图7c)，说明pbtet的诱导型启动子能与rtta作用。
[0079]
(4)质粒pbtet与ptt5-chypbase共转10后快速产生了目的细胞(见图7d)，证明pbtet具有转座功能。
[0080]
(5)为得到以组成型启动子表达rtta的pb转座质粒，以ptet-on-advanced为模板pcr扩增rtta(见图7e左)，产物通过双酶切插入质粒pbbsd中(图7e右)，得到质粒pbbsd-rtta。通过质粒pbbsd-rtta与pbtet-mcherry的共转实验证明质粒pbbsd-rtta能正确表达rtta蛋白(见图7f)。
[0081]
实施例3p12a3c基因的插入及瞬转验证
[0082]
对质粒ptt5-p12a3copti进行双酶切(图8a)，并分别插入质粒pbdp和pbtet中，得到质粒pbdp-p12a3copti和pbtet-p12a3copti。在瞬转实验中，组成型表达组除pbdp-p12a3c wt-2外，其余克隆均成功表达了fmdv衣壳蛋白(vp0、vp3、vp1)(图8b)。诱导型表达组未添加dox-hcl时无fmdv衣壳蛋白表达，在添加dox-hcl后增强了fmdv衣壳蛋白的表达水平，且pbtet-p12a3copti的fmdv衣壳蛋白表达水平远高于pbtet-p12a3cwt(图8c)。
[0083]
pbtet-p12a3cwt(seq id no:2)：
[0084]
atgggcgccggccagagcagccccgccaccggctcccagaaccagtccggcaacaccggctccatcatcaacaactactacatgcagcagtaccagaactccatggacacccagctgggcaacaacgccatctccggcggctccaacgagggctccaccgacaccacctccacccacaccaccaacacccagaacaacgactggttctccaagctggcctcctccgccttctccggcctgttcggagccctgctggccgacaaaaagaccgaggagaccacactgctggaagacagaatcctgaccaccagaaacggacacaccacctccacaacccagtcctccgtgggcatcacccacggctacgccaccgccgaggacttcgtgaacggccccaacacctccggcctggagaccagggtggtgcaggccgagcggttcttcaagacccacctgttcgactgggtgacctccgaccccttcggccggtactacctgctggagctgcccaccgaccacaagggcgtgtacggcagcctgaccgactcctacgcctacatgcggaacggctgggacgtggaggtgaccgccgtgggcaaccagttcaacggcggctgcctgctggtggccatggtgcccgagctgtgctccatcgagcagagggagctgttccagctgaccctgttcccccaccagttcatcaacccccggaccaacatgaccgcccacatcaaggtgcccttcgtgggcgtgaacaggtacgaccagtacaaggtgcacaagccctggaccctggtggtgatggtggtggcccccctgaccgtgaacaccgagggcgccccccagatcaaggtgtacgccaacatcgcccccaccaacgtgcacgtggccggcgagttcccctccaaggagggcatcttccccgtggcctgctccgacggctacggcggcctggtgaccaccgaccccaagaccgccgaccccgtgtacggc
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[0085]
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[0086]
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[0087]
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[0088]
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[0089]
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[0090]
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[0091]
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[0092]
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[0093]
gtgctggcctccgccggcaaggacttcgagctgcggctgcccgtggacgcccggca
[0094]
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[0095]
acggcggcgagacccaggtgcagcgacggcaccacaccgacgtgtccttcatcctg
[0096]
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[0097]
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[0098]
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[0099]
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[0100]
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[0101]
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[0102]
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[0103]
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[0104]
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[0105]
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[0106]
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[0107]
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[0108]
gtggccatctgctgcgccaccggcgtgttcggcaccgcctacctcgtgccccggcac
[0109]
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[0110]
cgactacagggtgttcgagttcgagatcaaggtgaagggccaggacatgctctccg
[0111]
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[0112]
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[0113]
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[0114]
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[0115]
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[0116]
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[0117]
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[0118]
pbtet-p12a3copti(seq id no:3)：
[0119]
atgggcgccggccagagcagccccgccaccggctcccagaaccagtccggcaacaccggctccatcatcaacaactactacatgcagcagtaccagaactccatggacacccagctgggcaacaacgccatctccggcggctccaacgagggctccaccgacaccacctccacccacaccaccaacacccagaacaacgactggttctccaagctggcctcctccgccttctccggcctgttcggagccctgctggccgacaaaaagaccgaggagaccacactgctggaagacagaatc
ctgaccaccagaaacggacacaccacctccacaacccagtcctccgtgggcatcacccacggctacgccaccgccgaggacttcgtgaacggccccaacacctccggcctggagaccagggtggtgcaggccgagcggttcttcaagacccacctgttcgactgggtgacctccgaccccttcggccggtactacctgctggagctgcccaccgaccacaagggcgtgtacggcagcctgaccgactcctacgcctacatgcggaacggctgggacgtggaggtgaccgccgtgggcaaccagttcaacggcggctgcctgctggtggccatggtgcccgagctgtgctccatcgagcagagggagctgttccagctgaccctgttcccccaccagttcatcaacccccggaccaacatgaccgcccacatcaaggtgcccttcgtgggcgtgaacaggtacgaccagtacaaggtgcacaagccctggaccctggtggtgatggtggtggcccccctgaccgtgaacaccgagggcgccccccagatcaaggtgtacgccaacatcgcccccaccaacgtgcacgtggccggcgagttcccctccaaggagggcatcttccccgtggcctgctccgacggctacggcggcctggtgaccaccgaccccaagaccgccgaccccgtgtacggcaaggtgttcaaccccccccggaacatgctgcccggcaggttcaccaacctgctggacgtggccgaggcctgccccaccttcctgcacttcgacggcgacgtgccctacgtgaccaccaagaccgactccgaccgggtgctggcccagttcgacctgtccctggccgccaagcacatgtccaacaccttcctggccggcctggcccagtattacacccagtactccggcaccgtgaacctgcacttcatgttcaccggccccaccgacgccaaggcccggtacatgatcgcctacgccccccccggcatggagccccccaagacccccgaggccgccgcccactgcatccacgccgagtgggacaccggcctgaactccaagttcaccttcagcatcccctacctgtccgccgccgactacgcctacaccgcctccgacgccgccgagaccaccaacgtgcagggctgggtgtgcctgttccagatcacccacggcaaggccgagggcgacgccctggtggtgctggcctccgccggcaaggacttcgagctgcggctgcccgtggacgcccggcagcagaccacctccaccggcgagtccgccgaccccgtgaccgccaccgtggagaactacggcggcgagacccaggtgcagcgacggcaccacaccgacgtgtccttcatcctggaccggttcgtgaaggtgacccccaaggactccatcaacgtgctggacctgatgcagaccccctcccacaccctggtgggcgccctgctgcggaccgccacctactacttcgccgacctggaggtggccgtgaagcacaagggcgacctgacctgggtgcccaacggcgcccccgtggccgccctggacaacaccaccaaccccaccgcctaccacaaggcccccctgacccggctggccctgccctacaccgccccccaccgggtgctggccaccgtgtacaacggcaagtgcaagtacgccgagggctccctgcccaacgtgcggggcgacctgcaggtgctggcccagaaggccgcccggcccctgcccacctccttcaactacggcgccatcaaggccacccgggtgaccgagctgctgtaccggatgaagcgggccgagacctactgcccccggcccctgctggccgtgcacccctccgccgcccggcacaagcagaagatcgtggcccccgtgaagcagagcctgaacttcgacctgctgaagctggccggcgacgtggagtccaaccccggccccagcggccgcagcggcgcccccccgaccgacttgcagaagatggtcatgggcaacaccaagcccgtggagctcatactcgacgggaagaccgtggccatctgctgcgccaccggcgtgttcggcaccgcctacctcgtgccccggcacctgttcgccgagaagtacgacaagatcatgttggacggcaggaccatgaccgacagcgactacagggtgttcgagttcgagatcaaggtgaagggccaggacatgctctccgacgccgcgctcatggtgctgcaccgggggaaccgcgtgagggacatcacgaagcacttccgggacaccgccaggatgaagaagggcacccccgtcgtgggcgtgatcaacaacgccgacgtcgggaggcctatcttctccggcgaggccctcacctacaaggacatcgtggtgtgcatggacggcgacaccatgccgggcctgttcgcctacaaggccgccaccaaggccggctactgcgggggcgccgtcctggccaaggacggcgccgacaccttcatcgtgggcacccactccgccggcggcaacggcgtggggtactgctcctgcgtgtccaggtccatgctccagaagatgaaggcccacatcgaccccgagccccaccacgag
[0120]
实施例4诱导型表达和组成型表达p12a3c基因的瞬转测试
[0121]
将质粒pbdp-p12a3cwt或pbdp-p12a3copti与ptt5-chypbase共转于bhk-21细胞，经过嘌呤霉素筛选后得到两种组成型表达p12a3c基因的细胞c-wt和c-opti。质粒pbtet-p12a3cwt或pbtet-p12a3c opti、pbbsd-rtta、ptt5-chypbase共转，得到诱导型表达目的基因的细胞，分别命名为i-wy和i-opti。通过荧光观察(见图9a、图9b)、基因组中目的基因的
检测(图9c)证明目的基因稳定整合于以上4种细胞的基因组中，rtta基因稳定整合于细胞i-wt和i-opti的基因组中。综上所述，组成型与诱导型表达目的基因的细胞均构建成功。此外，在诱导蛋白表达时，发现细胞i-wt出现了严重的细胞脱落现象(见图9d)。
[0122]
实施例5细胞表达vlps的检测
[0123]
(1)分别对组成型表达细胞c-wt、c-opti，诱导型表达细胞i-wt，i-opti进行fmd vlps表达情况进行检测。
[0124]
细胞c-wt和c-opti未显示fmdv衣壳蛋白的表达(图10a)，说明这两种细胞不产生vlps。
[0125]
(2)对添加诱导剂后的细胞分别收集贴壁细胞和脱落细胞，并检测衣壳蛋白的表达。其中1、2、3分别表示细胞i-wt未加dox-hcl、加dox-hcl收集的贴壁细胞、加dox-hcl收集的脱落细胞。标号4、5、6分别表示细胞i-opti未加dox-hcl、加dox-hcl收集的贴壁细胞、加dox-hcl收集的脱落细胞。
[0126]
图10b显示添加诱导剂前几乎无蛋白表达，而添加诱导剂后出现蛋白表达，且贴壁细胞和脱落细胞显示相似的衣壳蛋白表达水平。细胞c-opti显示更高的衣壳蛋白表达水平。说明优化的p12a3copti有利于增强成熟衣壳蛋白的表达。
[0127]
(3)使用image j软件对图10b进行灰度分析。
[0128]
图10c显示，优化的p12a3copti使fmdv衣壳蛋白的表达量增加了15-30倍。
[0129]
(3)为进一步检测细胞fmdv vlps的表达，通过裂解相同数量的细胞，提取细胞裂解液进行了elisa检测。与western bolt结果一致，细胞i-opti在诱导后显示更强的fmdv vlps表达(图10d)。
[0130]
综上所述，经过构建pb转座-四环素诱导表达系统，并将优化后的p12a3copti在该系统表达，提高p12a和3c基因稳定整合至细胞基因组的成功率，同时fmdv衣壳蛋白的表达量增加了15-30倍。

技术特征：
1.一种针对口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统，所述系统包括编码转座酶、反向反式激活因子、诱导剂、口蹄疫病毒样颗粒的核酸。2.如权利要求1所述针对口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统，其特征在于，所述转座酶可以是编码piggybac(pb)的转座酶及其变体。3.如权利要求1所述针对口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统，其特征在于，所述反向反式激活因子为可以是反向反式激活因子本身及其变体。4.如权利要求1所述针对口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统，其特征在于，所述诱导剂为四环素类物质及其衍生物。5.如权利要求1所述针对口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统，其特征在于，所述口蹄疫病毒样颗粒的核酸为优化后的序列p12a3copti，如seq id no:3所示。6.一种口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统的构建方法，所述方法包括如下步骤：s01构建pb转座酶质粒；s02构建反式激活因子质粒；s03构建pb转座-诱导表达的口蹄疫病毒样颗粒的核酸的质粒；s04将上述得到的质粒共同转染到宿主细胞中，得到完整的口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统。7.如权利要求6所述口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统的构建方法，其特征在于，所述pb转座酶质粒的表达载体选自ptt5或pvax1。8.一种口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统在制备口蹄疫生物制剂中的应用，所述生物制剂含有权利要求1-5所述的口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统。9.如权利要求8所述口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统在制备口蹄疫生物制剂中的应用，其特征在于，生物制剂可以是口蹄疫疫苗制剂和/或口蹄疫疫苗疫苗制剂的组合物。10.如权利要求9所述口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统在制备口蹄疫生物制剂中的应用，其特征在于，所述疫苗可以是灭活苗、重组蛋白苗、合成肽苗、核酸苗和腺病毒载体苗。

技术总结
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种针对口蹄疫病毒样颗粒的转座-诱导表达系统，所述系统包括编码转座酶、反向反式激活因子、诱导剂、口蹄疫病毒样颗粒的核酸，所述转座酶可以是编码PiggyBac(PB)的转座酶及其变体，所述反向反式激活因子为可以是反向反式激活因子本身及其变体，所述诱导剂为四环素及其衍生物，所述口蹄疫病毒样颗粒的核酸为优化后的序列P12A3Copti，如SEQ ID NO:3所示。本发明经过构建PB转座-四环素诱导表达系统，并将优化后的P12A3Copti在该系统表达，提高了P12A和3C基因稳定整合至细胞基因组的成功率，同时FMDV衣壳蛋白的表达量增加了15-30倍。30倍。


技术研发人员：郭慧琛 谭书桢 孙世琪 董虎 白满元 滕志东 吴金恩 张韵 尹双辉
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/9/20