一株多功能的枯草芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株多功能的枯草芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.有机磷农药因其成本低、种类多、药效高被广泛使用，具有致突变性、致癌性、细胞毒性、基因毒性或免疫毒性等特点。毒死蜱是一种常见的有机磷农药，化学名称为o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸，外观呈白色粒装的晶体。微溶于水，易溶于大部分有机溶剂。它被用于防治油菜、双翅目、同翅目和鳞翅目等害虫，广泛应用于农业和住宅环境。但是施用毒死蜱后，绝大多数由于其顽固性和持久性而残留在环境中，对人类的中枢神经系统、循环系统和呼吸系统等产生危害作用。
3.噻唑膦是一种常见的有机磷土壤杀线虫剂，是一种有机化合物，外观呈浅黄色液体，微溶于水，易溶于大部分有机溶剂。噻唑膦农药广泛应用于防治多种作物的根结病、根部病变、胞囊和自由生活线虫，以确保作物有充足的产量。环境中的噻唑膦可能对多种环境生物产生毒性作用。高浓度的噻唑膦残留会导致人体中毒，包括神经毒性、生殖和发育毒性、致癌性和急性毒性等，同时还会对哺乳动物、鸟类和蜜蜂等产生毒害作用。
4.我国水体重金属污染问题十分突出。黄浦江干流表层沉积物中，cd超背景值2倍；苏州河中cd为75％超标；城市河流18.46％的河段tcd超过ⅲ类水体标准。近年来江河湖泊重金属含量呈逐年上升趋势，同时累积于蔬菜、肉类、鱼类、海鲜中，富集于动植物体内，已严重威胁着人们的健康。
5.烟草是我国重要的经济作物，据统计，2019年我国有102.7万hm2农田被用于烟草的种植，共产出烟草215万吨，总产值为10062亿元，产生了巨大的社会经济效益。在烟草行业迅猛发展的同时，我国烟草也被检出重金属含量超标问题。在烟草中检测出的重金属主要有cd、pb、hg等，其中cd极易在烟草中富集，且被烟草的吸收的cd会对烟草的整个生长阶段均产生不良影响。此外，将烟叶处理制成香烟流向市场后，隐藏其中的重金属便会以气溶胶形式随主流烟气被吸入支气管系统并在人体积累，进而引发骨质疏松、神经毒性和肾脏疾病等。
6.锰氧化微生物是指能够将mn(ii)氧化为高价生物锰氧化物的微生物。生物锰氧化物结构上的特点不仅影响着生物地球化学循环，其环境友好性使其具有良好的工程应用潜力，作为环境中天然的吸附剂、氧化剂和催化剂，在污水处理和土壤修复等领域具有一定的应用前景。因此，具有锰氧化性能的菌株在环境修复领域具有意义。
7.近年来，化肥农药的过量使用以及禽畜粪便和工业废水的不合理排放，使得农田土壤质量急剧下降，土传病害日益严重，极大地影响了农作物品质和产量，甚至引发环境退化问题。促生菌是指在一定条件下能够促进植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌，对农作物的生长具有促进作用，防治病害的发生。因此，亟待研发有效去除环境中残留的毒死蜱、噻唑膦、重金属cd和减少土传病害的方法，而利用微生物修复污染环境是环境友好的方法，具有高效简便、推广成本低、无二次污染等特点，已成为环境修复研究热点。
枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，为革兰氏阳性的好气性菌，普遍存在于土壤、植物体表以及在人体内。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中会产生不同水平的多种代谢产物，比如枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、b族维生素等，一些优良菌种根据其特性被制成动物体(人体)益生菌、饲料添加剂、污水处理剂、生物肥发酵、土壤改良剂等产品，并得到广泛应用。因此筛选优质的多功能枯草芽孢杆菌资源，用于去除环境中残留的毒死蜱、噻唑膦、减缓cd对植物的破坏和减少土传病害促进植物生长，仍然是本领域的研究重点。


技术实现要素：

8.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株多功能的枯草芽孢杆菌及其应用。本发明从农田土壤中筛选出一株多功能的枯草芽孢杆菌h27，属于bacillus subtilis，经试验证明该菌株能够降解有机磷农药毒死蜱和噻唑膦、阻控烟草对cd的吸收，产生生物锰氧化物以及促进植物生长，可应用于水体、土壤中，以达到去除毒死蜱、噻唑膦、减缓cd对植物的破坏和促进植物生长的目的。
9.具体的，本发明涉及以下技术方案：
10.本发明的第一方面，提供一株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27，该菌株已于2023年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，其生物保藏号为：cctcc no:m 2023544。
11.所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27，分离自农田土壤中，具有如下特征：
12.颜色呈现黄白色，形状规则呈现圆形，边缘整齐，中间隆起，较粘稠，长势较为密集旺盛。菌株呈杆状，菌体两端呈圆弧状，中部微凹；菌株生长较为旺盛，排列比较紧密。
13.含有上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂也属于本发明的保护范围。
14.所述菌剂中，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27可以以被培养的活菌、发酵液或菌悬液的形式存在。
15.作为优选，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌悬液由如下方法制备而成：
16.将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27在lb液体培养基中培养，在30℃，150r/min条件下培养24h，将培养液离心，菌体沉淀用无菌水重悬，获得菌悬液。
17.进一步的，所述菌剂中除包含枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27外，还可包括辅料或载体基质等；如海藻糖、葡萄糖、羟甲基纤维素、糊精、可溶性淀粉、草炭、硅藻土。
18.所述菌剂的剂型可以为液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散剂。
19.本发明的第二方面，提供上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27或含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂在如下(1)-(2)至少一项中的应用：
20.(1)去除环境中残留的有机磷农药；
21.(2)制备用于去除环境中残留的有机磷农药的产品。
22.优选的，所述有机磷农药为毒死蜱和噻唑膦中的一种或多种。
23.本发明的第三方面，提供上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27或含有枯草
芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
24.(1)产生生物锰氧化物；
25.(2)阻控烟草对cd的吸收；
26.(3)去除环境中重金属cd污染；
27.(4)制备用于去除环境中重金属cd污染的产品。
28.本发明的第四方面，提供上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27或含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂在促进植物生长发育中的应用。
29.进一步的，所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27或者含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂通过产氨和/或产生长素来促进植物生长发育。
30.本发明的有益效果：
31.本发明的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27能够降解毒死蜱和噻唑膦，在48h内对25mg/l毒死蜱的降解率为88.75％，能高效去除毒死蜱；在168h内对5mg/l的噻唑膦的去除率达到了50％以上，具有降解噻唑膦的效果。烟草盆栽试验，在烟草各部位cd积累量显著减少9.13％-51.43％，具有阻控烟草对cd吸收的效果；且能够产生生物锰氧化物用于环境修复；能够产生氨、生长素等物质，具有促进植物生长的作用。
32.本发明的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27能产生生物锰氧化物，集水体、土壤中农药降解、植物cd钝化、产生生物锰氧化物以及促进植物生长功能于一体，是一种多功能菌株，具有广泛的应用前景。
附图说明
33.图1为本发明菌株h27菌落形态图。
34.图2为本发明菌株h27扫描电镜图。
35.图3为本发明菌株h27的系统发育树图。
36.图4为时间对菌株h27降解毒死蜱的降解率影响。
37.图5为时间对菌株h27降解噻唑膦的降解率影响。
38.图6为菌株h27对烟草根、茎、叶中cd含量的影响。
39.图7为菌株h27产生物锰氧化物能力结果图。
40.图8为菌株h27产氨能力结果图。
41.图9为菌株h27产生长素能力结果图。
具体实施方式
42.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
43.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中，所使用的培养基的组成如下：
44.lb液体培养基：nacl 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，蒸馏水1000ml，调节ph到
7.0左右，在121℃条件下高压灭菌20min。
45.lb固体培养基：nacl 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，调节ph到7.0左右，在121℃条件下高压灭菌20min。
46.无机盐培养基：k2hpo
4 5.8g，kh2po
4 4.5g，(nh4)2so
4 2.0g，mgso
4 0.16g，cacl20.02g，na2moo
4 0.002g，feso
4 0.001g，mncl
2 0.001g，去离子水1000ml，ph调至7.0左右，121℃，高压灭菌20min。
47.含mn
2+
的k培养基：蛋白胨2.0g/l，酵母膏0.5g/l，六水氯化钴0.02g/l，七水硫酸锌0.044g/l，五水硫酸铜0.01g/l，二水钼酸钠0.013g/l，氯化钠17.55g/l，氯化钾0.74g/l，七水硫酸镁12.32g/l，无水氯化钙1.11g/l。在121℃灭菌20min。灭菌后加入0.22μm微孔滤膜过滤灭菌的1000mmol/l的mn
2+
母液以及1000mmol/l的hepes缓冲溶液，使mn
2+
和hepes缓冲液终浓度分别为1mmol/l和10mmol/l。
48.实施例1：菌株的分离和鉴定
49.1、菌株的分离筛选：
50.从山东省泰安市的农田土壤中分离毒死蜱降解菌。将采集的农田土壤采用液体培养的方法进行培养。
51.取5g土壤加入到50ml，毒死蜱浓度为100mg/l的无机盐培养基中，置于30℃，150r/min恒温摇床培养7d，以后每隔7d按10％(v/v)接种量接入新鲜毒死蜱至无机盐培养基中，以一定浓度梯度(100、250、500、750、1000mg/l)提高毒死蜱用量，至培养液浓度达到1000mg/l，如此驯化约2个月。采用平板培养方法，进行分离保存，编号保存于4℃冰箱。
52.将保存的纯化菌株接种至lb固体培养基中，划线分离单菌落。挑取单菌落至液体lb培养基中，30℃、150r/min恒温震荡培养至其对数生长期，用无菌水将培养液离心洗涤两次并使菌体重悬，得到菌悬液(od
600
＝1.0左右)。以3％(v/v)接种量将菌悬液接种至含25mg/l毒死蜱的无机盐培养基中，以不加菌液的无机盐培养基作为对照，振荡培养24h检测毒死蜱含量。
53.取无机盐培养基，加入石油醚及适量nacl，旋涡振荡90s，静置待分层，取上层石油醚溶液，过无水硫酸钠，放入进样瓶，采用安捷伦7890b高效气相色谱仪测定毒死蜱浓度。检测条件为：检测器为fid，检测器温度为300℃，进样口温度为260℃，初始温度为140℃，每分钟15℃程序升温升到200℃，保持1min；载气流量为7ml/min；压力为209kpa，恒压模式；空气流量为300ml/min，h2流量为40ml/min；尾吹流量为10ml/min；进样量为1μl，保留时间4.6min。计算毒死蜱降解率，确定降解毒死蜱能力最强的菌株，命名为h27。
54.2、菌株鉴定：
55.(1)菌落形态观察：
56.将上述获得的菌株h27进行菌落形态观察(图1)，该菌株的主要生物学特征为：
57.菌落呈现黄白色，形状规则呈现圆形，边缘整齐，中间隆起，较粘稠，长势较为密集旺盛。在扫描电镜2.40k下观察菌株(图2)，呈杆状，菌体两端呈圆弧状，中部微凹；菌株生长较为旺盛，排列比较紧密。该菌株最适降解温度25℃，培养时间48h，最适ph为7.0。
58.(2)16s rdna分子学鉴定：
59.a.菌组dna的提取：
60.无菌条件下，挑取菌株单菌落接种于lb液体培养基，在25℃、150r/min条件下，恒
温震荡培养24h，待用。
61.取1ml降解菌培养液，加入含有100μl无菌水的灭菌管中，涡旋震荡，80℃的沸水浴5min，12000r/min条件下离心5min，上层液体即降解菌基因组dna。
62.b.降解菌16s rdna的序列分析：
63.降解菌16s rdna 的pcr扩增，所用引物序列为：
64.f，5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3'；
65.r，5'-ggc tac ctt gtt acg act-3'。
66.细菌16s pcr反应体系为：
67.模板0.5μl
68.正向引物0.5μl
69.反向引物0.5μl
[0070]2×
taq mater mix 12.5μl
[0071]
无菌dd h2o 11μl
[0072]
总体积25μl
[0073]
pcr反应程序：预变性：94℃、5min；循环条件：94℃、1min；55℃、1min；72℃、1min，循环30次；后延伸：72℃、10min。反应结束后进行凝胶电泳。
[0074]
c.pcr扩增反应产物检测与测序：
[0075]
pcr扩增产物的测序工作是由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。降解菌测序结果上传至blast中的genbank，进行序列比对，分析确定降解菌种类。
[0076]
通过将菌株16s rdna序列与gen bank上其它16s rdna序列进行blast分析，发现菌株h27与枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的相似性100％(图3)。综合菌株形态特征以及16s rdna序列分析结果，鉴定菌株h27为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：
[0077]
菌种名称：枯草芽孢杆菌h27
[0078]
拉丁名：bacillus subtilis
[0079]
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0080]
保藏机构简称：cctcc
[0081]
地址：中国武汉武汉大学
[0082]
保藏日期：2023年4月18日
[0083]
保藏中心登记入册编号：cctcc no：m 2023544。
[0084]
实施例2：菌株h27发酵相关产物制备
[0085]
1、菌株h27菌悬液的制备：
[0086]
在50ml lb液体培养基中接种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27，在30℃，150r/min条件下培养24h，将培养液离心，无菌水清洗细菌沉淀三次。然后用无菌水调整菌体浓度至od
600
＝1.0左右，备用。
[0087]
实施例3：多功能菌株h27对毒死蜱的降解特性
[0088]
溶液中毒死蜱的提取：加入石油醚及适量nacl，旋涡振荡90s，静置待分层，取上层石油醚溶液，过无水硫酸钠，放入进样瓶。
[0089]
毒死蜱的测定：采用安捷伦7890b高效气相色谱仪测定毒死蜱浓度。检测条件为：
检测器为fid，检测器温度为300℃，进样口温度为260℃，初始温度为140℃，每分钟15℃程序升温升到200℃，保持1min；载气流量为7ml/min；压力为209kpa，恒压模式；空气流量为300ml/min，h2流量为40ml/min；尾吹流量为10ml/min；进样量为1μl，保留时间4.6min。计算毒死蜱降解率。
[0090]
毒死蜱降解率计算：
[0091]
式中：x：多功能菌株h27的降解率(％)；c
x
：接菌处理培养液中毒死蜱的浓度；c
ck
：未接菌对照培养液中毒死蜱的浓度。
[0092]
以乙腈(色谱纯)为溶剂，配制梯度浓度分别为0.5、1、5、10、50mg/l的毒死蜱标准溶液，在选定的气相色谱条件下进样，以毒死蜱浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标，绘制毒死蜱标准曲线，其线性方程为y＝5.029x-1.020，相关系数为0.999，以此表明毒死蜱的浓度与其峰面积有良好的线性关系。
[0093]
时间对降解菌降解率影响：以3％(v/v)接种量将实施例2制备的菌株h27菌悬液(od
600
＝1.0左右)接种到50ml，毒死蜱浓度为25mg/l的无机盐培养基中，设定的培养时间为12、24、48、72、96h，ph为7.0，恒温培养箱25℃，150r/min条件下培养，按时取样测定并记录数据，计算毒死蜱降解率。结果如图4所示，随着时间的推移，多功能菌株h27对毒死蜱的降解率不断的增大，在第48h的时候降解率趋于稳定，达到88.75％，以此说此降解菌对毒死蜱具有高效降解的效果。
[0094]
实施例4：多功能菌株h27对噻唑膦的降解特性
[0095]
溶液中噻唑膦的提取：取3ml无机盐培养液，加入0.2ml浓度为5mol/l的稀盐酸，上下颠倒使其混匀，然后加入3g nacl，使其形成nacl饱和溶液，随后加入3ml乙酸乙酯，旋涡振荡混匀2min，于5000r/min条件下离心10min，轻轻吸取上层有机相于10ml离心管中，为保证萃取完全，上续步骤需重复两次。将两次混合萃取液过无水na2so4除去水分，用移液枪吸取3ml混合萃取液于棕色试剂瓶中，用氮吹仪吹至有机溶剂挥发近干，再用等体积的乙腈溶液复溶，用一次性灭菌注射器将溶液经有机滤膜过滤，吸取样品至进样瓶，等待测定。
[0096]
噻唑膦的测定：采用岛津液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪测定噻唑膦浓度。检测条件为：
①
高效液相色谱条件采用乙腈-水体系为流动相，用shim-pack xr-odsⅱ色谱柱二元等度洗脱分离，流动相比例为乙腈：0.1％甲酸水＝55:45，柱温为室温，流速为0.20ml/min，进样体积为0.5μl，检测波长为216nm。
②
质谱条件，离子源：esi正模式；雾化气：氮气；雾化气压力40psi：离子喷射电压：4000v；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10l/min；母离子(m/z)284，子离子(m/z)104、228，驻留时间100ms，保留时间为3.0min。计算噻唑膦降解率。
[0097]
噻唑膦降解率计算：
[0098]
式中：x：多功能菌株h27的降解率(％)；c
x
：接菌处理培养液中噻唑膦的浓度；c
ck
：未接菌对照培养液中噻唑膦的浓度。
[0099]
以乙腈(色谱纯)为溶剂，配制梯度浓度分别为0.5、1、5、10、50mg/l的噻唑膦标准溶液，在选定的液质条件下进样，仪器智能计算噻唑膦浓度。
[0100]
噻唑膦降解率测定：以3％(v/v)接种量将实施例2制备的菌株h27菌悬液(od
600
＝1.0左右)接种到50ml，噻唑膦浓度为5mg/l的无机盐培养基中，设定的培养时间为24、48、72、96、120、144、168h，ph为7.0，恒温培养箱25℃，150r/min条件下培养，按时取样测定并记录数据，计算噻唑膦降解率。结果如图5所示，随着时间的推移，多功能菌株h27对噻唑膦的降解率不断的增大，在168h时候降解率达到50％以上，以此说明此多功能菌对噻唑膦具有降解的效果。
[0101]
实施例5：多功能菌株h27阻控烟草对cd的吸收
[0102]
烟草育苗：采用漂浮育苗的方式进行烟草育苗。选择饱满完整的烟草种子用镊子播入到铺满营养基质的育苗盘上，再将育苗盘置于装有水的育苗盆中培养。种子发芽前，每天用喷壶喷洒清水保证育苗盘的湿润。种子发芽后，向育苗盆中加入50g水溶肥，并适时向育苗盆中补充水分。定时观察，保证烟草的正常生长，培养40d后用于移栽盆栽试验。
[0103]
盆栽实验：取过2mm筛的天然土壤和营养基质(4:1)充分混匀，采用喷洒的方式将cd与混合土壤充分混匀并老化一周后备用。cd以3cdso4·
8h2o的形式加入，浓度梯度设置为0、1.25、2.5、5、10mg/kg。
[0104]
盆栽试验设置加菌与不加菌两种处理，并设置空白对照，每个处理三个重复。选择形态良好且长势一致的烟苗幼苗移栽至装有2kg混合土壤的塑料盆中，在盆栽移栽烟草时，采用无菌注射器接种50ml实施例2制备的菌株h27的菌悬液(od
600
＝1.0左右)到烟草根部，以等量无菌水作为对照。在山东农业大学岱宗校区温室中培养，定期浇水，40d后进行收获测定。
[0105]
将收获的烟草用清水洗净土壤后再用0.01mol/l的edta-2na浸泡清洗烟草根部。将洗净的烟草分解成根、茎、叶并于105℃杀青30min后分别装于纸袋中，65℃烘干至恒重并称量其干重。
[0106]
烟草各组织中cd含量测定：将烘干后的烟草组织用粉碎机磨碎，准确称量0.1g各组织样品放入备好的四氟坩埚中，加入混合酸(3ml浓硝酸+1ml浓盐酸+2ml高氯酸)并加盖静置过夜。电热板160℃去盖加热至酸液稍沸腾，复加盖消解2h后加热到180℃使酸挥发至黄豆颗粒大小，用1％硝酸润洗坩埚并定容至10ml，过滤后采用aas测定消解液中cd含量。
[0107]
结果如图6，测定烟草不同部位cd积累量，可观察多功能菌株h27阻控烟草吸收cd的效果。随着cd处理浓度的增加，烟草各组分对cd的吸收量也随之增加，且烟草各部位cd积累量呈现为叶》茎》根，被烟草吸收的cd大多积累在烟草的叶片部分。与相同cd处理浓度下未加菌处理相比，加菌处理的烟草各部分cd积累量均显著降低，其中根部cd积累量减少9.13％-29.32％，茎部cd积累量减少22.73-43.32％，叶部cd积累量减少34.04-51.43％，可见多功能菌株h27可有效阻控烟草对cd的吸收。
[0108]
实施例6：多功能菌株h27产生物锰氧化物能力
[0109]
以5％(v/v)接菌量将实施例2制备的菌株h27菌悬液(od
600
＝1.0左右)接种于50ml含mn
2+
的k培养基中，在摇床中于35℃下150r/min避光培养，以不加菌的含mn
2+
的k培养基作为对照，于第6d取样，取0.5ml培养后培养液，加入1ml的0.04％ lbb显色剂，观察颜色变化，定性检测样品中的生物锰氧化物。经lbb定性检测(图7)，发现多功能菌株h27培养产物具有明显的显色反应，由浅蓝色变为深蓝色，说明菌株h27能产生生物锰氧化物。则多功能菌株h27可以用于产生生物锰氧化物吸附去除重金属和降解有机污染物。
[0110]
实施例7：多功能菌株h27促进植物生长潜力的研究
[0111]
salkowski’s显色剂：1ml 0.5mol/l fecl3，50ml 35％高氯酸溶液。
[0112]
蛋白胨氨化培养基：蛋白胨5g，去离子水1000ml，ph 7.2，121℃灭菌20min。
[0113]
(1)产氨能力的测定
[0114]
取10μl实施例2制备的菌株h27菌悬液(od
600
＝1.0左右)接种至蛋白胨氨化培养基中，以未接种菌的蛋白胨氨化培养基为对照，每个处理重复3次，28
±
2℃，180rpm震荡培养5d。培养结束后，10000rpm离心10min，上清液中加入1ml纳氏试剂，观察溶液变化，若产生橙色或黄色沉淀则说明菌株具有产氨能力。结果如图8和表1所示，多功能菌株h27产氨能力强，说明菌株h27具有脱氨酶，能使氨基酸发生脱氨反应，生成氨和各种酸类，从而有利于植物生长发育。
[0115]
(2)产生长素能力的测定
[0116]
取10μl实施例2制备的菌株h27菌悬液(od
600
＝1.0左右)接种至含有5mmol/l色氨酸的lb液体培养基中，以未接种菌的含有5mmol/l色氨酸的lb液体培养基为对照，每个处理重复3次，28
±
2℃，180rpm震荡培养2d。培养结束后，10000rpm离心10min，取1ml上清液，加入等量的salkowski’s显色剂，避光静置30min使培养液显色，然后观察溶液颜色变化，若溶液变为粉色则说明菌株具有产生长素的能力，颜色越深菌株产生长素的能力越强。结果如图9和表1所示，多功能菌株h27产生长素能力较强，有利于促进植物生长发育。
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表1：h27菌株促进植物生长试验结果
[0118][0119]
注：“+”表示阳性反应，“+”越多，表示产氨、产生长素能力越强。
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综上所述，多功能菌株h27是一株能够降解有机磷农药毒死蜱和噻唑膦、阻控烟草对cd的吸收，产生生物锰氧化物以及促进植物生长作用的菌株。
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以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27，其生物保藏号为：cctcc no:m 2023544。2.含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中，所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27以被培养的活菌、发酵液或菌悬液的形式存在。4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌悬液由如下方法制备而成：将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27在lb液体培养基中培养，在30℃，150r/min条件下培养24h，将培养液离心，菌体沉淀用无菌水重悬，获得菌悬液。5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27或者权利要求2-4任一项所述的含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂在如下(1)-(2)至少一项中的应用：(1)去除环境中残留的有机磷农药；(2)制备用于去除环境中残留的有机磷农药的产品。6.根据权利要求5所述的应用，所述有机磷农药为毒死蜱和噻唑膦中的一种或多种。7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27或者权利要求2-4任一项所述的含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂在如下(1)-(4)至少一项中的应用：(1)产生生物锰氧化物；(2)阻控烟草对cd的吸收；(3)去除环境中重金属cd污染；(4)制备用于去除环境中重金属cd污染的产品。8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27或者权利要求2-4任一项所述的含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂在促进植物生长发育中的应用。9.根据权利要求7所述的应用，所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27或者含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)h27的菌剂通过产氨和/或产生长素来促进植物生长发育。

技术总结
本发明公开了一株多功能的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明从农田土壤中筛选出一株多功能的枯草芽孢杆菌H27，属于Bacillus subtilis，经试验证明该菌株能够降解有机磷农药毒死蜱和噻唑膦、阻控烟草对Cd的吸收，产生生物锰氧化物以及促进植物生长，可应用于水体、土壤中，以达到去除毒死蜱、噻唑膦、减缓Cd对植物的破坏和促进植物生长的目的。目的。目的。


技术研发人员：王金花 刘昌睿 李恕涵 张绪志 朱鲁生 王军 夏晓明 王兰君
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/9/20