一种肺癌DNA甲基化位点检测的引物组合物及其应用的制作方法

一种肺癌dna甲基化位点检测的引物组合物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于肺癌dna甲基化位点检测的引物组合物及应用。


背景技术：

[0002][0003]
肺结节是肺内占位性病变。根据其直径大小来定义，肺内直径≤3cm的类圆形或不规则形病灶，可单发或者多发，称之为肺结节。肺结节直径在0.5cm-1cm属于肺小结节，直径＞3cm则称为肿块。根据ct影像学表现，肺结节可以分为纯磨玻璃结节、混合磨玻璃结节和实性结节。纯磨玻璃结节就像磨砂玻璃一样，呈现出云絮状的阴影；实性结节则是肺内密度比较高的阴影；混合磨玻璃结节，既包含实性成分，也包含磨玻璃成分，通常实性成分在磨玻璃成分中间。胸膜凹陷征、引流线征、血管集束征、毛刺征、棘突征、分叶征、空泡和细支气管充气征等ct影像改变，都是肺结节恶变的征象。其中，恶变概率的排列顺序应该是：混合磨玻璃结节＞磨玻璃结节＞实性结节。
[0004]
国际肺癌研究协会(iaslc)提倡使用液体活检来诊断非小细胞肺癌(nsclc)。血浆游离肿瘤dna(ctdna)甲基化液体活检最大的优势就是可以在超早期通过常规手段无法检测到的情况下检测出是否有细胞癌变的可能。dna甲基化与肿瘤的发生及紧密相关，在肿瘤细胞普遍着dna甲基化状态的改变，特点是总体甲基化水平降低和局部甲基化水平的升高。而且对于早期肿瘤的发生，甲基化的修饰也起着至关重要的作用。同时相对于其他血液肿瘤标记物来说，血液ctdna甲基化稳定性更好，可以被稳定检出。因此，检测特定位点血液ctdna甲基化，可以用于推测身体内肺癌是否存在癌变，从而实现对肺癌早期诊断的目标。
[0005]
目前，肺癌ctdna甲基化的检测手段多为ngs，该方法耗时长，费用较高，需要专业人员进行生信分析，因此，不利于在基层医院临床推广。


技术实现要素：

[0006]
本发明是为了提供一种更为便捷、成本更低的肺癌检测手段，采用基于荧光探针pcr的方法，通过检测两个肺癌相关基因血浆中ctdna甲基化位点，可以有效判断早期肺癌发生情况。
[0007]
为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：
[0008]
经发明人研究发现，通过检测alx3基因和hoxc13基因中两种基因的甲基化水平，来诊断肺癌的灵敏度和特异性好，利于肺癌的早期诊断。alx3基因和hoxc13基因为hg38人类基因组中的基因。
[0009]
一种检测肺癌dna甲基化生物标记物的引物组合物在制备肺癌检测产品中的应用，甲基化生物标记物包括人类基因组中alx3基因chr1:110068116-110068395之间的cpg和hoxc13基因chr12:53927558-53927842之间的cpg。引物组合物为针对alx3基因
[0010]
chr1:110068116-110068395之间的区域设计的甲基化位点引物对和探针，以及针
对hoxc13基因chr12:53927558-53927842之间的区域设计的甲基化位点引物对和探针。
[0011]
具体一种引物组合物为：alx3基因的甲基化位点引物对的核苷酸序列为：seq id no:1(tggggcgtagttgcgc)、seq id no:2
[0012]
(ataaaaaataacgaacgaaaaaaaaacccg)，探针的核苷酸序列为seq id no:5(cgggaaataaggcgggtttttttttcgttcgtt)；hoxc13基因的甲基化位点引物对的核苷酸序列为：seq id no:3(atagtggcgggaaacgagc)、seq id no:4(ccaaaacaacgaacgaacgaacg)，探针的核苷酸序列为seq id no:6(ttagttggtcgggtcgcgttttttagttatcgtt)。其中，alx3探针的5'端标记有报告荧光基团fam，3'端标记有淬灭荧光基团bhq；hoxc13探针的5'端标记有报告荧光基团hex，3'端标记有淬灭荧光基团bhq。
[0013]
前述肺癌检测产品包括试剂盒或单独试剂。
[0014]
一种用于肺癌检测试剂盒，该试剂盒用于检测血浆ctdna中chr1:110068116-110068395之间的cpg和chr12:53927558-53927842之间的cpg的甲基化程度。该试剂盒含有前述的特异性扩增引物组合物。
[0015]
试剂盒包括上述的dna甲基化生物标记物，包括用于检测上述的肺癌的生物标志物的甲基化水平的试剂，以及还包括上述甲基化生物标记物的引物组合物。
[0016]
该试剂盒采用甲基化特异性pcr法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化荧光法、甲基化特异性高效液相层析法或数字pcr法检测alx3基因和hoxc13基因两种基因的甲基化水平。
[0017]
上述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、pcr反应试剂和测序试剂中的至少一种。核酸提取试剂用于提取核酸；甲基化转化试剂用于将dna中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；质控试剂用于质控；pcr反应试剂用于构建pcr扩增反应体系；核酸测序试剂用于测序。甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。质控试剂包括阳性参考品和阴性参考品。可选地，阳性参考品采用人甲基化基因组dna，阴性参考品采用人非甲基化基因组dna。
[0018]
pcr反应试剂包括pcr缓冲液、dntp、mgcl2和taqdna聚合酶。
[0019]
循环肿瘤dna(ctdna)是肿瘤患者血液中游离的来自肿瘤细胞的dna，肿瘤细胞坏死或者凋亡后，细胞中的dna释放进入循环系统，游离地存在于血液当中。通过检测ctdna的相关基因甲基化状态，可以获知体内肿瘤组织信息，从而为肿瘤诊断提供依据。血浆中的游离dna能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在血浆中的含量极低，因此，存在灵敏度较低的问题。使用上述的检测试剂，能够使用血浆中的游离dna作为样本进行检测，具有较高的灵敏度和准确性。
[0020]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021]
本发明通过研究血浆ctdna特定cpg位点上的dna甲基化修饰在肺癌患者疾病的人群中的甲基化差异，得知dna甲基化标记物能够作为肺癌诊断标记物。本发明通过检测两个与肺癌相关的特异性甲基化标志物，灵敏度高，特异性好，能够显著提高肺癌的检出率，相较ngs检测，大幅减低检测成本。并鉴于血浆检测的无创性，适于大规模推广应用。
附图说明
[0022]
图1是tcga数据库中肺癌组织和肺正常组织alx3基因cg18786873位点的对比图。
[0023]
图2是tcga数据库中肺癌组织和肺正常组织hoxc13基因cg07915921位点的对比图。
[0024]
图3是阳性参考品alx3 pcr扩增曲线图。
[0025]
图4是阳性参考品hoxc13 pcr扩增曲线图。
[0026]
图5是阴性参考品alx3 pcr扩增曲线图。
[0027]
图6是阴性参考品hoxc13 pcr扩增曲线图。
[0028]
图7是肺癌血浆alx3 pcr扩增曲线图。
[0029]
图8是肺癌血浆hoxc13 pcr扩增曲线图。
[0030]
图9是正常血浆alx3 pcr扩增曲线图。
[0031]
图10是正常血浆hoxc13 pcr扩增曲线图。
具体实施方式
[0032]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实施例中，核酸提取试剂(qiaamp minelute ccfdna kits)购自于qiagen，甲基化转化试剂盒购自于zymo；pcr缓冲液、dntp、taqdna聚合酶购自于promega公司；mgcl2购自于sigma公司；引物探针由上海生工有限公司合成；荧光定量pcr仪为biorad cfx96。其他原材料如无特别说明均可以从公开商业途径获得。
[0034]
实施例1
[0035]
本发明基于tcga公共数据库肺癌患者的illumina450k甲基化芯片数据，其中肺癌样本842例，正常肺组织样本73例。根据肿瘤组织和正常组织进行甲基化程度差异分析，结果如图1和图2所示，鉴定得到cg18786873(位于alx3基因)和cg07915921(位于hoxc13基因)是甲基化差异显著的位点，且在正常肺组织中甲基化水平极低(平均值小于0.1)。
[0036]
分别对上述两个甲基化位点上下游的140bp的区域内进行甲基化pcr引物和探针设计。分别得到alx3基因引物seq id no:1(tggggcgtagttgcgc)、引物seq id no:2(ataaaaaataacgaacgaaaaaaaaacccg)，探针序列seq idno:5(cgggaaataaggcgggtttttttttcgttcgtt)和hoxc13基因seq id no:3(atagtggcgggaaacgagc)、seq id no:4(ccaaaacaacgaacgaacgaacg)，探针序列seq id no:6(ttagttggtcgggtcgcgttttttagttatcgtt)。
[0037]
实施例2
[0038]
本实施例肺癌检测的流程如下：
[0039]
(1)提取dna样品；
[0040]
(2)将提取得到的dna进行甲基化转化得到转化后的dna样品；
[0041]
(3)将得到的dna样品进行甲基化特异性pcr反应，并对结果分析。
[0042]
详细步骤如下：
[0043]
一、引物对和探针
[0044]
用于检测alx3基因甲基化状态的核苷酸序列如seq id no：1和seq idno：2所示的alx3引物对、和核苷酸序列如seq id no：5所示的alx3探针；
[0045]
用于检测hoxc13基因甲基化状态的核苷酸序列如seq id no：3和seq id no：4所示的hoxc13引物对、和核苷酸序列如seq id no：6所示的hoxc13探针；
[0046]
其中，alx3探针的5'端标记有报告荧光基团fam，3'端标记有淬灭荧光基团bhq；hoxc13探针的5'端标记有报告荧光基团hex，3'端标记有淬灭荧光基团bhq。
[0047]
表1
[0048][0049]
二、样本准备
[0050]
阳性参考品采用人甲基化基因组dna(购自merck)，阴性参考品采用人非甲基化基因组dna(购自merck)；待处理样本为1例确诊肺癌患者的血浆样本、和1例正常健康人的血浆样本。
[0051]
三、dna提取
[0052]
血浆样本的dna提取方法均是包括但不限于如下步骤：
[0053]
1.在15ml试管中混合下列组分(3毫升血浆，磁珠溶液90μl(来自qiagen核酸提取试剂)，蛋白酶k165μl(来自qiagen核酸提取试剂)，磁珠结合缓冲液450μl(来自qiagen核酸提取试剂)；在室温(15
–
25℃)下孵育10分钟，同时缓慢上下摇晃试管。
[0054]
2.短暂离心(400rpm 30秒)以去除试管盖子中的任何溶液。将装有珠子溶液的管子放在15ml磁力架上。孵育至少1分钟，直到溶液澄清。丢弃上清液。
[0055]
3.从15ml磁力架上取下试管。将200μl磁珠洗脱缓冲液(来自qiagen核酸提取试剂)添加到试管内的磁珠中，移液枪吹打混合。上下移液以混合并冲洗管壁。将珠子混合物转移到磁珠洗脱管(来自qiagen核酸提取试剂)中。在室温下在热混合器上孵育5分钟。
[0056]
4.将装有磁珠溶液的磁珠洗脱管放在2ml磁力架上。孵育至少1分钟，直到溶液澄清。
[0057]
5.将上清液转移到新的磁珠洗脱管中并丢弃磁珠。向上清液中加入300μl acb缓冲液(来自qiagen核酸提取试剂)；移液枪吹打混合。短暂离心30秒。
[0058]
6.将第5步的混合物上样至qiaamp ucp洗脱柱(来自qiagen核酸提取试剂)并以8000rpm离心1分钟。将qiaamp ucp洗脱柱放入干净的2ml收集管中，并丢弃洗脱的液体。
[0059]
7.向qiaamp ucp洗脱柱中加入500μl缓冲液acw2(来自qiagen核酸提取试剂)；以8000rpm离心1分钟。将qiaamp ucp洗脱柱放入干净的2ml收集管中；丢弃洗脱的液体。14000rpm全速离心3分钟。
[0060]
8.将qiaamp ucp洗脱柱放入干净的1.5ml洗脱管(来自qiagen核酸提取试剂)中；丢弃步骤7中的2ml收集管。打开盖子；56℃孵育3分钟。
[0061]
9.将50μl蒸馏水加到qiaamp ucp洗脱柱的膜中心。盖上盖子；室温孵育1分钟。14000rpm全速离心1分钟。最后蒸馏水内即为dna样品。
[0062]
四、亚硫酸盐转化
[0063]
各个样本的dna亚硫酸盐转化的步骤均是包括但不限于如下：
[0064]
1.在dna样品中用蒸馏水将总体积调整至50μl。通过轻弹或上下移液来混合样品。
[0065]
2.将样品在37℃下孵育15分钟。
[0066]
3.经过上述孵育后，每份样品中加入100μl制备好的亚硫酸盐转化试剂(来自zymo甲基化转化试剂盒)。
[0067]
4.样品在50℃下避光孵育12-16小时。
[0068]
5.将400μl结合缓冲液1(来自zymo甲基化转化试剂盒)添加到离心柱(来自zymo甲基化转化试剂盒)中，然后将离心柱放入提供的收集管中。
[0069]
6.将样品(来自步骤5)加载到包含结合缓冲液1(来自zymo甲基化转化试剂盒)的离心柱中。盖上盖子并通过多次颠倒柱子来混合。
[0070]
7.14000rpm全速离心30秒。
[0071]
8.向柱中加入100μl洗脱缓冲液(来自zymo甲基化转化试剂盒)。14000rpm全速离心30秒。
[0072]
9.向柱子中加入200μl去硫酸盐缓冲液(来自zymo甲基化转化试剂盒)并在室温(20-30℃)下静置15-20分钟。孵育后，14000rpm全速离心30秒。
[0073]
10.向柱中加入200μl洗脱缓冲液(来自zymo甲基化转化试剂盒)。全速离心30秒。再加入200μl洗脱缓冲液并14000rpm全速离心30秒。
[0074]
11.将柱放入1.5ml微量离心管中。将10μl蒸馏水直接添加到柱矩阵中。14000rpm全速离心30秒以洗脱dna。最后10μl蒸馏水内即含有亚硫酸盐转化后的样品dna。
[0075]
五、甲基化特异性pcr反应
[0076]
各个样本的甲基化特异性pcr反应均是包括但不限于如下步骤：
[0077]
1.甲基化特异性pcr反应液的配制
[0078]
根据实验数量，按下表配制alx3+hoxc13基因甲基化反应体系。下表为单个样本的反应体系。
[0079]
表2
[0080]
组分用量seqid1(100μm)0.005μlseqid2(100μm)0.005μlseqid5(100μm)0.004μl(fam)seqid3(100μm)0.005μlseqid4(100μm)0.005μlseqid6(100μm)0.004μl(hex)2xgotaq(taqdna聚合酶，dntp，缓冲液)5μlmgcl2(50μm)0.4μlddh2o4.172μl亚硫酸盐转化后的样品dna样品(2.5ng/μl)0.4μl
总计10μl
[0081]
2.荧光定量甲基化特异性pcr检测
[0082]
1)在pcr机器的荧光通道中选择fam和hex共2个通道。
[0083]
2)反应条件设定如下表所示(反应体积设定为10μl)：
[0084]
表3
[0085][0086]
3.甲基化特异性pcr检测
[0087]
1)将步骤1中的配置好的反应体系，移至96孔版中(购自biorad)。
[0088]
2)将96孔版放入pcr仪器中。
[0089]
3)按步骤2中设定的反应条件进行甲基化特异性pcr反应。
[0090]
每个样本分成三份，作为pcr技术重复。当其中≥2份为阳性时，则将该样本归类为阳性，否则为阴性。
[0091]
六、结果分析
[0092]
1.甲基化特异性pcr结果分析
[0093]
反应结束后自动保存结果，使用自动导出扩增曲线图，如果pcr扩增中任一通道有扩增曲线，则统计pcr仪器显示的ct值，ct值的大小反映所检基因的相对含量。甲基化特异性pcr结果如图3到图10所示。图3是阳性参考品alx3 pcr扩增曲线图。图4是阳性参考品hoxc13 pcr扩增曲线图。图5是阴性参考品alx3 pcr扩增曲线图。图6是阴性参考品hoxc13 pcr扩增曲线图。图7是肺癌血浆alx3 pcr扩增曲线图。图8是肺癌血浆hoxc13pcr扩增曲线图。图9是正常血浆alx3 pcr扩增曲线图。图10是正常血浆hoxc13 pcr扩增曲线图。
[0094]
图3到图10的扩增曲线图中，横坐标表示循环次数，纵坐标为荧光信号值。每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的阈值循环数(cycle threshold)为ct值。
[0095]
2.检测结果判定
[0096]
当fam和hex通道任意一个的ct≦40时结果为阳性，说明具有肺癌风险高，当fam和hex通道的ct》40或未检出时结果为阴性，说明具有肺癌风险低。
[0097]
3.本实施例检测结果
[0098]
(1)alx3和hoxc13基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、和肺癌样本中均检出，结果为阳性。具体结果见下表。
[0099]
表4
[0100]
[0101][0102]
由上述检测结果可知，alx3基因和hoxc13基因引物对及对应的探针可以用于肺癌的检测。
[0103]
另外，用于检测alx3基因和hoxc13基因甲基化水平的引物对均不限于上述实施例，还可以是针对上述基因的其他区段或上述区段设计的其他引物对。与检测引物对对应的检测探针不限于上述实施例，还可以是其他核酸片段。检测探针上连接有荧光基团和淬灭基团。荧光基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。可选地，检测探针上连接有荧光基团分别独立的选自fam、hex、vic、cy5、rox、texsa red、joe及quasar 705中的一种。应当理解的是，检测探针上连接的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
[0104]
上述实施例检测采用甲基化特异性pcr法，还可以采用亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化荧光法、甲基化特异性高效液相层析法或数字pcr法。
[0105]
在本实施方式中，检测的样本为血液。可以理解的是，在其他实施方式中，还可以是其他生物样本。例如细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞中的一种或多种。
[0106]
实施例3
[0107]
本实施例基于从2020年12月到2021年9月在重庆医科大学附属第一医院的受试者444例纳入本研究。病理确诊为肺癌患者血浆样本172例，穿刺活检病理确诊为良性肺结节患者血浆样本117例，健康人血浆样本155例(从健康管理中心体检部选取；经胸部x光或薄层计算机断层扫描证实，无肺结节，无恶性肿瘤病史)。本研究符合《赫尔辛基宣言》并经伦理委员会批准。采用实施例2的引物对及对应的探针分别对这些临床样本进行检测，具体步骤如实施例2所示，检测结果如下表表5所示。表5为alx3基因加hoxc13基因甲基化检测结果。表5中，灵敏度采用肺癌阳性率来表征，灵敏度(％)＝阳性样本数/总检测样本数；特异性采用良性结节和健康人的阴性率来表征，特异性(％)＝阴性样本数/总数检测样本数。
[0108]
表5
[0109][0110]
同时检测alx3基因和hoxc13基因2个基因的甲基化水平时，对肺癌的灵敏度为97.09％，特异性为88.89％-92.90％。
[0111]
由上述可知，alx3基因和hoxc13基因的甲基化水平的检测对肺癌的灵敏度可以达到95％以上，特异性能达到90％以上，可以为肺癌的筛查诊断提供参考。并且，与常规的肺
癌诊断方法相比，采用上述实施例的方法进行筛查时，利用的是dna提取、甲基化转化和qpcr相关联技术，可以对人肺癌进行早期无创筛查诊断。

技术特征：
1.一种检测肺癌dna甲基化生物标记物的引物组合物在制备肺癌检测产品中的应用，其特征在于，所述甲基化生物标记物包括人类基因组中alx3基因chr1:110068116-110068395之间的cpg和hoxc13基因chr12:53927558-53927842之间的cpg；所述引物组合物为针对alx3基因chr1:110068116-110068395之间的区域设计的甲基化位点引物对和探针，以及针对hoxc13基因chr12:53927558-53927842之间的区域设计的甲基化位点引物对和探针。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，引物组合物为：alx3基因的甲基化位点引物对的核苷酸序列为：seq id no:1、seq id no:2，探针的核苷酸序列为seq id no:5；hoxc13基因的甲基化位点引物对的核苷酸序列为：seq id no:3、seq idno:4，探针的核苷酸序为seq id no:6。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肺癌检测产品包括试剂盒或单独试剂。4.一种用于肺癌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测血浆ctdna中chr1:110068116-110068395之间的cpg和chr12:53927558-53927842之间的cpg的甲基化程度。5.根据权利要求4所述的用于肺癌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1或2所述的引物组合物。

技术总结
本发明公开了一种肺癌DNA甲基化位点检测的引物组合物及其应用，属于生物技术检测技术领域。该发明公开了两个与肺癌相关的特异性甲基化标志物及引物组合物，采用基于荧光探针PCR的方法，通过检测血浆中肺癌相关ALX3基因和HOXC13基因ctDNA甲基化水平，可以有效判断早期肺癌发生情况。本发明通过检测两个与肺癌相关的特异性甲基化标志物，灵敏度高，特异性好，能够显著提高肺癌的检出率，相较NGS检测，大幅减低检测成本。并鉴于血浆检测的无创性，适于大规模推广应用。适于大规模推广应用。适于大规模推广应用。


技术研发人员：马辰凯 王燕虹 李进
受保护的技术使用者：苏州朗希康生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/9/20