一种石油降解微生物复合菌剂、复合菌剂培养基、制备方法和使用方法及用途

1.本发明涉及石油污染治理技术领域，具体而言，涉及一种石油降解微生物复合菌剂、复合菌剂培养基、制备方法和使用方法及用途。


背景技术：

2.石油工业是当今世界评价国家国力的一项重要指标，随着石油化工行业的蓬勃发展及石油产品的广泛使用，石油污染已经成为一种世界性的公害。中国作为石油生产和消费大国，石油污染问题相当突出，尤其是土壤的石油污染问题最为严重。根据《全国土壤污染状况调查公告》显示，我国土壤总超标率高达16.1%，其中有机类污染物，特别是石油污染物已成为导致土壤安全问题的重要因素之一。
3.石油可分为四个主要部分，分别为饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质，伴随生物放大作用，它们会对生态系统造成广泛和永久性的破坏，石油类污染物会对环境中生命造成窒息、缺氧、生长迟缓、代谢反应紊乱和激素失衡等直接或间接影响。饱和烃和芳香烃是易生物降解的组分，其中正十二烷、正十六烷、菲和芘是常见的石油类污染物。相比于传统物理和化学修复方法，微生物修复因具有绿色经济、环境影响小等优势，在石油污染的环境修复方面有广泛的应用前景。
4.微生物修复技术是一种利用微生物自身具有的代谢降解作用，将土壤中石油污染物降解成无害物质的方法。微生物修复技术具有较好的修复土壤污染的潜力，可以分别为生物强化法、生物刺激法和自然衰减法。其中生物强化法是指通过添加具有特定分解代谢活性的菌株，从而提高土壤中的石油降解率。但是，由于石油组成复杂且毒性较强，没有单一的细菌菌株具有足够的代谢能力可以有效地降解石油的所有成分，同时受土壤复杂结构的限制，外源微生物在土壤中适应性较差，研发有效针对多组分的石油类污染物的微生物复合菌剂，并在土壤污染场地的修复中发挥高效的修复效果是一个亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种石油降解微生物复合菌剂、复合菌剂培养基、制备方法和使用方法及用途。
6.为实现本发明的目的，采用以下技术方案：本发明提供一种石油降解微生物复合菌剂，包括罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌。
7.所述罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的质量比为1~5:1~3:1。
8.具体的，所述罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的质量比为1~3:1:1。
9.优选地，所述罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的菌体质量比为2:1:1。
10.优选地，所述微生物复合菌剂呈固体粉末形式。
11.本发明中的菌种均从石油污染土壤中分离筛选得到。其中，罗尔斯通氏菌，拉丁名
称：ralstonia sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），菌种保藏编号cctcc no: m 2023177，可用于处理石油污染；根瘤菌，拉丁名称：rhizobium sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），菌种保藏编号cctcc no: m 2023178，可用于处理石油污染；不动杆菌，拉丁名称：acinetobacter sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），菌种保藏编号cctcc no: m 2023179，可用于处理石油污染。
12.所述的石油降解微生物复合菌剂的制备方法，将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的菌体混合，经冷冻干燥得到所述石油降解微生物复合菌剂。
13.具体的，将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌分别用培养基纯培养后，离心收集菌体，再混合。
14.所述培养基包括0.1~1.0 g/l mgso4·
7h2o、0.01~0.2g/l cacl2、0.001~0.01 g/lfeso4·
7h2o、1.0~2.0 g/l kh2po4、0.5~2.0 g/l na2hpo4、0.01~0.1 g/l mnso4、0.5~2.0 g/l nh4cl；所述培养基还包括碳源；培养基中的碳源没有特殊要求，能够为细菌的复制提供营养物质的碳源均可。
15.具体的，所述碳源选自牛肉膏、酵母浸粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、石油烃中一种或者几种。
16.碳源在所述培养基中的浓度为1~10 g/l或者0.1~0.5 g/l。
17.所述培养基ph为6.0-8.0，溶剂为无菌水。
18.具体的，所述培养基选自1~10g/l的牛肉膏、1~10 g/l的酵母浸粉、1~10 g/l的葡萄糖、1~10 g/l的蔗糖、1~10 g/l的果糖、1~10 g/l的淀粉或者0.1~0.5 g/l的石油烃。
19.具体的，所述石油烃为模拟石油；所述模拟石油包括菲、芘、正十二烷和正十六烷。
20.具体的，菲、芘、正十二烷和正十六烷在培养基中的浓度均为50 mg/l。
21.具体的，所述培养基包括0.1~0.2 g/l mgso4·
7h2o、0.01~0.02 g/l cacl2、0.001~0.002 g/lfeso4·
7h2o、1.0~1.5 g/l kh2po4、0.5~1.0 g/l na2hpo4、0.01~0.02 g/l mnso4、0.5~1.0 g/l nh4cl。
22.所述冷冻干燥过程为：首先在-10~-20 ℃冷冻4~6 h，然后在-40~-60 ℃，10pa真空度下冷冻干燥20~24 h。
23.所述冷冻干燥过程的冻干保护液按质量含量包含脱脂奶粉5~10%、蔗糖5~10%、甘露醇1~1.5%，余量为无菌水。
24.所述的石油降解微生物复合菌剂在降解土壤中石油污染物中的应用。
25.具体的，所述石油污染物包含正十二烷、正十六烷、菲和芘。
26.具体的，所述石油污染物中十二烷、正十六烷、菲、芘的浓度比为1~2:1~2:1:1。
27.具体的，所述石油污染物包含等浓度比的正十二烷、正十六烷、菲、芘。
28.所述的石油降解微生物复合菌剂修复石油污染土壤的方法，将石油降解微生物复合菌剂用无菌水重悬后，以质量比1:10~30的投加量加入到石油污染土壤中，混匀；之后将石油降解微生物复合菌剂每20~30 d以质量比1:10~30的投加量加入到石油污染土壤中。
29.具体的，将石油降解微生物复合菌剂每20~30 d以质量比为1:10~30的投加量均匀注入到石油污染土壤的表层、表层下10 cm、表层下20 cm处。
30.具体的，首次投加时，石油降解微生物复合菌剂采用与土壤混匀的方式或者以质
量比为1:10~30的投加量均匀注入到石油污染土壤的表层、表层下10 cm、表层下20 cm处。
31.具体的，所述石油降解微生物复合菌剂以固体粉末形式冷冻保存。
32.具体的，将固体粉末状石油降解微生物复合菌剂于4℃~-80℃密封保存。
33.具体的，石油降解微生物复合菌剂储存1个月后，菌体浓度＞10
10
cfu/g。
34.具体的，一种石油降解微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：（1）将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌菌种分别在培养基中进行扩大培养至菌体浓度＞10
10
cfu/g，将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌按照2:1:1的质量比混合均匀，得混合菌种；（2）在无菌操作台中，向步骤（1）所得的混合菌种中加入冻干保护液，并混合均匀，得到菌体混合溶液；（3）将步骤（2）所得的菌体混合溶液置于-20℃冰箱中冷冻4h，再将其使用冷冻干燥机进行冷冻干燥20 h，得到固体粉末状的石油降解微生物复合菌剂，并在-20 ℃条件下密封保存。
35.优选地，步骤（1）中，培养基的配方如下：0.2 g/l mgso4·
7h2o、0.02 g/l cacl2、0.001 g/l feso4·
7h2o、1.5 g/l kh2po4、1.00 g/l na2hpo4、0.02g/l mnso4、1 g/l nh4cl，200 mg/l模拟石油，溶剂为无菌水。
36.优选地，所述模拟石油的组成如下：50 mg/l菲，50 mg/l芘，50 mg/l正十二烷，50 mg/l正十六烷。
37.优选地，步骤（1）中，所述培养基的ph为7。
38.优选地，步骤（1）中，扩大培养的温度为30 ℃。
39.优选地，步骤（2）中，所述冻干保护液的配方如下：脱脂奶粉10%、蔗糖5%、甘露醇1%（均为质量分数），其余为无菌水。
40.优选地，步骤（3）中，冷冻干燥条件为-60 ℃，10 pa真空度。
41.本发明还提供了上述石油降解微生物复合菌剂在降解石油污染物中的应用。
42.优选地，所述石油降解菌剂对石油污染物的降解条件为15~40 ℃。
43.本发明还提供了上述石油降解复合菌剂修复石油污染土壤的方法，包括以下步骤：将石油降解微生物复合菌剂固体粉末用无菌水重悬后，投加到石油污染土壤中混匀，并以相同的投加量周期性均匀注入到石油污染土壤的不同深度。
44.优选地，上述石油降解微生物复合菌剂的投加量与土壤的质量比为1:20。
45.优选地，上述石油降解微生物复合菌剂的投加周期为每20 d投加一次。
46.优选地，上述石油降解微生物复合菌剂注入石油污染土壤的不同深度分别为表层、表层下10 cm和表层下20 cm。
47.优选地，在所述降解过程中，保持土壤含水量为10%~20%。
48.优选地，所述土壤中石油污染物的总浓度为10000~20000 mg/kg。
49.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供一种石油降解微生物复合菌剂，包括罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌。该石油降解微生物复合菌剂的三种菌之间相互协同作用，将石油类污染物作为碳源用于自身的繁殖生长，直接降解石油类污染物，环境适应性强。
50.本发明提供的用于培养上述石油降解微生物复合菌剂的培养基，可以用于罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的繁殖生长，提供每种菌生长所需的营养物质，实现三种菌可以使用同一种培养基培养，简化培养操作。
51.本发明提供的上述石油降解微生物复合菌剂的制备方法，将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌混合均匀，制备得到固体粉末形态的石油降解微生物复合菌剂，在保存一个月后活菌数大于10
10
cfu/g，微生物活性保持效果好，便于运输和贮存。
52.本发明提供的上述石油降解微生物复合菌剂的使用方法，周期性将其注入石油污染土壤中，既保证了外源微生物在污染土壤中的活性维持，又无二次污染，为微生物修复石油污染土壤的实际运用提供了技术支持。
附图说明
53.图1为本发明罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的扫描电镜成像图。
54.图2为本发明罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌对四种石油类污染物的降解效果图。
55.图3为本发明石油降解微生物复合菌剂的固体粉末形态图。
56.图4为本发明石油降解微生物复合菌剂在不同温度条件下储存一个月后的存活菌数。
57.图5为本发明石油降解微生物复合菌剂加入石油污染土壤后，土壤中石油类污染物浓度变化图。
具体实施方式
58.以下结合附图和实施例来进一步说明本发明，但所描述的实施例，并不用于限定本发明。
59.实施例1 石油降解菌罗尔斯通氏菌（ralstoniasp.）、根瘤菌（rhizobium sp.）和不动杆菌（acinetobacter sp.）的分离和鉴定。
60.土壤样品采集自辽宁省盘锦市辽河油田采油区长期受石油污染的土壤，称取10.0 g土壤，加入到100ml含石油类化合物（100 mg/l）的无机盐液体培养基中，30 ℃，150 r/min恒温摇床富集培养10d。取5 ml富集液至新的100 ml含石油类化合物（200 mg/l）的无机盐液体培养基中继续培养10d。将第二轮富集培养液进行梯度稀释，稀释倍数为10
1-107，取200 μl稀释液在含石油化合物（200 mg/l）的固体无机盐培养基上涂布，30 ℃培养5 d。挑取单一菌落在上述固体无机盐培养基上划线分离纯化。分别将单一菌落接种到含石油类化合物（200mg/l）的液体无机盐培养基中进行降解实验，考察每株菌对石油类化合物的降解能力。
61.无机盐液体培养基的组成为：0.2 g/l mgso4·
7h2o、0.02 g/l cacl2、0.001 g/l feso4·
7h2o、1.5 g/l kh2po4、1.00 g/l na2hpo4、0.02g/l mnso4、1 g/l nh4cl，溶剂为无菌水，ph 6.0~8.0。
62.无机盐固体培养基的组成为：0.2 g/l mgso4·
7h2o、0.02 g/l cacl2、0.001 g/l feso4·
7h2o、1.5 g/l kh2po4、1.00 g/l na2hpo4、0.02g/l mnso4、1 g/l nh4cl，20g/l琼脂，溶剂为无菌水，ph 6.0~8.0。
63.无机盐液体培养基和无机盐固体培养基中的石油类化合物包括正十二烷、正十六
烷、菲和芘。正十二烷、正十六烷、菲和芘在无机盐培养基中的浓度相同。
64.培养基均在配制后立即置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。
65.挑取对石油类化合物降解效率最高的三株菌株至前述无机盐固体培养基平板上，在恒温培养箱中30 ℃倒置培养5 d，菌株1菌落呈圆形，红棕色，菌株2菌落呈圆形，白色，菌株3菌落呈圆形，白色。收集适量培养好的细菌，用前述无机盐液体培养基冲洗后，用2.5%戊二醛溶液固定2 h，乙醇逐级脱水，最后冷冻干燥，飞纳phenom台式扫描电镜观察如图1所示，菌株1菌体细胞呈短杆状，大小约为0.2-0.3
×
0.9-1.4 μm，菌株2菌体细胞呈杆状，大小约为0.5-0.7
×
1.4-2.0 μm，菌株3菌体细胞呈短杆状，大小约为0.3-0.4
×
0.5-0.6 μm。
66.分别提取上述三株菌株的总dna，采用细菌16s rdna扩增通用引物27f (5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’) 和1492r (5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增。pcr反应条件为94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 sec，55 ℃ 45 sec，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃10 min。测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。测序结果经blast比对分析可知，所得菌株1与罗尔斯通氏菌（ralstoniasp.）具有较高同源性，菌株2与根瘤菌（rhizobium sp.）具有较高同源性，菌株3与不动杆菌（acinetobacter sp.）具有较高同源性。
67.综合上述的形态与分子鉴定结果，本发明筛选得到的菌株经鉴定分别为罗尔斯通氏菌（ralstonia sp.）、根瘤菌（rhizobium sp.）和不动杆菌（acinetobacter sp.），均已于2023年02月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为cctcc no: m 2023177、cctcc no: m 2023178、cctcc no: m 2023179，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
68.实施例2 罗尔斯通氏菌（ralstoniasp.）、根瘤菌（rhizobium sp.）和不动杆菌（acinetobacter sp.）对石油类污染物的降解实验将罗尔斯通氏菌（ralstoniasp.）、根瘤菌（rhizobium sp.）和不动杆菌（acinetobacter sp.）分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中30℃、150r/min恒温振荡扩繁培养48h。取培养液，20℃、8000r/min离心8min，弃去上清液收集菌体，用无菌水清洗菌体两次后，用无机盐液体培养基重悬菌体制备成菌悬液，od
600
为1.0左右。
69.以安捷伦气相色谱仪gc6890对石油类化合物样品进行检测，色谱柱为hp-5ms ui（30 m
×
0.250 mm
×
0.25 μm)，采用程序升温，初始柱温40℃，以10 ℃/min升至300 ℃，进样口温度290 ℃，fid检测器温度230 ℃，进样量1 μl，载气（高纯氮气）流量45 ml/min，氢气流速100 ml/min，空气流速250 ml/min。
70.将前述制备的菌悬液分别接种至无机盐液体培养基中，分别添加浓度均为100 mg/l的正十二烷、正十六烷、菲和芘。控制接种菌体终浓度为od
600
=0.1，30 ℃，150 r/min条件下恒温摇床培养96h后，使用gc检测培养液中石油类化合物的残留量。结果如图2所示，在上述实验条件下，罗尔斯通氏菌（ralstoniasp.）对正十二烷和正十六烷的去除率均达到100%，亦可降解菲和芘，去除率分别为92.45%和62.81%，根瘤菌（rhizobium sp.）对正十二烷和正十六烷的去除率均达到100%，亦可降解菲和芘，去除率分别为95.43%和77.52%，不动杆菌（acinetobacter sp.）对正十二烷和正十六烷的去除率均达到100%，亦可降解菲和芘，去除率分别为97.34%和69.78%。本发明的罗尔斯通氏菌（ralstoniasp.）、根瘤菌（rhizobium sp.）和不动杆菌（acinetobacter sp.）均具有良好的降解石油化合物能力，这使该三种菌株在石油污染物的降解修复方面具有广阔的应用前景。
71.实施例3 石油降解微生物复合菌剂的制备及低温储存
72.本实施例中的石油降解微生物复合菌剂的制备和储存方法，具体步骤如下：（1）将罗尔斯通氏菌（ralstoniasp.）、根瘤菌（rhizobium sp.）和不动杆菌（acinetobacter sp.）分别在培养基中进行扩大培养至菌体浓度＞10
10
cfu/g。培养基配方为：0.2 g/l mgso4·
7h2o、0.02 g/l cacl2、0.001 g/lfeso4·
7h2o、1.5 g/l kh2po4、1.00 g/lna2hpo4、0.02g/l mnso4、1 g/lnh4cl、50 mg/l菲，50 mg/l芘，50 mg/l正十二烷，50 mg/l正十六烷，溶剂为无菌水，调节ph值为7.0，培养基于121℃灭菌20min。
73.（2）将步骤（1）得到的菌液，在4℃，8000r/min条件下离心8min，在无菌操作台中弃去清液，收集菌体。将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的菌体按照2:1:1的质量比混合，并加入冻干保护液混合均匀，得到菌体混合溶液。冻干保护液配方为：脱脂奶粉10%、蔗糖5%、甘露醇1%（均为质量分数），其余为无菌水。
74.（3）将步骤（2）所得的菌体混合溶液置于-20 ℃冰箱中冷冻4 h，再将其使用冷冻干燥机，在-60 ℃，10 pa真空度条件下冷冻干燥20 h，得到固体粉末状的石油降解微生物复合菌剂，如图3所示。
75.（4）将步骤（3）所得的石油降解微生物复合菌剂分别在4℃、-20℃、-80℃条件下低温储存。储存1个月后，使用平板计数方式计量石油降解微生物复合菌剂的活菌数。以无菌操作将石油降解微生物复合菌剂用无菌水重悬，再用无菌水按10倍数作系列稀释，稀释倍数至10
10
，用无菌移液枪吸取1ml充分混匀的水样，注入无菌平皿中，再倾倒入30 ml已融化并冷却到45 ℃的营养琼脂培养基，迅速转动，使水样与培养基充分混匀。营养琼脂培养基配方为：酵母浸粉5.0 g/l、蛋白胨10.0 g/l、氯化钠5.0 g/l、琼脂粉20.0 g/l，溶剂为无菌水。置水平位置静置凝固后，倒置于30 ℃下培养48 h，待菌落生长好后取出平皿计数，统计出同一稀释度一个平皿上菌落的平均数，根据公式计算活菌数。公式为：每g菌剂中活菌总数=同一稀疏度的菌落平均数
×
稀释倍数/菌剂重量。得到石油降解微生物复合菌剂分别在4 ℃、-20 ℃、-80 ℃条件下低温储存1个月后的活菌数如图4所示均＞1.0
×
10
10
cfu/g，分别为1.29
×
10
10
cfu/g、1.35
×
10
10
cfu/g、1.14
×
10
10
cfu/g。本实施例中的石油降解微生物复合菌剂具有良好的储存性能。
76.将步骤1中的模拟石油换成1g/l牛肉膏、5g/l酵母浸粉、10g/l葡萄糖、0.5g/l石油烃，制备的石油降解微生物复合菌剂均具有良好的储存性能。
77.实施例4 石油降解微生物复合菌剂在无机盐液体培养基中的石油降解效果
78.以实施例3中的方式，制备石油降解微生物复合菌剂。将复合菌剂分别用100 ml无机盐液体培养基
①
、
②
、
③
、
④
重悬，制备成菌悬液，od
600
为1.5左右，加入模拟石油，使模拟石油在培养基中的总浓度为200 mg/l，30 ℃，150 r/min条件下恒温摇床培养7 d后，以实施例2中方式使用gc检测摇瓶中石油类化合物的残留量。
79.无机盐液体培养基
①
中包含0.1 g/l mgso4·
7h2o、0.01 g/l cacl2、0.002 g/l feso4·
7h2o、1.0 g/l kh2po4、0.5 g/l na2hpo4、0.01 g/l mnso4、0.5 g/l nh4cl，溶剂为无菌水，ph为7.0.无机盐液体培养基
②
中包含0.2 g/l mgso4·
7h2o、0.02 g/l cacl2、0.001 g/l feso4·
7h2o、1.5 g/l kh2po4、1.00 g/l na2hpo4、0.02g/l mnso4、1.0 g/l nh4cl；溶剂为无菌水，ph为7.0。
80.无机盐液体培养基
③
中包含0.5 g/l mgso4·
7h2o、0.05 g/l cacl2、0.004 g/l feso4·
7h2o、2.0 g/l kh2po4、1.50 g/l na2hpo4、0.03g/l mnso4、2.0 g/l nh4cl；溶剂为无菌水，ph为7.0。
81.无机盐液体培养基
④
中包含1.0 g/l mgso4·
7h2o、0.2 g/l cacl2、0.01 g/l feso4·
7h2o、2.0 g/l kh2po4、1.50 g/l na2hpo4、0.10g/l mnso4、2.0 g/l nh4cl；溶剂为无菌水，ph为7.0。
82.模拟石油：正十二烷、正十六烷、菲和芘，四种物质的质量比为1:1:1:1。
83.在上述实验条件下，用无机盐液体培养基
①
、
②
、
③
、
④
培养的石油降解微生物复合菌剂对模拟石油的总去除率分别为90.16%、94.59%、90.05%、86.89%。
84.实施例5 不同复配比例的石油降解微生物复合菌剂对石油类污染物的摇瓶降解效果
85.以实施例3中步骤（1）的方式，得到罗尔斯通氏菌（ralstoniasp.）、根瘤菌（rhizobium sp.）和不动杆菌（acinetobacter sp.）的菌液，在4℃，8000r/min条件下离心8min，在无菌操作台中弃去清液，收集菌体。将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的菌体分别按照1:1:1、2:1:1、3:1:1、5:3:1的质量比混合。之后再以实施例3中步骤（2）（3）所述方式，制备成石油降解微生物复合菌剂。
86.将三种质量比的石油降解微生物复合菌剂用100 ml无机盐液体培养基重悬，制备成菌悬液，od
600
为1.5左右，加入前述模拟石油200 mg/l，30 ℃，150 r/min条件下恒温摇床培养7 d后，以实施例2中的方式使用gc检测摇瓶中石油类化合物的残留量。无机盐液体培养基包含0.2 g/l mgso4·
7h2o、0.02 g/l cacl2、0.001 g/l feso4·
7h2o、1.5 g/l kh2po4、1.00 g/l na2hpo4、0.02g/l mnso4、1.0 g/l nh4cl；溶剂为无菌水，ph为7.0。
87.在上述实验条件下，将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的菌体分别按照1:1:1、2:1:1、3:1:1、5:3:1的质量比混合后制得的石油降解微生物复合菌剂对模拟石油的摇瓶降解总去除率分别为91.16%、94.59%、89.78%、83.78%。
88.实施例6 石油降解微生物复合菌剂对石油污染土壤的修复效果
89.本实施例中的石油污染土壤中石油类化合物的总浓度为20000mg/kg（其中正十二烷、正十六烷、菲和芘各5000mg/kg），使用石油降解微生物复合菌剂修复石油污染土壤的方法，步骤为：（1）将实施例2制备的石油降解微生物复合菌剂粉末用无菌水重悬，制备成菌悬液，od
600
为1.5左右。
90.（2）将步骤（1）所得的菌悬液按比例投加入石油污染土壤中，投加比例为：菌悬液中石油降解微生物复合菌剂粉末质量与石油污染土壤质量比为1:20。投加时，将石油降解微生物复合菌剂的菌悬液使用注射器分别注入石油污染土壤的表层、表层下10cm和表层下20cm。
91.（3）每20d如步骤（2）方法向石油污染土壤中投加石油降解微生物复合菌剂。整个土壤修复过程中，使土壤含水量保持在10%~20%。
92.（4）反应过程中，五点取样法取样，用气相色谱法测定土壤中石油类化合物含量，并检验修复效果。用五点取样法取样4g，研磨，过60目筛，加入到500ml离心管中，向离心管中添加正己烷30ml，振荡30min，超声30min，离心，将上清液倒入洁净三角瓶中，再向离心管
中加入正己烷30ml，重复萃取两次，合并萃取液，混匀。
93.（5）将步骤（4）所得的萃取液用无水硫酸钠干燥脱水后，经0.20mm滤膜过滤后储存于液相小瓶中，按实施例2中所述方式使用气相色谱仪测定石油类化合物的含量，计算石油类化合物降解率。初始污染土壤的石油化合物浓度为c0（单位mg/kg），气相色谱测定的萃取液中石油化合物含量为c1（单位mg/l），则石油类化合物的降解率为v=c1
×
90ml/4g/c0。
94.本例中，修复100d，石油降解微生物复合菌剂对石油污染土壤中石油类化合物正十二烷、正十六烷、菲和芘的降解率分别为40.54%、35.69%、24.98%和20.96%，菌剂加入石油污染土壤后，土壤中石油类污染物浓度变化如图5所示。
实施例7
95.参照实施例6的方法，将实施例2制备的石油降解微生物复合菌剂粉末用无菌水重悬，制备成菌悬液，od
600
为1.5左右。将步骤所得的菌悬液按比例投加入石油污染土壤中，投加比例为：菌悬液中石油降解微生物复合菌剂粉末质量与石油污染土壤质量比为1:10。投加时，将石油降解微生物复合菌剂的菌悬液使用注射器分别注入石油污染土壤的表层、表层下10cm和表层下20cm。每30d向石油污染土壤中投加石油降解微生物复合菌剂。整个土壤修复过程中，使土壤含水量保持在10%~20%。修复100d，石油降解微生物复合菌剂对石油污染土壤中石油类化合物正十二烷、正十六烷、菲和芘的降解率分别为45.93%、40.32%、39.86%和36.57%。
实施例8
96.参照实施例6的方法，将实施例2制备的石油降解微生物复合菌剂粉末用无菌水重悬，制备成菌悬液，od
600
为1.5左右。将步骤所得的菌悬液按比例投加入石油污染土壤中，投加比例为：菌悬液中石油降解微生物复合菌剂粉末质量与石油污染土壤质量比为1:30。投加时，将石油降解微生物复合菌剂的菌悬液使用注射器分别注入石油污染土壤的表层、表层下10cm和表层下20cm。每20d向石油污染土壤中投加石油降解微生物复合菌剂。整个土壤修复过程中，使土壤含水量保持在10%~20%。修复100d，石油降解微生物复合菌剂对石油污染土壤中石油类化合物正十二烷、正十六烷、菲和芘的降解率分别为37.65%、31.16%、21.77%和18.04%。

技术特征：
1.一种石油降解微生物复合菌剂，其特征在于，包括罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌；所述的罗尔斯通氏菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no: m 2023177；所述的根瘤菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no: m 2023178；所述的不动杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no: m 2023179。2.根据权利要求1所述的一种石油降解微生物复合菌剂，其特征在于，罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的质量比为1~3:1:1。3.根据权利要求1或者2所述的石油降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌的菌体混合，经冷冻干燥得到所述石油降解微生物复合菌剂。4.根据权利要求3所述的石油降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌分别用培养基纯培养后，离心收集菌体，再混合。5.根据权利要求4所述的石油降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述培养基包括0.1~1.0 g/l mgso4·
7h2o、0.01~0.2g/l cacl2、0.001~0.01 g/l feso4·
7h2o、1.0~2.0 g/l kh2po4、0.5~2.0 g/l na2hpo4、0.01~0.1g/l mnso4、0.5~2.0 g/l nh4cl；所述培养基还包括浓度为1~10 g/l或者0.1~0.5 g/l的碳源；所述碳源选自牛肉膏、酵母浸粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、石油烃；所述培养基ph为6.0-8.0，溶剂为无菌水。6.根据权利要求5所述的石油降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述培养基包括包括0.1~0.2 g/l mgso4·
7h2o、0.01~0.02 g/l cacl2、0.001~0.002 g/l feso4·
7h2o、1.0~1.5 g/l kh2po4、0.5~1.0 g/l na2hpo4、0.01~0.02 g/l mnso4、0.5~1.0 g/l nh4cl；所述石油烃包含正十二烷、正十六烷、菲、芘。7.根据权利要求3所述的石油降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥过程为：首先在-10~-20 ℃冷冻4~6 h，然后在-40~-60 ℃，10 pa真空度下冷冻干燥20~24 h。8.根据权利要求3所述的石油降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥过程的冻干保护液按质量含量包含脱脂奶粉5~10%、蔗糖5~10%、甘露醇1~1.5%，余量为无菌水。9.根据权利要求1或2所述的石油降解微生物复合菌剂在降解土壤中石油污染物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述石油污染物包含正十二烷、正十六烷、菲和芘。11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述石油污染物中十二烷、正十六烷、菲、芘的浓度比为1~2:1~2:1:1。12.根据权利要求1或者2所述的石油降解微生物复合菌剂修复石油污染土壤的方法，其特征在于，将石油降解微生物复合菌剂用无菌水重悬后，以质量比1:10~30的投加量加入到石油污染土壤中，之后将石油降解微生物复合菌剂每20~30 d以质量比1:10~30的投加量加入到石油污染土壤中。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，将石油降解微生物复合菌剂每20~30 d
以质量比为1:10~30的投加量均匀注入到石油污染土壤的表层、表层下10 cm、表层下20 cm处。14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，整个土壤修复过程中使土壤含水量保持在10%~20%。15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述石油污染土壤中石油污染物的总浓度为10000~20000 mg/kg。16.如权利要求1或者2所述的石油降解微生物复合菌剂的储存方式，其特征在于，所述石油降解微生物复合菌剂以固体粉末形式冷冻保存。17.如权利要求16所述石油降解微生物复合菌剂的储存方式，其特征在于，将固体粉末状石油降解微生物复合菌剂于4 ℃~-80 ℃密封保存。

技术总结
本发明涉及环境微生物领域，具体而言，公开了一种石油降解微生物复合菌剂、制备方法和使用方法及用途。本发明提供了一种石油降解微生物复合菌剂，其制备方法为将罗尔斯通氏菌、根瘤菌和不动杆菌，菌体混合后用冻干保护液重悬；经-20℃预冻4h后，在-60℃、10Pa真空度下冷冻干燥20h，得到固体粉末状石油降解微生物复合菌剂。本发明的石油降解微生物复合菌剂可用于修复石油污染土壤；固体菌剂粉末的形式便于运输和贮存。该方法成本较低，具有广阔的应用前景。前景。前景。


技术研发人员：曲媛媛 荆佳维 赵博 王婷婷 陈卓 郭鑫宇
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/9/20