来自黄芪的糖基转移酶AmGT36及其基因和应用

来自黄芪的糖基转移酶amgt36及其基因和应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子生物学技术领域，尤其涉及一种来自黄芪的糖基转移酶amgt36及其基因和应用。


背景技术：

2.黄芪，为豆科黄芪属植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根。具有健脾补中，升阳举陷，益卫固表，利尿，托毒生肌的功效。主治脾气虚证，肺气虚证，气虚自汗证，气血亏虚，疮疡难溃难腐，或溃久难敛等。
3.环阿屯醇类三萜是一类骨架中含有c9和c19形成的三元环的三萜类化合物，主要分布于毛茛科，兰科，百合科，豆科，菊科等植物。植物源环阿屯醇类三萜具有很好的生理活性，如：豆科中黄芪属植物中分离得到的黄芪甲苷具有提高免疫力和抗病毒等药理活性；菊科中分离得到的argentatin a、b和d可作为潜在的抗炎药物。
4.环阿屯醇类三萜因其结构具有多个手性中心，直接通过化学手段合成工艺复杂且成本高，现阶段医疗使用的环阿屯醇类三萜多是从植物中分离；而黄芪皂苷类等环阿屯醇三萜的生物合成途径不清楚，无法解除黄芪皂苷等三萜体内合成的限速步骤，限制了植物中环阿屯醇类三萜产量的提高。此外，通过植物分离黄芪皂苷受到植物生长、气候变动等各种因素影响，也限制了黄芪皂苷等环阿屯醇类三萜的供应。现代分子生物学和合成生物学的发展，使得黄芪皂苷等药用天然产物脱离原植物，在微生物中生产成为了可能。黄芪皂苷生物合成途径的解析及生物合成基因的挖掘作为其进行代谢工程的基础，是微生物生产中最重要的基本元件。
5.现有技术中有公开催化环黄芪醇和astramembrannin ii的c-6的oh糖基转移酶amgt8，其在催化反应过程中选择性不高，无法特异性的催化c-6的oh糖基转移，生成大量其他位点的oh糖基转化后的副产物；使目标产物转化率和收率低。
6.因此，急需开发能用于或提高黄芪皂苷等三萜体类化合物合成的催化剂或者合成方法。


技术实现要素：

7.为了解决以上问题，本发明的目的在于提供一种能特异催化底物环黄芪醇和astramembrannin ii的c-6位糖基化分别转化为brachyoside b和黄芪甲苷的特异性糖基转移酶。
8.为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种黄芪糖基转移酶amgt36，包括a)具有seq id no.4所示的氨基酸残基序列的蛋白质；或
9.b)将seq id no.4中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a)酶功能的由a)衍生的氨基酸序列；或
10.c)与a)或b)限定的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且具有a)酶功能的由a)衍生的蛋白质；或
11.d)序列中含有a)或b)所述氨基酸序列的衍生蛋白质；
12.所述amgt36氨基酸序列如seq id no.4所示；
13.本发明第二方面提供了一种黄芪糖基转移酶amgt36基因，包括a)核苷酸序列如seq id no.3所示的多核苷酸；或
14.b)编码本发明第一方面所述蛋白质的多核苷酸；或
15.c)编码如seq id no.4所示的氨基酸序列的多核苷酸；或
16.d)与a)、b)或c)限定的核苷酸序列具有80％以上的同源性且编码具有与上述第一方面所述合成brachyoside b和黄芪甲苷的糖基转移酶功能的多核苷酸；或
17.e)与a)、b)或c)所述的序列互补的多核苷酸；
18.本发明第三方面提供了一种本发明第二方面所述黄芪糖基转移酶amgt36基因的重组表达载体，所述重组表达载体为将所述的黄芪糖基转移酶基因插入原核或真核表达载体得到表达黄芪糖基转移酶的重组表达载体；
19.进一步的，所述重组表达载体为，将黄芪糖基转移酶基因amgt36，如seq id no.3所示的核苷酸序列，经bamhi和sali酶切位点连入pet28a载体而得；
20.本发明第四方面提供了一种包含本发明第二方面所述黄芪糖基转移酶amgt36基因的转基因重组菌；
21.所述转基因重组菌为bl21(de3)，或其他细菌和真菌，所述细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母；
22.本发明第五方面提供了一种本发明第一方面所述黄芪糖基转移酶amgt36在体内或体外催化生产brachyoside b、黄芪甲苷等环阿屯醇类三萜中的应用；
23.本发明第六方面提供了一种本发明上述所述黄芪糖基转移酶基因、所述的重组表达载体、所述的转基因重组菌在不具有环阿屯醇类三萜的生物合成途径的原核生物或真核生物中构建环阿屯醇类三萜合成途径的应用，或是在不具有合成环阿屯醇类三萜合成能力的原核生物或真核生物中的应用；
24.或是在不具有合成途径中涉及环阿屯醇类三萜的天然产物合成能力的原核生物或真核生物中的合成生物学中的应用。
25.或是在具有环阿屯醇类三萜的生物合成途径的原核生物或真核生物中提升环阿屯醇类三萜产量的应用；或是合成途径中提高环阿屯醇类三萜中间体的天然产物产量中的应用；
26.或者在不具有brachyoside b和黄芪甲苷合成能力的原核生物或真核生物中合成途径中涉及brachyoside b和黄芪甲苷的天然产物的生物合成途径的应用；
27.或是在提升生物合成途径中涉及brachyoside b和黄芪甲苷的天然产物产量的应用；
28.本发明第七方面提供了一种本发明第一方面所述黄芪糖基转移酶amgt36在制备用于环阿屯醇类三萜或是生产环阿屯醇类三萜中的用途。
29.采用以上方案，本发明公开的糖基转移酶amgt36，具有以下优点：
30.本发明公开了黄芪糖基转移酶，经研究发现黄芪糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。其编码的核苷酸如seq id no.3所示。将黄芪糖基转移酶进行原核表达后能够催化环黄芪醇和astramembrannin ii糖基化分别转化为brachyoside b和黄芪甲苷。黄
amgt36；
49.pet28a-amgt36的质粒图谱如图2所示；
50.amgt36引物序列如下：
51.28a-amgt36-f：5
’‑
cgggatccatgaacggaaccgtcaagaaaatgaatg-3’(seq id no.5)
52.28a-amgt36-r：5
’‑
acgcgtcgactcattctgtaaccacagaaatggcacgc-3’(seq id no.6)
53.将构建好的pet28a-amgt36质粒转化原核表达菌株bl21(de3)，涂布含有卡那霉素lb固体平板，挑取单菌落培养，提取质粒进行酶切验证，筛选阳性克隆子，获得原核表达工程菌bl21-pet28a-amgt36。
54.取菌液10μl接种到含50μg/l卡那霉素的5ml lb液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。再按1：100比例接种量分别接种到250ml lb液体培养基中37℃，200rpm进行活化培养，培养至od600＝0.6左右时，放置冰上十分钟后，加入iptg至终浓度0.5mm。在16℃，200rpm条件下继续培养18-22h。将收获的菌液4000rpm离心，去掉上清。再把菌体沉淀用蛋白纯化buffer重悬，并在超声破碎后，用镍柱进行蛋白纯化获得amgt36蛋白。
55.得到的蛋白用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如图3所示；计算的融合amgt36蛋白大小为54.6kda，图3所示大小与预计值一致，证实正确的表达出可溶性蛋白。
56.(2)amgt36酶活性验证。
57.amgt36催化的体外酶反应的体系如下：磷酸钾缓冲盐(ph 8.0)，40μm环黄芪醇或者astramembrannin ii，0.1mm udp-glc,100μg amgt36蛋白，总体积100μl，37℃，孵育3h后，加200μl甲醇终止反应。
58.酶反应体系用lc-ms进行分析，质谱仪为agilent 6530accurate-mass q-tof，色谱柱为c18,柱温30℃，流速1ml/min，用乙腈((a))/水(b)体系,质谱仪为电喷雾离子源(esi)，进行正离子模式扫描；
59.amgt36催化的酶化学反应方程式如图1所示；
60.对上述试验反应前后进行lc-ms分析检测，检测结果如图4所示，
61.从图4的对比分析图可知amgt36催化生产brachyoside b或黄芪甲苷，在分析条件下保留时间为5.7min；
62.表明本发明的amgt36为具有能特异催化底物环黄芪醇和astramembrannin ii的c-6位糖基化分别转化为brachyoside b和黄芪甲苷的特异性糖基转移酶。
63.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种黄芪糖基转移酶amgt36，其特征在于，包括：a)具有seq id no.4所示的氨基酸残基序列的蛋白质；或b)将seq id no.4中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a)酶功能的由a)衍生的氨基酸序列；或c)与a)或b)限定的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且具有a)酶功能的由a)衍生的蛋白质；或d)序列中含有a)或b)所述氨基酸序列的衍生蛋白质；所述amgt36氨基酸序列如seq id no.4所示。2.一种黄芪糖基转移酶amgt36基因，其特征在于，包括：a)核苷酸序列如seq id no.3所示的多核苷酸；或b)编码权利要求1所述黄芪糖基转移酶amgt36的蛋白质的多核苷酸；或c)编码如seq id no.4所示的氨基酸序列的多核苷酸；或d)与a)、b)或c)限定的核苷酸序列具有80％以上的同源性且编码具有权利要求1所述合成brachyoside b和黄芪甲苷的糖基转移酶功能的多核苷酸；或e)与a)、b)或c)所述的序列互补的多核苷酸。3.含有权利要求2所述黄芪糖基转移酶amgt36的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2所述的黄芪糖基转移酶基因插入原核或真核表达载体得到表达黄芪糖基转移酶的重组表达载体。4.一种如权利要求2所述黄芪糖基转移酶amgt36基因的重组表达载体，其特征在于，将黄芪糖基转移酶基因amgt36，如seq id no.3所示的核苷酸序列，经bamhi和sali酶切位点连入pet28a载体而得。5.一种如权利要求2所述黄芪糖基转移酶amgt36基因的转基因重组菌，其特征在于，所述转基因重组菌为bl21(de3)，或其他细菌和真菌，所述细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。6.权利要求1所述黄芪糖基转移酶amgt36用于体内或体外催化生产brachyoside b、黄芪甲苷等环阿屯醇类三萜中的用途。或者在不具有brachyoside b和黄芪甲苷合成能力的原核生物或真核生物中合成途径中涉及brachyoside b和黄芪甲苷的天然产物的生物合成途径的应用；或是在提升生物合成途径中涉及brachyoside b和黄芪甲苷的天然产物产量的应用。7.权利要求1所述黄芪糖基转移酶amgt36在制备用于环阿屯醇类三萜或生产环阿屯醇类三萜中的用途。8.权利要求2所述黄芪糖基转移酶基因、权利要求3或4所述重组表达载体、权利要求5所述转基因重组菌中任一项，在不具有环阿屯醇类三萜的生物合成途径的原核生物或真核生物中构建环阿屯醇类三萜合成途径的应用；或是在不具有合成途径中涉及环阿屯醇类三萜的天然产物合成能力的原核生物或真核生物中的合成生物学中的应用；或是在具有环阿屯醇类三萜的生物合成途径的原核生物或真核生物中提升环阿屯醇类三萜产量的应用；
或是合成途径中提高环阿屯醇类三萜中间体的天然产物产量中的应用。

技术总结
本发明公开了一种黄芪糖基转移酶AmGT36，包括具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸残基序列的蛋白质；本发明还公开了所述黄芪糖基转移酶基因、所述的重组表达载体、所述的转基因重组菌，以及他们在体内或体外催化生产brachyoside B和黄芪甲苷的应用；本发明黄芪糖基转移酶AmGT36能特异催化底物环黄芪醇和astramembrannin II的C-6位糖基化分别转化为brachyoside B和黄芪甲苷，可运用于合成生物学中环阿屯醇类三萜(如黄芪甲苷)的生产；具有很好的工业化应用前景。很好的工业化应用前景。很好的工业化应用前景。


技术研发人员：黄胜雄 徐冰艳 王永江 杨静 李洁 黄建萍
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/9/20