融合蛋白及其在基因编辑中的应用

1.本发明属于基因编辑工程领域，涉及融合蛋白及其在基因编辑中的应用，具体涉及编码t5核酸外切酶和linker的核酸分子组合及其应用。


背景技术：

2.核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3’，5
’‑
磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。t5核酸外切酶(t5 exonuclease，简称t5 exo)来源于t5噬菌体，该酶按照5
’→3’
方向降解双链或单链dna。
3.crispr/cas是原核生物抵御病毒感染或噬菌体入侵产生的一种适应性免疫系统。其中ii型crispr/cas9系统和v型系统(如crispr/cas12a、crispr/cas12b等)组成简单，操作简便，在基因编辑中得到广泛应用。crispr/cas9系统通过单向导rna(single guide rna，sgrna)识别dna靶标之后，cas9通常会产生双链断裂。然后细胞会通过非同源末端连接机制和同源重组修复机制修复双链断裂，从而产生插入、缺失或者在有供体模板时产生基因插入和特定碱基改变。目前crispr/cas9技术已广泛应用于微生物、动植物等诸多物种，crispr/cas系统打破了传统育种的局限性，加快了动植物遗传改良进程。
4.中国发明专利cn111757889b中公开了一种cas蛋白cas12f.4，在本文中将其称为cas12i3。该cas蛋白可以在真核生物中进行编辑。cas12i3蛋白的切割位点位于pam的下游的15nt和22nt处，切割后产生7nt的5’悬垂，该悬垂互补配对，导致细胞修复时偏向准确修复断裂，降低编辑效率。因此，有必要进一步改进crispr/cas12i3基因编辑系统，提高其编辑效率，开发更高效的基因编辑系统，使其在基因编辑、基因功能研究、动植物遗传改良等领域具有更广泛的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何提高cas12i3蛋白介导的基因编辑的效率。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了提高基因编辑效率的融合蛋白，所述融合蛋白可为下述任一种：
7.a1)氨基酸序列是seq id no.9、seq id no.11或seq id no.13的蛋白质；
8.a2)将seq id no.9、seq id no.11或seq id no.13所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
9.a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。
10.本文所述取代可为保守性取代(也称为保守性替换)或非核心功能区的非保守性取代。本领域技术人员所公知，保守性取代或是在非核心功能区进行非保守取代，对蛋白质
的功能通常不会产生质的影响。
11.本文所述标签包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
12.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
13.本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
14.本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子可为下述任一种：
15.b1)编码本文任一所述融合蛋白的核酸分子；
16.b2)编码序列是seq id no.10、seq id no.12或seq id no.14所示的dna分子；
17.b3)核苷酸序列是seq id no.10、seq id no.12或seq id no.14所示的dna分子。
18.所述核酸分子还可包括在seq id no.10、seq id no.12或seq id no.14所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
19.本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
20.c1)含有所述核酸分子的表达盒；
21.c2)含有所述核酸分子的重组载体、或含有c1)所述表达盒的重组载体；
22.c3)含有所述核酸分子的重组微生物、或含有c1)所述表达盒的重组微生物、或含有c2)所述重组载体的重组微生物；
23.c4)含有所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有c1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有c2)所述重组载体的重组宿主细胞。
24.进一步地，c1)所述表达盒、c2)所述重组载体、c3)所述重组微生物和c4)所述重组宿主细胞均可表达所述核酸分子。
25.本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(escherichia sp.)、欧文氏菌属(erwinia sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)、黄杆菌属(flavobacterium sp.)等但不限于此。所述真菌可为酵母，所述酵母可来自酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属等但不限于此。所述放线菌可来自链霉菌属(streptomyces sp.)、诺卡菌属(nocardia sp.)、小单孢菌属(micromonospora sp.)等但不限于此。所述藻类可来自墨角藻属(fucus sp.)、曲壳藻属(achnanthes sp.)等但不限于此。所述病毒可为轮状病毒、疱疹病毒、流感病毒、腺病毒等但不限于此。
26.本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意
的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(arabidopsis thaliana)、烟草(nicotiana tabacum)、玉米(zea mays)、水稻(oryza sativa)、小麦(triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(bhk细胞)、小鼠乳腺癌细胞(c127细胞)、人胚胎肾细胞(hek293细胞)、人hela细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、t细胞或nk细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(xenopus laevis)细胞或大鲵(andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如sf21细胞或sf-9细胞)等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为绵羊成纤维细胞。
27.本发明还提供了所述融合蛋白、所述核酸分子和/或所述生物材料的下述任一种应用：
28.d1)在基因编辑中的应用；
29.d2)在制备基因编辑系统中的应用；
30.d3)在制备基因编辑产品中的应用；
31.d4)在提高基因编辑效率中的应用。
32.本文所述基因编辑可为针对真核生物或原核生物的基因编辑，或针对真核细胞或原核细胞的基因编辑。所述真核生物可包括动物或植物；
33.本文所述基因编辑产品可包括细胞模型、动物或植物模型、动物或植物新品种等但不限于此。
34.本发明还提供了一种基因编辑系统，所述基因编辑系统可包括下述至少任一种：
35.e1)所述融合蛋白；
36.e2)所述核酸分子；
37.e3)c2)所述重组载体。
38.进一步地，所述基因编辑系统还可包括grna(guide rna，向导rna)或grna表达载体。
39.所述grna表达载体可为含有编码所述grna的dna分子的重组载体。
40.所述grna引导所述融合蛋白对目的细胞中的目的基因进行基因编辑。
41.本文所述基因编辑系统可为cas12i3蛋白介导的基因编辑系统(crispr/cas12i3基因编辑系统)。
42.本发明还提供了所述基因编辑系统在基因编辑、制备基因编辑产品或提高基因编辑效率中的应用。
43.本发明还提供了一种基因编辑的方法，所述方法可包括利用所述融合蛋白、所述核酸分子、所述重组载体和/或所述基因编辑系统进行基因编辑的步骤。
44.进一步地，所述基因编辑的方法可包括：使待编辑的样品与所述融合蛋白、所述核酸分子、所述重组载体和/或所述基因编辑系统接触以进行基因编辑。
45.所述待编辑的样品可包括细胞(如动物细胞或植物细胞)、组织、器官、或其组合。
46.所述样品可来自动物、植物或微生物(包括细菌、病毒等)。
47.本文所述基因编辑包括体外基因编辑、体内基因编辑、或其组合。
exo基因的核苷酸序列为seq id no.14。
65.本文所述基因编辑系统可包括基因编辑载体，所述基因编辑载体可为将本文任一所述核酸分子和编码grna的核酸分子构建到载体中而得到的重组载体。
66.在本发明的一个实施方案中，所述grna为靶向绵羊内源基因zfx的grna，所述grna的靶点序列为seq id no.15。所述基因编辑载体包括：将seq id no.15所示的dna分子和cas12i3-linker 3-t5 exo基因(seq id no.10)构建到载体中得到的重组载体、将seq id no.15所示的dna分子和t5 exo-linker 4-cas12i3基因(seq id no.12)构建到载体中得到的重组载体和将seq id no.15所示的dna分子和cas12i3-linker 1-t5 exo基因(seq id no.14)构建到载体中得到的重组载体。
67.上述基因编辑载体含有zfx基因编辑靶点和本发明设计的融合基因(包括cas12i3蛋白的编码基因、t5核酸外切酶的编码基因，以及本发明设计的linker基因)，在导入受体细胞后，其转录出的向导rna通过碱基互补配对可以靶向zfx基因，其表达出的融合蛋白(cas12i3蛋白与t5核酸外切酶通过linker连接而成的融合蛋白)使zfx基因靶点上下游的dna双链断裂，通过生物体自身的dna损伤修复应答机制，进一步实现基因编辑功能。
68.在本发明的另一个实施方案中，所述grna为靶向tdtomato基因的grna，所述grna的靶点序列为seq id no.16。所述基因编辑载体包括：将seq id no.16所示的dna分子和cas12i3-linker 3-t5 exo基因(seq id no.10)构建到载体中得到的重组载体、将seq id no.16所示的dna分子和t5 exo-linker 4-cas12i3基因(seq id no.12)构建到载体中得到的重组载体和将seq id no.16所示的dna分子和cas12i3-linker 1-t5 exo基因(seq id no.14)构建到载体中得到的重组载体。
69.上述基因编辑载体含有tdtomato基因编辑靶点和本发明设计的融合基因(包括cas12i3蛋白的编码基因、t5核酸外切酶的编码基因，以及本发明设计的linker基因)，在导入受体细胞后，其转录出的向导rna通过碱基互补配对可以靶向tdtomato基因，其表达出的融合蛋白(cas12i3蛋白与t5核酸外切酶通过linker连接而成的融合蛋白)使tdtomato基因靶点上下游的dna双链断裂，通过生物体自身的dna损伤修复应答机制，进一步实现基因编辑功能。
70.中国发明专利cn111757889b中公开了一种cas蛋白cas12f.4，在本文中将其称为cas12i3。该cas蛋白可以在真核生物中进行编辑。cas12i3蛋白切割位点位于在pam的下游的15nt和22nt处，切割后产生7nt的5’悬垂，悬垂互补配对，导致细胞修复时偏向准确修复断裂，降低编辑效率。本发明通过设计不同linker将t5核酸外切酶与cas12i3蛋白进行融合表达，以切除5’悬垂，提高cas12i3的编辑效率，为crispr/cas12i3基因编辑系统的广泛应用奠定了基础。
71.本发明通过筛选获得了可显著提高cas酶编辑效率的t5核酸外切酶和linker编码序列核酸分子组合(c-linker 3组合、n-linker 4组合和c-linker 1组合)。按照c-linker 3组合、n-linker 4组合和c-linker 1组合方式得到的融合蛋白比没有经过改造的cas12i3蛋白编辑效率有了较大的提升，分别提高了35.9％、32.5％和35.9％。进一步的流式分析法检测不同组合编辑效率的结果显示，经过c-linker 3组合方式改造，提高了tdtomato平均荧光强度淬灭比例，显著地提高了弱tdtomato荧光强度(《103)的细胞数占比，整体的tdtomato荧光峰图向左平移(坐标轴从左到右表示tdtomato荧光强度由弱到强)，表明经过
c-linker 3组合方式改造，更显著地提高了cas酶的编辑效率。利用本发明融合蛋白制备的基因编辑系统具有良好的基因编辑效率，有较好的应用价值和前景。
附图说明
72.图1为t7e1检测8种不同核酸分子组合在绵羊成纤维细胞中的编辑效率(转染后48h)。
73.图2为流式分析8种不同核酸分子组合导致tdtomato标记的绵羊成纤维细胞的tdtomato平均荧光强度淬灭的比例(转染后48h)。
74.图3为流式分析8种不同核酸分子组合导致tdtomato标记的绵羊成纤维细胞的弱tdtomato荧光强度(《103)的细胞数比例的变化(转染后48h)。
75.图4为转染对照组质粒和通过linker 3将t5核酸外切酶融合到cas12i3的c端(c-linker3组合)的质粒后的tdtomato标记的绵羊成纤维细胞的tdtomato荧光分布峰图(转染后48h)。
具体实施方式
76.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
77.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
78.定义
79.虽然认为以下术语是本领域技术人员明了的，但还是阐述了以下定义以便于解释本技术披露的主题。
80.grna
[0081]“向导rna(guide rna)”、“成熟crrna”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，向导rna可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guide sequence)，或者基本上由同向重复序列和导向序列(在内源性crispr系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。在某些情况下，导向序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导crispr/cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。
[0082]
cas蛋白
[0083]
在本发明中，表述“cas蛋白”是指crispr蛋白，术语“crispr/cas蛋白”、“cas效应蛋白”、“cas蛋白”、“单效应核酸酶”可互换地使用。cas蛋白与grna或成熟crrna一旦与待检测特征序列(靶序列)结合形成的核糖核蛋白复合体，其包含杂交到靶序列上并且与cas蛋白结合的导向序列。该核糖核蛋白复合体能够识别并切割能与该向导rna或成熟crrna杂交的多核苷酸。
[0084]
t5核酸外切酶
[0085]
t5核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3，5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。t5核酸外切酶来源于t5噬菌体，该酶按照5
’→3’
方向降解双链或单链dna。
[0086]
融合蛋白
[0087]
将两个蛋白或者多肽以肽键进行连接，表达出的蛋白即融合蛋白。融合蛋白的概念在细胞生物学研究以及大分子药物研究领域有着重要的应用。构建融合蛋白的原则是将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现2个基因的融合表达。常见的融合蛋白包括，目的蛋白融合标签蛋白，融合荧光蛋白，以及两个不同蛋白的融合。
[0088]
linker
[0089]
也可翻译称为“连接肽”或“接头”，作为融合蛋白重组不可或缺的组成部分，linker在构建稳定、具有生物活性的融合蛋白中发挥着重要的作用。linker为两个融合蛋白间起连接作用的氨基酸链，具有一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能。没有linker的功能区域直接融合可能会导致许多不良的结果，包括融合蛋白的错误折叠、蛋白产量低或生物活性受损等。因此，选择或合理设计连接融合蛋白结构域的linker是重组融合蛋白技术中一个重要的领域。
[0090]
设计linker接头时应考虑以下几个因素：1)linker的长度。不宜过长或过短，一般在10～15个氨基酸之间。linker序列过长可能会降低融合蛋白产量，同时会产生免疫原性问题；linker序列过短可能会使2个蛋白间距太近，影响彼此高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失。2)linker的结构。设计linker序列时应注意避免二级结构的产生，因为二级结构的产生会限制融合蛋白的伸缩性，从而影响融合蛋白的功能活性。3)linker中常见的氨基酸。非极性的疏水氨基酸如甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)和脯氨酸(pro)较为常见。4)linker内部的核苷酸序列。研究表明，调整linker序列的核苷酸组成，能使重组融合蛋白的mrna水平显著增加，转染效率更高。
[0091]
核定位信号
[0092]
核定位信号(nuclear localization signal，nls)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有nls的蛋白质被转运至细胞核。典型地，nls包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的lys或arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的nls：sv40大t抗原，egl-13，c-myc以及tus蛋白。在一些实施例中，该nls包含paakrvkld序列(c-myc nls)。在一些实施例中，该nls包含krtadgsefespkkkrkv序列(bp nls)。在一些实施例中，该nls包含krpaatkkagqakkkk序列(核质蛋白nls，nucleoplasmin nls)。
[0093]
c-myc nls核苷酸序列cccgccgccaagcgcgtgaagctggac，
[0094]
c-myc nls氨基酸序列paakrvkld，
[0095]
bp nls核苷酸序列aaacggacagccgacggaagcgagttcgagtcaccaaagaa gaagcggaaggtc，
[0096]
bp nls氨基酸序列krtadgsefespkkkrkv，
[0097]
nucleoplasmin nls核苷酸序列aagaggcctgctgctacaaagaaggccggccaggc aaaaaagaaaaag，
[0098]
nucleoplasmin nls氨基酸序列krpaatkkagqakkkk。
[0099]
载体
[0100]
指在基因工程重组dna技术中将dna片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的dna分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。载体按功能可分
为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增dna片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的dna元件，如启动子和终止子。本文中涉及到的启动子有u6和cbh启动子，u6启动子属于pol iii型启动子，它驱动的序列长度很小，目前常见的利用u6启动子进行表达的有grna和sirna等。u6启动子驱动的序列，在遇到pol(u)时会终止。cbh启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒(the cytomegalovirus，cmv)、早期增强子(early enhancer element)、鸡β-肌动蛋白(chicken beta-actin)启动子和鸡β-肌动蛋白(chickenβ-actin，cba)与鼠细小病毒(minute virus of mice，mmv)内含子的混合序列组成，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。
[0101]
t7e1酶切
[0102]
t7e1全称为t7 endonuclease i，是一种比较特殊的dna内切酶，能识别并切割不完全配对的dna、十字型结构dna、holliday结构等。t7e1常用于crispr/cas、talen以及其它编辑工具形成的突变体检测。
[0103]
下述实施例中的原代山羊或绵羊成纤维细胞为实验室自己分离。制备方法如下：取出生2周内的山羊或绵羊少许耳组织，放入pbs中。在超净台中，将耳组织放在75％酒精中消毒1min，pbs洗3遍，用无菌的剪子将耳组织剪碎至1mm3大小，加入200μl胎牛血清，移至细胞培养皿中，在37℃、5％ co2培养箱中倒置放1h。小心加入完全培养基，添加时注意不要将组织块冲起。培养约1周后，从组织块爬出成纤维细胞。待长满后胰酶消化下来，扩大培养后，冻存备用。
[0104]
下述实施例中cas12i3蛋白的氨基酸序列为seq id no.9的第1-1045位，cas12i3蛋白的编码基因的核苷酸序列为seq id no.10的第1-3135位。
[0105]
下述实施例中t5核酸外切酶(简称t5 exo)的氨基酸序列为seq id no.9的第1056-1346位，t5核酸外切酶的编码基因的核苷酸序列为seq id no.10的第3166-4038位。
[0106]
下述实施例中的px458载体来源于addgene质粒共享信息库(编号为48138)。
[0107]
下述实施例中linker 1的氨基酸序列为seq id no.1，核苷酸序列为seq id no.5；linker2的氨基酸序列为seq id no.2，核苷酸序列为seq id no.6；linker 3的氨基酸序列为seq id no.3，核苷酸序列为seq id no.7；linker 4的氨基酸序列为seq id no.4，核苷酸序列为seq id no.8。
[0108]
实施例1、设计不同的t5核酸外切酶和linker的核酸分子组合
[0109]
本实施例设计了不同的t5核酸外切酶和linker的核酸分子组合，用于构建融合基因。考虑到cas12i3蛋白和t5核酸外切酶的大小，选择的linker为8-16个氨基酸。设计了4种linker，分别为(ggggs)2、(ggggs)3、sggsggsggs、xten并重新命名为linker 1、linker 2、linker 3、linker 4。并将t5核酸外切酶通过这4种linker融合到cas12i3蛋白的n端或c端，共计8种核酸分子组合，设计得到8种融合基因。cas12i3蛋白、t5核酸外切酶和4种linker的编码基因均进行了哺乳动物密码子优化。为了增强融合蛋白的入核能力，本实施例在8种融合基因的n端和c端添加了核定位信号(nuclear localization signal，nls)序列。n端添加c-myc nls和bp nls编码序列，c端添加核质蛋白nls(nucleoplasmin nls)编码序列。
[0110]
按照上述思路构建8种重组载体，如表1所示：
[0111]
表1、8种核酸分子组合及载体构建
polya。
[0120]
通过限制性内切酶agei(neb(北京)有限公司)和fsei(neb(北京)有限公司)双酶切上述质粒u6-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya以去除cas9编码序列。酶切体系：上述质粒(u6-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya)5μg，agei 20units，fsei 20units，cutsmart10μl，ddh2o补至100μl。反应条件：37℃孵育6h。通过回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)回收并检测浓度。将该酶切产物(agei和fsei双酶切质粒u6-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya)、cas12i3蛋白的编码序列(seq id no.10的第1-3135位)、c-myc nls、bp nls和nucleoplasmin nls通过无缝克隆试剂盒进行组装得到u6-cbh-c-myc nls-bp nls-cas12i3-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya，将该载体作为对照载体。同时酶切产物(agei和fsei双酶切质粒u6-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya)和cas12i3蛋白编码序列、t5 exo编码序列、linker(linker 1、linker 2、linker 3或linker4)、c-myc nls、bp nls和nucleoplasmin nls按照表1中所示组合方式通过无缝克隆试剂盒进行组装得到重组载体u6-cbh-c-myc nls-bp nls-t5 exo-linker1-cas12i3-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya、u6-cbh-c-myc nls-bp nls-t5exo-linker 2-cas12i3-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya、u6-cbh-c-myc nls-bp nls-t5 exo-linker 3-cas12i3-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya、u6-cbh-c-myc nls-bp nls-t5 exo-linker 4-cas12i3-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya、u6-cbh-c-myc nls-bp nls-cas12i3-linker 1-t5 exo-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya、u6-cbh-c-myc nls-bp nls-cas12i3-linker 2-t5 exo-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya、u6-cbh-c-myc nls-bp nls-cas12i3-linker 3-t5exo-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya和u6-cbh-c-myc nls-bp nls-cas12i3-linker 4-t5 exo-nucleoplasmin nls-t2a-egfp-bgh polya。
[0121]
上述8种重组载体表达8种融合蛋白(即8种融合基因编码的融合蛋白)，分别命名为：t5 exo-(ggggs)
2-cas12i3、t5 exo-(ggggs)
3-cas12i3、t5exo-sggsggsggs-cas12i3、t5 exo-xten-cas12i3、cas12i3-(ggggs)
2-t5 exo、cas12i3-(ggggs)
3-t5 exo、cas12i3-sggsggsggs-t5 exo、cas12i3-xten-t5 exo。
[0122]
实施例2、t7e1酶切法检测不同t5核酸外切酶和linker的核酸分子组合的编辑效率
[0123]
1、基因编辑载体构建
[0124]
实施例1中构建的8种重组载体和对照载体通过kpni(neb(北京)有限公司)和spei(neb(北京)有限公司)双酶切并回收(u6启动子后有spei和kpni酶切识别位点)。酶切体系：上述质粒5μg，spei 50units，kpni 50units，cutsmart 10μl，ddh2o补至100μl。反应条件：37℃孵育6h。然后加入5μl beyoap碱性磷酸酶(碧云天生物科技有限公司，货号d7027)，37℃继续孵育10min。通过回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)回收并检测浓度。
[0125]
本发明选择绵羊内源基因zfx(genbank accession no.nc_056080.1的第22500545-22537460位(update date 4-nov-2022))，并设计了靶向zfx基因的grna(grna1)的靶点序列，靶点序列为5
’‑
cagtacagcaagagtggatgaat-3’(seq id no.15)。通过下述引物(表2)扩增表达grna的dna片段(5
’‑
aaaggacgaaacaccgctctgaccacctgagagaatgtgtgcatag
tcacaccagtacagc aagagtggatgaattttttttgtacccgttacataa-3’，其中大写字母标识的为直接重复序列+靶点序列+转录终止信号，小写字母标识的为载体同源序列)。pcr扩增体系：f 1μl，r 1μl，primestar 15μl，ddh2o 13μl。pcr扩增程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸5s(33个循环)；72℃延伸5min。pcr完成后将pcr产物通过产物回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)进行回收并测定浓度。
[0126]
表2、扩增表达grna的dna片段所用引物(靶向zfx基因)
[0127][0128]
通过无缝克隆试剂盒将上述grna片段分别与spei和kpni双酶切后的线性对照载体和8种重组载体同源重组成带zfx靶点的对照载体和8种重组载体，即为基因编辑载体。
[0129]
将上述构建得到的8种基因编辑载体分别命名为pcbh-n-linker 1-grna1、pcbh-n-linker2-grna1、pcbh-n-linker 3-grna1、pcbh-n-linker 4-grna1、pcbh-c-linker 1-grna1、pcbh-c-linker 2-grna1、pcbh-c-linker 3-grna1、pcbh-c-linker 4-grna1。
[0130]
上述基因编辑载体含有zfx基因编辑靶点和本发明设计的融合基因(包括cas12i3蛋白的编码基因、t5核酸外切酶的编码基因，以及本发明设计的linker基因)，在导入受体细胞后，其转录出的向导rna通过碱基互补配对可以靶向zfx基因，其表达出的融合蛋白(cas12i3蛋白与t5核酸外切酶通过linker连接而成的融合蛋白)使zfx基因靶点上下游的dna双链断裂，并且断裂之后t5 exo能切除突出的悬垂，从而阻止细胞准确修复，增加插入缺失比率，进一步实现基因编辑功能。
[0131]
2、细胞电转染
[0132]
将状态良好的原代绵羊成纤维细胞传到10cm培养皿中并培养至细胞汇合度为80％左右。胰酶消化收集细胞至ep管。用100μl电转液(北京英格恩生物科技有限公司，货号98668-20)悬浮并加入7μg质粒(基因编辑载体)，混合均匀。放入lonza amaxa nucleofector2b细胞核转染仪中，调至程序a-033，电转。电转结束后，立马加入500μl dmem高糖培养基，37℃细胞培养箱静置10min。用含20％ fbs的完全培养基将细胞铺至6孔板中。6h后，换为含15％ fbs的完全培养基。
[0133]
3、t7e1检测编辑效率
[0134]
电转48h后的细胞通过基因组提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d3018-02)提取基因组。将提取好的绵羊基因组，取100ng作为模板进行pcr扩增。扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μl，使用表3中引物进行扩增，其各种成分分别为：dna模板100ng，10μmol/l引物各1μl，primestar(宝日医生物科技有限公司)25μl，用灭菌去离子水补齐至50μl。pcr反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s(33个循环)；最后72℃延伸5min。pcr完成后将pcr产物通过产物回收试剂盒进行回收并测定浓度。
[0135]
表3、靶点周围序列获取引物
[0136][0137]
取上一步pcr回收产物，配制酶切体系如下：扩增产物500ng，cutsmart 1.1μl，ddh2o补至11.5μl。混合均匀后，按照杂交程序：95℃10min；-2℃/s降至85℃；-0.1℃/s降至25℃。加入0.5μl的t7e1(neb(北京)有限公司)，37℃酶切15min，立即加入2μl loading buffer，配制2％的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统观察并分析酶切后结果。
[0138]
通过琼脂糖凝胶电泳图(图1)观察到，融合蛋白t5 exo-xten-cas12i3(n-linker 4组合，氨基酸序列为seq id no.11)的编辑效率为15.5％，比未改造的cas12i3蛋白的编辑效率提高了32.5％；融合蛋白cas12i3-(ggggs)
2-t5 exo(c-linker 1组合，氨基酸序列为seq id no.13)的编辑效率为15.9％，比未改造的cas12i3蛋白的编辑效率提高了35.9％；融合蛋白cas12i3-sggsggsggs-t5 exo(c-linker 3组合，氨基酸序列为seq id no.9)的编辑效率为15.9％，比未改造的cas12i3蛋白的编辑效率提高了35.9％；相比于对照组(未改造的cas12i3蛋白)的11.7％，编辑效率有了较大的提升。
[0139]
实施例3、流式分析法检测不同t5核酸外切酶和linker的核酸分子组合的编辑效率
[0140]
1、tdtomato红色荧光标记的绵羊成纤维细胞的构建
[0141]
1-1、构建crispr/cas9基因打靶载体
[0142]
1-1-1、酶切px458载体
[0143]
酶切体系：px458载体5μg，bbsi 50units，cutsmart 10μl，ddh2o补齐至100μl。37℃条件下酶切5h。酶切完成后，将酶切产物通过产物纯化试剂盒(广州美基生物科技有限公司)进行纯化，得到纯化的px458 bbsi酶切产物。针对山羊zfy基因序列设计靶点(oligo)，按照表4合成靶点序列。
[0144]
表4、sgrna靶点序列
[0145][0146]
1-1-2、oligo退火
[0147]
设计的oligo按照如下退火体系和退火程序进行退火，退火形成退火产物(双链dna)。
[0148]
退火体系：zfy-sgrna-f(100μm)2.5μl，zfy-sgrna-r(100μm)2.5μl，t4 ligase buffer 1μl，ddh2o补齐至10μl。退火程序：金属浴95℃5min，关闭金属浴，打开盖子，待其温度降至室温后取出。
[0149]
1-1-3、连接
[0150]
将上述退火产物稀释50倍，并按照如下连接体系和连接程序与步骤1-1-1中的px458bbsi酶切产物进行连接。
[0151]
连接体系：px458 bbsi酶切产物90ng，退火产物(稀释后)1μl，t4 ligase 0.5μl，t4 ligase buffer 1μl，ddh2o补齐至10μl。连接程序：25℃反应1h。
[0152]
取上述连接产物10μl用于转化，挑菌测序并质粒大提，构建得到crispr/cas9基因打靶载体(即sgrna表达载体)，命名为px458-zfy-sgrna。
[0153]
1-2、构建供体质粒
[0154]
本实验室保存有pcbh-tdtomato-sv40 polya质粒，该质粒的构建过程：首先通过spei和xbai双酶切prosa26-promoter(addgene 21710)，得到酶切后的prosa26-promoter，将seq id no.17(tdtomato-sv40 polya序列)所示的dna分子，通过无缝克隆组装技术与酶切后的prosa26-promoter连接，得到prosa26-tdtomato-sv40 polya。再用kpni和agei双酶切px458获得cbh启动子，以prosa26-tdtomato-sv40 polya为模板，以引物f(5
’‑
tttttttcaggttggaccggtgccaccatggactagtatggtgagcaagggcga-3’)和引物r(5
’‑
taccgtaagttatgtaacggggtacccagcttttgttccctttagt-3’)扩增除rosa26启动子以外的序列，将该序列与cbh启动子序列通过无缝克隆组装技术，构建得到pcbh-tdtomato-sv40polya。
[0155]
该质粒能够在原代山羊成纤维细胞中，正常表达红色荧光。以核酸酶在zfy靶点切割的位置(pam上游3-4bp处)两边的序列作为同源臂(左同源臂(ha-l)为925bp，核苷酸序列为seq id no.18，右同源臂(ha-r)为958bp，核苷酸序列为seq id no.19)。按照表5引物通过pcr扩增左右同源臂后，通过pcr产物回收试剂盒(美基生物科技有限公司)回收。
[0156]
酶切质粒pcbh-tdtomato-sv40 polya，通过无缝克隆组装技术将zfy靶点的左右同源臂对应克隆至pcbh-tdtomato-sv40 polya的两端，构建成质粒ha-l-cbh-tdtomato-sv40polya-ha-r。紧接着在左右同源臂的外侧加入zfy靶点的识别序列，构建hmej(同源臂介导的末端连接，homology-mediated end joining)所需要的供体质粒类型。另外，构建的供体质粒上左右同源臂尽管来源于山羊，但与绵羊的对应位点有极高的同源性，通过ncbi blast，对比显示左同源臂的的同源性为96.11％，右同源臂的为同源性为97.66％。其中绵羊左同源臂的核苷酸序列为seq id no.20，绵羊右同源臂的核苷酸序列为seq id no.21。
[0157]
表5、zfy左右同源臂引物
[0158][0159]
1-3、构建tdtomato红色荧光标记的绵羊成纤维细胞
[0160]
利用本实施例中构建的crispr/cas9基因打靶载体px458-zfy-sgrna和供体质粒ha-l-cbh-tdtomato-sv40polya-ha-r(携带外源基因tdtomato基因，尽管同源臂来源于山羊，但与绵羊对应的同源臂有很高的同源性，因此预计可用于绵羊)将外源基因(tdtomato基因)通过hmej方法介导的重组定点整合到zfy基因的打靶位点中，构建在zfy基因中定点整合外源基因的绵羊成纤维细胞系。具体步骤如下：
[0161]
1-3-1、基因编辑质粒和供体质粒共转染绵羊成纤维细胞
[0162]
取构建好的供体质粒ha-l-cbh-tdtomato-sv40 polya-ha-r 5000ng和携带zfy靶点的基因打靶载体px458(px458-zfy-sgrna)9536ng(摩尔比1:1.5)通过电转(电转步骤同实施例2中步骤2的电转步骤，仅添加的质粒不同)至原代绵羊成纤维细胞，24h后通过流式分选tdtomato和egfp阳性的原代绵羊成纤维细胞，并以约每皿500个细胞铺到细胞培养10cm细胞培养皿中。培养2周后，通过克隆环将细胞培养皿中的细胞单克隆消化至96孔板中培养。
[0163]
1-3-2、定点整合tdtomato的绵羊成纤维细胞筛选
[0164]
待96孔板的细胞克隆长满后，消化细胞，留一半原孔培养，另取一半细胞至1.5ml离心管中。12000rpm，离心3min，弃去上清，加入50μl的细胞鉴定裂解液(细胞鉴定裂解液配制：tris-hcl(1m，ph＝8.0)2ml，triton x-100 0.45ml，np-40 0.45ml，蛋白酶k 0.02g，加入去离子水溶解并定容至50ml，0.22μm滤器过滤)，充分悬浮细胞，按以下程序裂解：65℃，30min；95℃，15min；16℃，∞。获得的裂解液作为dna模版。
[0165]
按照表6设计引物并进行pcr鉴定。
[0166]
表6、定点整合鉴定引物
[0167][0168]
扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μl，其各种成分分别为：dna模板1μl，10μmol/l引物各1μl，primestar(宝日医生物科技有限公司)10μl，用灭菌去离子水补齐至20μl。pcr反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，62℃退火15s，72℃延伸50s(33个循环)；最后72℃延伸5min。pcr结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0169]
结果显示，裂解了16个细胞单克隆，通过pcr鉴定到3个克隆为zfy定点整合的细胞单克隆。同时通过荧光显微镜观察，三个克隆均发出红色的荧光。说明外源基因(tdtomato基因)在打靶位点处发生了定点整合，成功构建了tdtomato红色荧光标记的绵羊成纤维细胞。
[0170]
2、设计靶点序列和构建基因编辑载体
[0171]
本实施例选择上述步骤1构建的zfy定点整合tdtomato的细胞克隆作为后续评估通过不同linker连接t5和cas12i3的编辑效率的细胞株。本实施例针对tdtomato编码序列(genbank accession no.kt878736.1的第2529-3959位(update date 06-oct-2015))设计靶向tdtomato的grna(grna2)，靶点序列为5
’‑
aagaccatctacatggccaagaa-3’(seq id no.16)。通过表7中的引物扩增表达grna序列的dna片段(5
’‑
aaaggacgaaacaccgctctgaccacctgagagaatgtgtgcatagtcacacaagaccatct acatggccaagaatttttttgtacccgttacataa-3’，其中大写字母标识的为直接重复序列+靶点序列+转录终止信号，小写字母标识的为载体同源序列)并将pcr产物通过产物回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)进行回收并测定浓度。
[0172]
表7扩增表达grna的dna片段所用引物(靶向tdtomato基因)
[0173][0174]
通过无缝克隆试剂盒将上述grna片段分别与实施例2中spei和kpni双酶切后的线性对照载体和8种重组载体同源重组成带tdtomato靶点的对照载体和8种重组载体，即为基因编辑载体。
[0175]
将上述构建得到的8种基因编辑载体分别命名为pcbh-n-linker 1-grna2、pcbh-n-linker2-grna2、pcbh-n-linker 3-grna2、pcbh-n-linker 4-grna2、pcbh-c-linker 1-grna2、pcbh-c-linker 2-grna2、pcbh-c-linker 3-grna2、pcbh-c-linker 4-grna2。
[0176]
上述基因编辑载体含有tdtomato基因编辑靶点和本发明设计的融合基因(包括cas12i3蛋白的编码基因、t5核酸外切酶的编码基因，以及本发明设计的linker基因)，在导入受体细胞后，其转录出的向导rna通过碱基互补配对可以靶向tdtomato基因，其表达出的融合蛋白(cas12i3蛋白与t5核酸外切酶通过linker连接而成的融合蛋白)使tdtomato基因靶点上下游的dna双链断裂，并且断裂之后t5 exo能切除突出的悬垂，从而阻止细胞准确修复，增加插入缺失比率，进一步实现基因编辑功能。
[0177]
3、流式细胞术分析tdtomato荧光变化
[0178]
将质粒(基因编辑载体pcbh-n-linker 1-grna2、pcbh-n-linker 2-grna2、pcbh-n-linker3-grna2、pcbh-n-linker 4-grna2、pcbh-c-linker 1-grna2、pcbh-c-linker 2-grna2、pcbh-c-linker 3-grna2、pcbh-c-linker 4-grna2)分别转染到步骤1中构建的tdtomato红色荧光标记的绵羊成纤维细胞中。电转步骤同实施例2中的电转步骤。48h后，通过流式细胞仪分析对照组和不同核酸组合对egfp阳性细胞(只看egfp阳性细胞是因为上述对照载体和8种基因编辑载体上均携带有egfp表达序列，该序列是来源px458载体，egfp阳性细胞代表该细胞是成功转染质粒的细胞，有助减少细胞转染导致的误差)的tdtomato红色荧光强度的变化的影响，具体为计算tdtomato平均荧光强度淬灭的比例以及荧光强度较弱(egfp阳性细胞中tdtomato荧光强度小于103)的细胞数的占比。
[0179]
通过计算egfp阳性细胞的tdtomato平均荧光强度淬灭的比例显示，与对照组相比，经过c-linker 3组合方式改造，提高了tdtomato平均荧光强度淬灭的比例(图2)，表明c-linker3这种组合在tdtomato基因上具有较高的编辑效率，造成较多细胞中tdtomato蛋白功能失活，最终导致较多细胞红色荧光减弱甚至淬灭，使整体的细胞tdtomato荧光强度降低，即tdtomato平均荧光强度淬灭的比例较大。同样的，通过计算egfp阳性细胞中的弱tdtomato荧光强度的(《103)的细胞数占比显示，与对照组相比，经过c-linker 3组合方式改造显著地提高了弱tdtomato荧光强度(《103)的细胞数占比(图3)。同时流式分析显示c-linker 3相比于对照组，tdtomato荧光峰图整体向左平移(图4)，表明c-linker3这种组合在tdtomato基因上具有较高的编辑效率，造成较多细胞中tdtomato蛋白功能失活，最终导致红色荧光减弱甚至淬灭，造成整体细胞群的tdtomato荧光强度减弱。
[0180]
本发明将t5核酸外切酶通过4种linker融合到cas12i3蛋白的n端或c端设计了8种核酸分子组合，通过t7e1酶切实验和流式分析，部分核酸组合(n-linker 4、c-linker 1、c-linker3)，尤其是通过sggsggsggs将t5连接到cas12i3的c端(c-linker 3组合)，显著提高
了cas酶的编辑效率，有较好的应用前景。
[0181]
按照c-linker 3组合方式改造cas12i3蛋白后得到的融合蛋白为cas12i3-sggsggsggs-t5 exo。融合蛋白cas12i3-sggsggsggs-t5 exo的氨基酸序列为seq id no.9，其编码基因为cas12i3-linker 3-t5 exo基因，cas12i3-linker 3-t5 exo基因的核苷酸序列为seq id no.10。
[0182]
按照n-linker 4组合方式改造cas12i3蛋白后得到的融合蛋白为t5exo-xten-cas12i3。融合蛋白t5 exo-xten-cas12i3的氨基酸序列为seq id no.11，其编码基因为t5 exo-linker 4-cas12i3基因，t5 exo-linker 4-cas12i3基因的核苷酸序列为seq id no.12。
[0183]
按照c-linker 1组合方式改造cas12i3蛋白后得到的融合蛋白为cas12i3-(ggggs)
2-t5 exo。融合蛋白cas12i3-(ggggs)
2-t5 exo的氨基酸序列为seq id no.13，其编码基因为cas12i3-linker 1-t5 exo基因，cas12i3-linker 1-t5 exo基因的核苷酸序列为seq id no.14。
[0184]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为下述任一种：a1)氨基酸序列是seq id no.9、seq id no.11或seq id no.13的蛋白质；a2)将seq id no.9、seq id no.11或seq id no.13所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：b1)编码权利要求1所述融合蛋白的核酸分子；b2)编码序列是seq id no.10、seq id no.12或seq id no.14所示的dna分子；b3)核苷酸序列是seq id no.10、seq id no.12或seq id no.14所示的dna分子。3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：c1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；c2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、或含有c1)所述表达盒的重组载体；c3)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物、或含有c1)所述表达盒的重组微生物、或含有c2)所述重组载体的重组微生物；c4)含有权利要求2所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有c1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有c2)所述重组载体的重组宿主细胞。4.权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求3所述生物材料的下述任一种应用：d1)在基因编辑中的应用；d2)在制备基因编辑系统中的应用；d3)在制备基因编辑产品中的应用；d4)在提高基因编辑效率中的应用。5.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括下述至少任一种：e1)权利要求1所述的融合蛋白；e2)权利要求2所述的核酸分子；e3)权利要求3中所述的重组载体。6.根据权利要求5所述的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统还包括grna或grna表达载体。7.权利要求5或6所述的基因编辑系统在基因编辑、制备基因编辑产品或提高基因编辑效率中的应用。8.一种基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3中所述的重组载体和/或权利要求5或6所述的基因编辑系统进行基因编辑的步骤。9.一种提高cas蛋白介导的基因编辑的效率的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：f1)在所述cas蛋白的c端通过linker 3连接t5核酸外切酶，所述linker 3的氨基酸序列为seq id no.3；f2)在所述cas蛋白的n端通过linker 4连接t5核酸外切酶，所述linker 4的氨基酸序
列为seq id no.4；f3)在所述cas蛋白的c端通过linker 1连接t5核酸外切酶，所述linker 1的氨基酸序列为seq id no.1。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将权利要求2所述的核酸分子和编码grna的核酸分子构建到载体中，制备基因编辑载体的步骤。

技术总结
本发明公开了融合蛋白及其在基因编辑中的应用。具体地公开了提高基因编辑效率的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.13的蛋白质。本发明还提供了基因编辑系统和提高Cas12i3蛋白介导的基因编辑效率的方法。本发明通过筛选获得了可显著提高Cas酶编辑效率的T5核酸外切酶和linker编码序列核酸分子组合。按照该组合方式得到的融合蛋白比未改造的Cas12i3蛋白编辑效率显著提高。进一步流式分析结果显示，经过C-linker 3组合方式改造，更显著提高了Cas酶的编辑效率。本发明的基因编辑系统编辑效率高，有更广泛的应用价值和前景。有更广泛的应用价值和前景。


技术研发人员：韩红兵 汪林丽 艾越
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/9/20