1型鸭疫里默氏杆菌PCR鉴定引物及PCR鉴定方法

1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物及pcr鉴定方法
技术领域
1.本发明属于血清型检测方法领域，具体涉及一对1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物，用于1型鸭疫里默氏杆菌血清型的pcr快速鉴定。


背景技术：

2.鸭疫里默氏菌病是一种危害养禽业的重要疾病。鸭疫里默氏菌(riemerellaanatipestifer，ra)为革兰阴性、无芽孢、无鞭毛的棒状杆菌。主要感染鸭、火鸡、鹅及其他家禽，主要引起纤维素性心包炎、肝周炎、心包炎及气囊炎。目前已报道的血清型至少21种，分别用阿拉伯数字命名为1～21型。目前我国ra流行株中，其血清型很多都是1型。
3.目前国内外对ra血清型的鉴定方法普遍采用凝集试验和琼脂扩散沉淀试验，在实际工作中，常会遇到自凝集、交叉凝集或不凝集现象而影响其血清型的判断。
4.泛基因组学技术是目前应用较广的基因组分析技术，使用泛基因组分析可从多个或多种细菌基因组中识别出核心基因与非核心基因，核心基因是存在于某个种属细菌的共有基因，控制着细菌的基本生命活动与遗传进化，而非核心基因则与细菌的血清型、耐药性、毒力等生物学特性有关，通过泛基因组分析，将泛基因中基因分布情况与某种生物学特性进行联合分析，可以找到控制该特性可能的关键基因。
5.传统血清型检测费时费力且不稳定，急需一种针对1型鸭疫里默氏杆菌血清型的pcr快速鉴定方法。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了一对1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物，用于1型鸭疫里默氏杆菌血清型的pcr快速鉴定。
7.1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物，其上游引物核苷酸序列如seq id no:1所示，其下游引物核苷酸序列如seq id no:2所示。
8.所述1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物的目标基因group_2535的核苷酸序列如seq id no:3所示。
9.1型鸭疫里默氏杆菌血清型的pcr快速鉴定方法为：将待测的鸭疫里默氏杆菌纯培养物提取dna，然后配置25μl pcr体系：12.5μl 2
×
taq mix，8.5μl depc水，1μl上游引物seq id no:1，1μl下游引物seq id no:2，2μl dna。将配好的pcr体系进行pcr扩增，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃终延伸10min，取pcr产物5μl，在1％琼脂糖中进行凝胶电泳，电泳后使用凝胶成像仪进行观察，出现165bp目的条带者视为pcr阳性，可判定该菌为1型鸭疫里默氏杆菌。
10.本发明所述1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物的筛选方法为：将41株鸭疫里默氏杆菌进行血清型鉴定，获得血清型鉴定结果；41株鸭疫里默氏杆菌的全基因组数据使用prokka软件进行基因注释，获得注释文件；使用roary软件对注释后的文件进行泛基因组分
析，获得泛基因组功能基因分布文件；将血清型分型结果与泛基因组功能基因分布文件使用scoary软件进行关联性分析，得到泛基因组中可能与血清型相关的基因；将分析得到的基因使用primer软件设计引物；提取41株鸭疫里默氏杆菌dna，使用所设计引物进行pcr扩增与凝胶电泳，比较电泳结果与血清分型结果一致性，从中筛选一致性较好引物作为最终鉴定血清型所用引物，最终得到1对引物，pcr鉴定结果与血清型鉴定结果完全一致，可作为1型鸭疫里默氏杆菌的pcr快速鉴定引物。
11.本发明的有益效果在于：本发明提供一对1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物，用于1型鸭疫里默氏杆菌血清型的pcr快速鉴定，稳定、准确且快速。
附图说明
12.图1为本发明鉴定引物扩增group_2535基因的凝胶电泳图
13.图中：1-41：41株ra，m：marker2000，n：阴性对照。
具体实施方式
14.1.血清型鉴定
15.将41株鸭疫里默氏杆菌送至四川农业大学进行血清型鉴定，血清型鉴定结果如表1所示：
16.表1：41株鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定结果
17.18.[0019][0020]
2.基因组测序与注释
[0021]
41株鸭疫里默氏杆菌基因组数据均已上传ncbi数据库，具体菌株信息与ncbi登录号见表2。将基因组数据使用prokka软件进行注释，获得注释信息文件。
[0022]
表2：菌株背景信息表
[0023]
[0024][0025]
3.泛基因组分析与血清型关键基因筛选
[0026]
将使用prokka注释获得的gff格式注释文件输入roary软件，进行泛基因组分析，得到泛基因组功能基因分布文件，将菌株血清型分型结果整理为规定格式，将整理后的分型结果文件与泛基因组功能基因分布文件输入scoary软件，进行血清型关键基因筛选。选择敏感性与特异性均较高的group_2535、group172、asnb_1 3条基因作为备选基因，使用primer软件设计引物，引物信息如表4。
[0027]
表4备选基因引物信息表
[0028]
[0029][0030]
4.引物效果验证
[0031]
以41株已鉴定血清型的ra为模板，对备选的3条引物分别进行pcr扩增与凝胶电泳，pcr反应体系(25μl)：2
×
taq mix 12.5μl，正、反向引物各1μl，dna模板2μl，depc水8.5μl。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃终延伸10min。取pcr产物5μl，在进行1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，并用凝胶成像系统观察并拍照记录保存。
[0032]
凝胶电泳结果显示，3条引物中，group_1729与asnb_1的血清型分辨效果较差，而group_2535的血清型分辨效果较好，检出了13株血清1型ra，而其他血清型均未检出(图1)，因此group_2535基因所设计引物可用于血清1型ra的初步鉴定。


技术特征：
1.1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物，其特征在于：其上游引物核苷酸序列如seq id no:1所示，其下游引物核苷酸序列如seq id no:2所示。2.如权利要求1所述的1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物，其特征在于：所述引物的目标基因group_2535的核苷酸序列如seq id no:3所示。3.1型鸭疫里默氏杆菌血清型的pcr快速鉴定方法，其特征在于：将待测的鸭疫里默氏杆菌纯培养物提取dna，然后配置25μl pcr体系：12.5μl 2
×
taq mix，8.5μl depc水，1μl上游引物seq id no:1，1μl下游引物seq id no:2，2μl dna,将配好的pcr体系进行pcr扩增，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃终延伸10min，取pcr产物5μl，在1％琼脂糖中进行凝胶电泳，电泳后使用凝胶成像仪进行观察，出现165bp目的条带者视为pcr阳性，可判定该菌为1型鸭疫里默氏杆菌。4.一种权利要求1所述1型鸭疫里默氏杆菌pcr鉴定引物的筛选方法，其特征在于：将41株鸭疫里默氏杆菌进行血清型鉴定，获得血清型鉴定结果；41株鸭疫里默氏杆菌的全基因组数据使用prokka软件进行基因注释，获得注释文件；使用roary软件对注释后的文件进行泛基因组分析，获得泛基因组功能基因分布文件；将血清型分型结果与泛基因组功能基因分布文件使用scoary软件进行关联性分析，得到泛基因组中可能与血清型相关的基因；将分析得到的基因使用primer软件设计引物；提取41株鸭疫里默氏杆菌dna，使用所设计引物进行pcr扩增与凝胶电泳，比较电泳结果与血清分型结果一致性，从中筛选一致性较好引物作为最终鉴定血清型所用引物，最终得到1对引物，pcr鉴定结果与血清型鉴定结果完全一致，可作为1型鸭疫里默氏杆菌的pcr快速鉴定引物。

技术总结
本发明属于血清型检测方法领域，具体涉及一对1型鸭疫里默氏杆菌PCR鉴定引物，用于1型鸭疫里默氏杆菌血清型的PCR快速鉴定。其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明1型鸭疫里默氏杆菌PCR鉴定引物，用于1型鸭疫里默氏杆菌血清型的PCR快速鉴定，稳定、准确且快速。准确且快速。准确且快速。


技术研发人员：李玉保 祝希辉 曹胜亮 司振书 路建彪 刘成
受保护的技术使用者：聊城大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/9/20