结合冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用

1.本公开属于靶向核酸药物领域，具体地涉及到6条可特异性结合冠状病毒核衣壳蛋白的ssdna适配体及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(corona virus disease 2019,covid-19)的爆发影响了世界各地的人类健康和社会经济发展。新型冠状病毒(sars-cov-2)主要由四种结构蛋白构成：刺突蛋白(spike protein，s蛋白)，核衣壳蛋白(nucleocapsid，n蛋白)，膜蛋白(membrane protein，m蛋白)和包膜蛋白(envelope protein，e蛋白)。其中，s蛋白或s蛋白的受体结合域(receptor-binding domain,rbd)是sars-cov-2进入宿主的关键蛋白，与病毒的传染能力密切相关，因此是大多数新冠疫苗开发的抗原靶点。然而，由于sars-cov-2的快速突变，尤其是s蛋白或rbd蛋白的突变，使得针对其开发的疫苗对多种突变株的保护相当有限。因此，寻找其他潜在药物靶标和新药的需求十分迫切。n蛋白是由sars-cov-2编码的核糖核蛋白核心的一个组分，它在病毒的侵入、组装和细胞外过程中发挥重要作用。在所有由sars-cov-2编码的蛋白中，n蛋白在冠状病毒属中高度保守，并且是病毒感染细胞中最丰富的结构蛋白之一。基于冠状病毒n蛋白的进化保守性和在病毒复制中的关键作用，它成为寻找抗病毒药物的有前景的靶点之一。
3.核酸适配体(aptamer)作为一类能特异性识别靶标的ssdna或者ssrna分子，因具有易合成修饰、分子量小、靶标范围广、亲和力高、特异性强等优点，在生物医药、食品安全检测等很多领域具有广泛的应用。因此，开发能够与冠状病毒以高亲和力及特异性结合的核酸适配体对于冠状病毒的预防、诊断与治疗有重要意义。


技术实现要素：

4.本公开提供了可以与冠状病毒核衣壳蛋白(n蛋白)以高亲和力特异性结合的核酸适配体(ssdna适配体)，本公开的ssdna适配体可以快速、高效的进入细胞发挥作用，并在较长时间内均可有效抑制冠状病毒复制与增殖；同时，本公开的ssdna适配体在细胞内具有较好的安全性，是潜在的冠状病毒预防和治疗药物，对于解决冠状病毒的靶向抑制型药物缺乏，开发具有临床转化潜力的冠状病毒增殖抑制型核酸药物有重要意义。
5.本公开的一方面提供了特异性结合冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体，该核酸适配体具有seq id nos:1-6中任一个所示的核苷酸序列，或与seq id nos:1-6中任一个所示的核苷酸序列具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入。
6.在一些实施方式中，所述冠状病毒选自hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov或sars-cov-2。
7.在一些实施方式中，所述冠状病毒选自sars-cov-2、sars-cov或mers-cov。
8.在一些实施方式中，所述冠状病毒选自sars-cov-2原始株、sars-cov-2omicron突变株、sars-cov-2delta突变株、sars-cov-2beta突变株或sars-cov-2gamma突变株。在一些
实施方式中，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰。
9.在一些实施方式中，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。
10.在一些实施方式中，修饰后的核酸适配体能特异性结合冠状病毒核衣壳蛋白。
11.本公开的另一方面提供了核酸适配体的缀合物，该缀合物包括：含有所述核酸适配体的结构域，以及含有用于标记、检测、诊断或治疗的物质的结构域。
12.在一些实施方式中，所述缀合物能特异性结合冠状病毒核衣壳蛋白。
13.在一些实施方式中，所述用于标记、检测、诊断或治疗的物质选自荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna和酶标记中的至少一种。
14.本公开的又一方面提供了核酸适配体的衍生物，包括经修饰的所述核酸适配体。
15.在一些实施方式中，所述修饰包括将所述核酸适配体的核苷酸骨架修饰为硫代磷酸酯骨架，或，将所述核酸适配体修饰为肽核酸。
16.本公开的又一方面提供了一种试剂盒，包括本公开所述的核酸适配体、所述的缀合物或所述的衍生物中的至少一种。
17.本公开的又一方面提供了本公开所述的核酸适配体、所述的缀合物、所述的衍生物或所述的试剂盒在检测冠状病毒核衣壳蛋白中的应用。
18.本公开的又一方面提供了本公开所述的核酸适配体、所述的缀合物、所述的衍生物或所述的试剂盒在纯化冠状病毒核衣壳蛋白中的应用。
19.本公开的又一方面提供了本公开所述的核酸适配体、所述的缀合物、所述的衍生物或所述的试剂盒在检测冠状病毒中的应用。
20.本公开的又一方面提供了本公开所述的核酸适配体、所述的缀合物、所述的衍生物或所述的试剂盒在制备用于诊断和治疗冠状病毒感染的疾病的药物中的应用。
21.在一些实施方式中，所述疾病为sars-cov-2感染的肺炎。
22.本公开具有如下的有益效果：
23.(1)运用磁珠分离法经过正筛、反筛，获得的ssdna适配体亲和力、特异性优良；
24.(2)本公开通过分子对接技术预测了筛选所得ssdna适配体和n蛋白的结合位点，可为多种以n蛋白为靶点的冠状病毒增殖抑制剂的开发与优化提供较好的理论和技术指导；
25.(3)本公开的ssdna适配体可以快速、高效的进入细胞发挥作用；
26.(4)本公开提供了可以抑制n蛋白活性进而抑制冠状病毒增殖的靶向性中和ssdna适配体，且在长时间内依然具有较高的抑制冠状病毒增殖的能力，为冠状病毒快速检测、感染筛查、预防及靶向治疗等提供了新型核酸治疗分子；
27.(5)本公开提供的ssdna适配体在细胞内具有较好的安全性。
附图说明
28.图1显示了本公开通过真病毒实验筛选到6条ssdna适配体。
29.图2显示了通过mfold预测的6条ssdna适配体序列二级结构。
30.图3显示了通过分子对接模拟不同ssdna适配体与sars-cov-2核衣壳蛋白的结合
示意图及具体的结合位点。
31.图4显示了不同ssdna适配体与sars-cov-2的结合位点以及相关位点在新冠病毒突变株中的保守性评估。
32.图5显示了ssdna适配体与sars-cov-2核衣壳蛋白结合的亲和力检测结果。
33.图6显示了ssdna适配体与sars-cov-2omicron突变株rbd蛋白结合的亲和力检测结果，作为适配体与n蛋白亲和力实验的阴性对照。
34.图7显示了激光共聚焦显微镜观察不同转染时间点cy5标记的seq-1022ssdna适配体亚细胞定位及入胞强度结果，比例尺：10μm，mock为空白对照。
35.图8显示了图7中的cy5荧光信号定量分析结果。
36.图9显示了流式细胞术检测不同转染时间点cy5标记的seq-1022ssdna适配体入胞强度结果(a)，以及cy5荧光信号定量分析结果(b)。
37.图10显示了激光共聚焦显微镜观察不同转染浓度的cy5标记的seq-1022ssdna核酸适配体亚细胞定位及入胞强度结果，比例尺：10μm。
38.图11显示了图10中的cy5荧光信号定量分析结果。
39.图12显示了流式细胞术检测不同转染浓度cy5标记的seq-1022ssdna适配体入胞强度结果(a)，以及cy5荧光信号定量分析结果(b)。
40.图13显示了不同ssdna适配体在sars-cov-2原始株入侵细胞24h、48h和72h的抑制效率结果。
41.图14显示了不同ssdna适配体在sars-cov-2omicron(ba.5)突变株入侵细胞24h、48h和72h的抑制效率。
42.图15显示了ssdna适配体在不同添加时间(病毒感染前12h、2h，病毒感染后2h、12h及全程添加组)对sars-cov-2原始毒株感染细胞后的抑制效果。
43.图16显示了不同浓度的ssdna适配体在hek-293t-ace2细胞中的安全性评价。
44.图17显示了不同ssdna适配体和sars-cov的n蛋白结合的亲和性表征结果。
45.图18显示了不同ssdna适配体和mers的n蛋白结合的亲和性表征结果。
46.图19显示了不同ssdna适配体与hcov-nl63、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-hku1四种冠状病毒的亲和性(zdock score)预测(a)及结合位点预测(b)。
47.图20显示了不同ssdna适配体与人血清白蛋白的亲和性预测。
具体实施方式
48.为使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本公开进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本公开，并不用于构成对本公开的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
49.定义
50.除非另有定义，否则本公开使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本公开所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
51.除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。
healthcare)对不同浓度的适配体与n蛋白之间的结合进行分析。pbs和0.005％tween-20溶液混合物作为运行缓冲液，50mm naoh作为再生缓冲液。在注入ssdna适配体后，收集ssdna适配体与n蛋白或适配体与rbd复合物的关联/解离行为的传感器图谱，并使用biaevaluation软件(版本4.1)提供的1:1langmuir模型进行分析，计算得到平衡解离常数kd。
75.入胞实验
76.使用cy5标记的ssdna适配体来检测ssdna适配体入胞情况。首先，将1
×
105个hek-293t细胞接种到12孔板中并孵育过夜。24小时后，用opti-mem培养基代替正常dmem，然后用不同浓度的ssdna适配体转染细胞5小时或用150nm ssdna适配体转染细胞不同的时间。通过共聚焦显微镜观察cy5标记的ssdna适配体在hek-293t细胞中的亚细胞定位。最后，通过facs calibur流式细胞仪(bd，usa)检测cy5荧光信号。平均荧光强度(mfis)通过共聚焦显微镜自带的荧光强度分析软件nikon nis elements进行定量分析。
77.cck-8检测法
78.细胞存活率使用细胞计数试剂盒8(cck-8)进行测试，该试剂盒购置于翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号：(40203es76)。简要地说，hek-293t细胞被接种到96孔板中(每孔10,000个细胞)，在含有5％co2的培养箱中孵育过夜。然后，细胞与多个浓度的ssdna适配体(分别为0.078125、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、50μm)进行孵育。未经适配体处理的细胞被用作对照组。随后，每个孔加入10μl的cck-8溶液，在37℃下孵育2-4小时。孵育后，使用荧光分光光度计测量每个细胞孔的吸光度值(450nm)。
79.实施例1特异识别sars-cov-2n蛋白的ssdna适配体筛选
80.(1)通过thermo scientific
tm ez-link
tm nhs-peg4-biotin试剂盒对sars-cov-2n蛋白进行生物素标记，然后通过羧基磁珠偶联试剂盒将sars-cov-2n蛋白与磁粒子偶联。
81.(2)阳性筛选：将偶联的所有蛋白混合后，加到微文库(购自上海生工(sangon biotech)公司)中，室温旋转孵育90min，磁力架吸附1-2min，用buffer-a和buffer-b分别洗涤两次，最后用50μl的buffer-b重旋。
82.(3)适配体解离：向上述50μl的微珠中，加入1m naoh 50μl，在65℃下孵育30min。再加入2m tris-hcl 40μl去中和naoh，使用磁力架吸附磁性粒子，将上清液转移到1.5ml管中。
83.(4)适配体样品脱盐(平衡过滤柱)：将过滤柱打开，放在1.5ml离心管上，室温1500g离心1min。在树脂层顶部加入300μl buffer-b，1500g离心1min，弃去冲洗液，重复2-3次。将过滤柱放在新的1.5ml管中，将解离液加到过滤柱的顶部，1500g离心2min，收集滤液样品。
84.(5)特异性筛选(单一蛋白分别筛选)：把上述过滤液分成3管(标记1、2、3)，其中3号管为磁珠对照。按如下表1中的孵育#1加入试剂后，室温漩涡孵育1h。取60μl的磁性粒子，用500μl的buffer-a洗涤2次，最后用30μl的buffer-a重悬磁性粒子。分别向2号管、3号管中加5μl磁性粒子，然后将反应管(2号管、3号管)分别在室温下漩涡孵育30min，利用磁力架进行磁粒子分离，用150μl的buffer-a洗涤3次。最后分别加100μl的buffer-a重悬磁珠，取10μl 2号管样品用于下面的pcr实验，制备次级库。
85.表1
[0086][0087]
(6)pcr和凝胶电泳分析：
[0088]
对称pcr反应：使用100μl的1
×
pcr缓冲液(2.5mm mgcl2，0.2mm dntp，0.4μm正向引物(caggggacgcaccaagg，seq id no:4)，0.4μm反向引物(atcacgcagcacgcgggtcatgg，seq id no:5)和1u taq聚合酶)，扩增条件为：预变性94℃，1min、循环条件94℃，30s、50℃，30s和72℃，1min，最后72℃延长3min，一般设置20个循环。
[0089]
不对称pcr反应：使用100μl的1
×
pcr缓冲液(2.5mm mgcl2，0.2mm dntp，正向引物(caggggacgcaccaagg，seq id no:4)，反向引物(cgatgtcagcacgcgggtcatgg，seq id no:6)和1u taq聚合酶)，扩增条件为：预变性94℃，1min、循环条件94℃，30s、50℃，30s和72℃，1min，最后72℃延长3min。
[0090]
使用8-10％非变性聚丙烯酰胺电泳。
[0091]
(7)胶回收：使用异丙醇浓缩ssdna适配体，作为次级库，用于下一轮筛选。
[0092]
(8)多轮重复筛选：重复以上步骤10轮，最后取第1轮的初始液和最后一轮的样品组和磁珠对照进行高通量测序。
[0093]
(9)筛选所得文库的高通量测序样品制备及建库：利用qubit2.0 dna检测试剂盒对ssdna适配体精确定量，以确定pcr反应加入的dna量。引入illumina桥式pcr兼容引物进行扩增。
[0094]
pcr引物序列如下：
[0095]
lib1s1：5
’‑
gggaccagcacacgcataac-3’(seq id no:7)
[0096]
lib2a2：5
’‑
cacggtagcacgcataacac-3’(，seq id no:8)
[0097]
pcr反应体系：2
×
taq master mix 15μl，10μm lib1s1引物1μl，10μm lib2a2引物1μl，dna样品20ng，补充h2o至30μl。
[0098]
pcr反应条件：95℃，30s；95℃，15s、60℃，15s，5个循环；72℃，30s；最后72℃延长5min。
[0099]
(10)为了排除由非序列特异性决定的亲和行为，从二级结构和变体聚类两个方面对富集文库进行进一步优化。选取富集文库中筛选频次排名前1万的核酸分子作为筛选对象，经过聚类分析和结构熵值筛选，鉴定出165条具有潜力的核酸分子，结合上述筛选结果中核酸筛选频次排名以及真病毒中和效果的初步筛选(结果如图1所示)，鉴定出6条具有完整的颈环、发卡结构的核酸分子(表2)，且拥有最多核酸变体，且配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650均能有效抑制病毒在细胞中的增殖。
[0100]
表2
[0101]
适配体序列(5'-3')seq-7gcaggcaaggctctactgacccgttgcttgatcgac(seqidno:1)
seq-59actcccacctttattgagggcggtgacgggttccctc(seqidno:2)seq-333aggggggacacctagattgttggccgtgcggatacg(seqidno:3)seq-1022aggggggacatctggagtgttggccgtgcggatacg(seqidno:4)seq-1280cacctctcaccccacggttctggtccttccccgacg(seqidno:5)seq-4650tccacggtcggtccccttaccactggtccctttgtc(seqidno:6)
[0102]
实验例2 ssdna适配体的验证
[0103]
将实施例1获得的ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650通过mfold软件(http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php)预测ssdna适配体二级结构，结果如图2所示，结果表明筛选到的6条ssdna适配体均可以形成二级结构。
[0104]
进一步通过discovery studio软件预测、模拟ssdna适配体与sars-cov-2核衣壳蛋白结合的结合位点，结果如图3所示。将6条ssdna适配体与sars-cov-2核衣壳蛋白的结合位点的序列在不同sars-cov-2突变株中进行了比对(图4)，结果发现结合位点在不同的sars-cov-2突变株中均没有发生突变，证明了6条ssdna适配体较好的广谱性，可用于抑制不同sars-cov-2突变株的n蛋白活性。
[0105]
实验例3ssdna适配体的亲和性实验
[0106]
对实施例1获得的ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650通过表面等离子体共振(spr)进行sars-cov-2n蛋白亲和性表征，结果如图5所示。结果表明，ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650与sars-cov-2n蛋白结合kd值分别为1.39
×
10-8
，2.03
×
10-7
，1.61
×
10-8
，2.15
×
10-8
，1.17
×
10-7
，6.37
×
10-7
均能高亲和性的与sars-cov-2n蛋白结合。
[0107]
对实施例1获得的ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650通过表面等离子体共振(spr)进行sars-cov-2omicron的rbd蛋白结合亲和力检测作为各种冠状病毒n蛋白与适配体spr实验的阴性对照，结果如图6所示。结果表明，6条ssdna适配体均不能和sars-cov-2omicron rbd蛋白结合。
[0108]
因此，证明了这6条ssdna适配体对sars-cov-2n蛋白具有很好的特异性。
[0109]
实验例4ssdna适配体的入胞实验
[0110]
用150nm ssdna适配体(利用cy5进行红色荧光标记)分别转染细胞1h、3h、5h和8h。通过激光共聚焦显微镜观察不同转染时间点内cy5标记的ssdna适配体在hek-293t细胞中的亚细胞定位及入胞强度，进一步分析ssdna适配体进入hek-293t细胞后在不同时间点的平均荧光强度(mfis)，进一步通过lysotracker对细胞溶酶体进行绿色荧光标记，并对比适配体在胞内是否与溶酶体有共定位现象，示例性的seq-1022ssdna适配体的结果如图7和图8所示。从图7和图8的结果可以看出，随着转染时间的延长，细胞内ssdna适配体的mfis逐渐增加。这说明ssdna适配体seq7、seq333、seq1022能够进入细胞，并在hek293t细胞中积累了越来越多的ssdna适配体。
[0111]
进一步通过流式细胞术检测在不同转染时间点cy5标记的ssdna适配体入胞强度，示例性的seq-1022ssdna适配体的入胞强度结果如图9a所示，cy5荧光信号定量分析结果如图9b所示。结果与共聚焦显微镜观察结果相一致，且在5h时就有大量的ssdna适配体进入了细胞内。
[0112]
分别用浓度为2.44nm、9.77nm、39.06nm、78.13nm、156.25nm和312.50nm的ssdna适配体转染细胞5小时。通过激光共聚焦显微镜观察转染5h后不同浓度的cy5标记的ssdna适配体进入hek-293t细胞的亚细胞定位及入胞强度，进一步统计不同浓度的ssdna适配体进入hek-293t细胞5h后的mfis，示例性的seq-1022ssdna的结果如图10和图11所示。结果证明，在转染5h后，ssdna适配体转染浓度越高，进入细胞中的ssdna适配体就越多，呈剂量依赖性。
[0113]
进一步通过流式细胞术检测不同转染浓度cy5标记的ssdna适配体入胞强度，示例性的seq-1022ssdna适配体的入胞强度结果如图12a所示，cy5荧光信号定量分析结果如图12b所示，结果也与共聚焦显微镜观察结果相一致。
[0114]
实验例5ssdna适配体对sars-cov-2的抑制效果
[0115]
通过真病毒实验分析sars-cov-2入侵细胞的抑制效率。ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650在sars-cov-2原始株入侵细胞24h、48h、72h后的抑制效率如图13所示；ssdna适配体在sars-cov-2omicron突变株入侵细胞24h、48h、72h后的抑制效率如图14所示。由图13和图14的结果可以看出，筛选所获得的ssdna适配体对sars-cov-2原始株及突变株具有高达90％甚至以上的抑制效果。
[0116]
此外，通过对不同适配体添加时间(感染前(pre)、感染后(post)、全程(full-time))的病毒抑制效果开展研究，由图15可见，适配体在病毒感染前12h或感染前后全程添加对新冠病毒的感染具有极高的抑制效果，可能是由于适配体入胞需要一定的时间。这提示所获得的ssdna适配体不仅可以作为新冠病毒有效治疗药物，同时也可以作为其预防药物。
[0117]
实施例6ssdna适配体在细胞中的安全性
[0118]
通过cck-8法评估核酸适配体在细胞水平的安全性，结果如图16所示。结果显示，ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650转染细胞24h后细胞存活率均超过85％，表明上述ssdna适配体在体外具有理想的生物相容性。
[0119]
实施例7ssdna适配体的亲和性实验
[0120]
通过spr对ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650和sars-cov的n蛋白进行亲和性表征，结果如图17所示。数据表明，ssdna适配体seq7、seq333、seq1022与sars-cov的n蛋白结合kd值分别为3.88
×
10-8
，4.72
×
10-8
，4.63
×
10-8
，2.90
×
10-8
，4.21
×
10-11
，2.18
×
10-4
，均能高亲和性的和n蛋白结合。
[0121]
通过spr对ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650与mers-cov的n蛋白进行亲和性表征，结果如图18所示。数据表明，ssdna适配体seq7、seq333、seq1022与mers-cov的n蛋白结合kd值分别为4.99
×
10-7
，2.84
×
10-8
，4.37
×
10-8
，1.82
×
10-7
，2.94
×
10-9
，3.32
×
10-4
，均能高亲和性的和n蛋白结合。
[0122]
实施例8ssdna适配体与其他4种人冠状病毒的亲和性预测及分子对接实验
[0123]
通过pymol 2.4.0软件对ssdna适配体seq-7、seq-333、seq-1022、seq-59、seq-1280、seq-4650和四种感染人的冠状病毒hcov-nl63、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-hku1的n蛋白进行亲和性表征预测，结果如图19所示，6条适配体均与hcov-nl63、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-hku1的n蛋白表现出较高的亲和性(zdock score值超过1000则认为有较高的亲和性，zdock score值未超过1000则认为没有亲和效果，数值越高亲和力越强)，且进一步预
测出seq-1022分别与相应病毒的n蛋白结合位点。该预测实验的阴性对照如图20所示，利用人血清白蛋白分别与6条适配体进行亲和性试验预测，结果显示均没有产生明显的亲和效果。
[0124]
以上表明所获得的ssdna适配体具有冠状病毒的广谱中和效果。
[0125]
本公开的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本公开的技术方案做出的技术变形，均落入本公开的保护范围之内。

技术特征：
1.特异性结合冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体，具有seq id nos:1-6中任一个所示的核苷酸序列，或与seq id nos:1-6中任一个所示的核苷酸序列具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入。2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述冠状病毒选自hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov或sars-cov-2；优选地，所述冠状病毒选自sars-cov-2、sars-cov或mers-cov；更优选地，所述冠状病毒选自sars-cov-2原始株、sars-cov-2omicron突变株、sars-cov-2delta突变株、sars-cov-2beta突变株或sars-cov-2gamma突变株。3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰；优选地，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种；优选地，修饰后的核酸适配体能特异性结合冠状病毒核衣壳蛋白。4.核酸适配体的缀合物，包括：含有权利要求1-3任一项所述核酸适配体的结构域，以及含有用于标记、检测、诊断或治疗的物质的结构域；优选地，所述缀合物能特异性结合冠状病毒核衣壳蛋白；优选地，所述用于标记、检测、诊断或治疗的物质选自荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna和酶标记中的至少一种。5.核酸适配体的衍生物，包括经修饰的权利要求1-3任一项所述的核酸适配体；优选地，所述修饰包括将所述核酸适配体的核苷酸骨架修饰为硫代磷酸酯骨架，或，将所述核酸适配体修饰为肽核酸。6.试剂盒，包括权利要求1-3任一项所述的核酸适配体、权利要求4所述的缀合物或权利要求5所述的衍生物中的至少一种。7.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体，或权利要求4所述的缀合物，或权利要求5所述的衍生物，或权利要求6所述的试剂盒在检测冠状病毒核衣壳蛋白中的应用。8.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体，或权利要求4所述的缀合物，或权利要求5所述的衍生物，或权利要求6所述的试剂盒在纯化冠状病毒核衣壳蛋白中的应用。9.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体，或权利要求4所述的缀合物，或权利要求5所述的衍生物，或权利要求6所述的试剂盒在检测冠状病毒中的应用。10.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体，或权利要求4所述的缀合物，或权利要求5所述的衍生物，或权利要求6所述的试剂盒在制备用于诊断、预防和治疗冠状病毒感染的疾病的药物中的应用。

技术总结
本公开涉及特异性结合冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体。本公开的核酸适配体可以与冠状病毒核衣壳蛋白以高亲和力特异性结合，能够快速、高效的进入细胞发挥作用，并在较长时间内均可有效抑制冠状病毒的病毒复制与增殖；同时，本公开的核酸适配体在细胞内具有较好的安全性，是潜在的冠状病毒预防和治疗药物。是潜在的冠状病毒预防和治疗药物。


技术研发人员：杨明辉 叶国国 李春辉 黄渊余 赵梦圆 田雨欣
受保护的技术使用者：北京理工大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/9/20