一种抑制乙酸乙酯产生的功能微生物的制作方法

1.本发明涉及一种抑制乙酸乙酯产生的功能微生物，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.乙酸乙酯是构成浓香型白酒典型风格的四大酯之一。乙酸乙酯与其它乙酯的量比关系决定了浓香型白酒的品质和风格。例如，乙酸乙酯与己酸乙酯的比值(乙己比)以小于1为好，优质浓香型原酒乙己比大多在0.5左右。因各种原因，浓香型白酒出现乙酸乙酯含量偏高，甚至有的远高于己酸乙酯含量的现象(原酒可达4g
·
l-1
，出窖糟醅可达300mg
·
kg-1
)，这不仅影响了酒体协调性、典型性，更不利于后期勾调，造成生产成本增加，降低企业市场竞争力。因此，只有解决上述乙酸乙酯偏高问题，才能促进中国白酒稳定性的规模化生产，从而促进中国白酒产业健康快速的发展。
3.由微生物(例如酵母和乳酸菌)生产天然乙酸乙酯已经很成熟，并且在历史上一直应用于食品生产。挥发性乙酸乙酯是发酵食品(如啤酒、葡萄酒和乳制品)中最重要的芳香化合物之一。在低浓度下，酯类会产生甜美的果香，但在大量存在时也被认为是异味。乙酸乙酯在乳制品中的浓度范围为50～100mg
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，在啤酒和葡萄酒中的浓度范围为8～64mg
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l-1
，在中国浓香型白酒中的浓度范围1～2g
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l-1
。酵母可以以乙醇或葡萄糖为底物合成大量乙酸乙酯，如马克思克鲁维酵母、异常威克汉姆酵母、费比恩塞伯林德纳氏酵母。
4.如果能利用白酒酿造体系中原有的菌株，抑制目前已知的高产乙酸乙酯的菌株，将有利于促进高品质白酒的规模化生产，进一步实现优质、高效、安全生产。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明从白酒酒醅和环境样品中筛选得到了一株抑制其它微生物产乙酸乙酯且自身具有降解乙酸乙酯功能的微生物，为candida tropicalis lbm101。
6.所述candida tropicalis lbm101，已于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20222053。
7.本发明的菌株是从浓香型白酒酒醅和环境样品中筛选得到的。
8.本发明的菌株具有如下特性：
9.(1)不产乙酸乙酯；
10.(2)能够降解外源添加的乙酸乙酯；
11.(3)额外添加到酒醅后，能够抑制其它微生物产乙酸乙酯，同时能够增加己酸乙酯含量，降低乙己比。
12.本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂，含有candida tropicalis lbm101。
13.所述微生物菌剂是控制酒醅中乙酸乙酯含量、维持正常乙己比的菌剂，所述菌剂以candida tropicalis lbm101为主要微生物。
14.在本发明的一种实施方式中，所述菌剂中，candida tropicalis lbm101的活菌数为105～108cfu/ml。
15.在本发明的一种实施方式中，所述菌剂中，candida tropicalis lbm101的菌浓范围为105～108cfu/ml。
16.在本发明的一种实施方式中，所述菌剂，是制备candida tropicalis lbm101的种子液，然后扩培得到的。
17.在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有本发明的candida tropicalis lbm101菌株的菌体活细胞、冷冻干燥得到的本发明的candida tropicalis lbm101菌株的干菌体、固定化的本发明的candida tropicalis lbm101菌株的细胞、本发明的candida tropicalis lbm101菌株的液体菌剂、本发明的candida tropicalis lbm101菌株的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的本发明的candida tropicalis lbm101菌株。
18.在本发明的一种实施方式中，所述菌剂中还含有任何可以应用于发酵食品或者发酵食品制备的任意种属的菌株，比如地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等等。
19.在本发明的一种实施方式中，所述菌剂中还含有任意能用于发酵食品的载体。
20.本发明的第三个目的是提供一种发酵食品中乙酸乙酯的控制方法，所述方法是将本发明的candida tropicalis lbm101或者含有candida tropicalis lbm101的菌剂，接种到发酵食品的生产过程中，通过抑制其它微生物产乙酸乙酯，进而控制发酵食品中的乙酸乙酯。
21.在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为白酒。
22.在本发明的一种实施方式中，所述方法，是将菌剂的菌液培养至108cfu/ml后，接种至酒醅后的初始接种浓度不低于105cfu/g，从而进行白酒酿造。
23.在本发明的一种实施方式中，所述控制方法，是将candida tropicalis lbm101制备菌株菌液，接种至酒醅进行发酵。
24.在本发明的一种实施方式中，所述控制方法中，candida tropicalis lbm101是按照108cfu/ml制备菌株菌液。
25.在本发明的一种实施方式中，所述培养基为糖蜜培养基。
26.在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：将candida tropicalis lbm101的单菌落接一环于ypd液体培养基中，30℃培养24h。之后将其转接至糖蜜培养基中培养至108cfu/ml扩培菌液，然后将菌液接种至酒醅后的初始接种浓度不低于105cfu/g，从而进行白酒酿造。
27.本发明的第四个目的是提供所述抑制乙酸乙酯产生的功能菌株candida tropicalis lbm101的应用，是应用于食品技术领域，尤其是发酵食品技术领域。
28.在本发明的一种实施方式中，所述应用，是应用于酿造酒、蒸馏酒等方面，比如白酒、葡萄酒、黄酒、果酒方面。
29.在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将本发明的抑制乙酸乙酯产生的菌株添加到白酒、葡萄酒、黄酒或者果酒酿造过程中。
30.在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将本发明的抑制乙酸乙酯产生的菌株添加到酒醅中。
31.本发明的有益效果：
32.本发明得到了一株能够抑制其它微生物产乙酸乙酯且自身具有降解乙酸乙酯功能的微生物，本发明的功能微生物额外添加到酒醅后，能够抑制其它菌株产乙酸乙酯，而对
其他属的微生物结构影响不大，能够维持白酒的正常发酵但能降低白酒中乙酸乙酯含量，同时还能够增加己酸乙酯含量，降低乙己比。本发明还提供了发酵食品中乙酸乙酯的控制策略。
33.生物材料保藏
34.热带假丝酵母candida tropicalis，分类学命名为candida tropicalis lbm101，已于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20222053，保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
35.图1：不同的酵母分别与wickerhamomyces anomalus组合发酵3天(a)和6天(b)乙酸乙酯产生情况；其中，n.g.代表nakaseomyces glabratus lbm64、c.m.代表candida membranifaciens lbm137、c.o.代表candida orthopsilosis lbm225、c.t.代表candida tropicalis lbm101、w.a.代表wickerhamomyces anomalus。
36.图2：不同的酵母在添加2g
·
l-1
的高粱汁培养基中发酵3天(a)和6天(b)降解乙酸乙酯的情况；其中，n.g.代表nakaseomyces glabratus lbm64、c.m.代表candida membranifaciens lbm137、c.o.代表candida orthopsilosis lbm225、c.t.代表candida tropicalis lbm101、w.a.代表wickerhamomyces anomalus。
具体实施方式
37.培养基：
38.ypd液体培养基(g
·
l-1
)：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母浸粉10。
39.高粱汁培养基：将高粱适当破碎，与水按照料液比1：4(w/v)混合，浸泡过夜，添加适量耐高温α-淀粉酶(30u
·
g-1
高粱)，搅拌均匀，高温灭菌锅105℃灭菌1h后，再加入适量耐高温α-淀粉酶，补加1～2倍体积去离子水加热煮沸2h，冷却至60℃，添加适量糖化酶(300u
·
g-1
高粱)，搅拌均匀后60℃糖化4h，2层纱布挤汁过滤，6000r
·
min-1
，10min离心，取上清，于-20℃冻存。使用前稀释至糖度为7
°
bx分装于250ml三角瓶中。
40.糖蜜培养基(g
·
l-1
)：糖蜜80，硫酸镁0.2，硫酸铵3，磷酸二氢钾3。
41.实施例1：抑制乙酸乙酯产生的功能微生物的分离与鉴定
42.(1)菌株分离：将10g新鲜酒醅悬于100ml 0.9％ nacl溶液，在固体培养基涂布后，放于30℃培养箱静置培养3天；划线得到单菌落后挑选单菌落于ypd液体培养基中，每块平板挑选3个平行，在30℃、200r
·
min-1
的摇床中培养1天。
43.(2)将培养好的菌株分别接种至高粱汁培养基中，使得其接种初始浓度为2
×
105cfu
·
ml-1
，每株菌做3个平行，于30℃发酵6天。
44.(3)菌株培养后发酵液乙酸乙酯的检测：样品与无水乙醚按1：1的比例混合萃取乙酸乙酯，取上层液体，经0.22μm的有机系滤头过滤，采用气相色谱法检测。
45.色谱条件：
46.氢火焰离子化检测器(flame ionization detector，fid)，载气为高纯氮气(n2)，cp-wax 57cb色谱柱(50m
×
0.25mm
×
0.25μm)，进样口温度220℃，检测器温度220℃，氢气流量40ml
·
min-1
，空气流量400ml
·
min-1
，柱流量2.0ml
·
min-1
，分流比5：1，进样量1μl。检测
orthopsilosis lbm225和cctcc no：m 20222053分别与wickerhamomyces anomalus组合发酵使得乙酸乙酯产量在第3天分别降低了44.11％、22.10％、37.43％和63.09％；发酵结束(6天)时，nakaseomyces glabratus lbm64与wickerhamomyces anomalus组合发酵使得乙酸乙酯提高了5.82％，candida membranifaciens lbm137、candida orthopsilosis lbm225和cctcc no：m 20222053分别与wickerhamomyces anomalus组合发酵使得乙酸乙酯分别降低了0.59％、5.77％和48.83％。
61.综上，cctcc no：m 20222053抑制wickerhamomyces anomalus产乙酸乙酯的效果最强且抑制效果持久。
62.实施例3：功能微生物candida tropicalis lbm101在降解乙酸乙酯中的应用
63.(1)将酒醅中分离得到的几株不产或低产乙酸乙酯的菌株candida tropicalis lbm101(即cctcc no：m 20222053)、candida orthopsilosis lbm225、candida membranifaciens lbm137、nakaseomyces glabratus lbm64以及高产乙酸乙酯的菌株(wickerhamomyces anomalus)于ypd液体培养基中活化，使得种子液浓度达到107cfu
·
ml-1
。
64.(2)分别将种子液接种到含有2g
·
l-1
乙酸乙酯的高粱汁培养基中，接种量为3％，在30℃培养箱静置培养6天，每株菌做3个平行。
65.(3)菌株培养后发酵液乙酸乙酯的检测：样品与无水乙醚按1：1的比例混合萃取乙酸乙酯，取上层液体，经0.22μm的有机系滤头过滤，采用气相色谱法检测。
66.色谱条件：
67.氢火焰离子化检测器(flame ionization detector，fid)，载气为高纯氮气(n2)，cp-wax 57cb色谱柱(50m
×
0.25mm
×
0.25μm)，进样口温度220℃，检测器温度220℃，氢气流量40ml
·
min-1
，空气流量400ml
·
min-1
，柱流量2.0ml
·
min-1
，分流比5：1，进样量1μl。检测时的升温程序为：60℃保持5min。
68.结果如图2所示。
69.wickerhamomyces anomalus主要发挥产酯功能，没有明显的降解乙酸乙酯现象。发酵3天时，nakaseomyces glabratus lbm64、candida membranifaciens lbm137、candida orthopsilosis lbm225和cctcc no：m 20222053与不加菌的空白对照相比分别降解了8.2％、5.5％、21.9％和18.5％的乙酸乙酯；在发酵结束(6天)时，这四株菌与不加菌的空白对照相比分别降解了12.5％、11.2％、44.0％和31.6％的乙酸乙酯。综上，c.orthopsilosis lbm225和cctcc no：m20222053降解乙酸乙酯的能力较强。
70.实施例4：candida tropicalis lbm101菌株的应用
71.将cctcc no：m 20222053活化后，将其转接至28l的糖蜜培养基中扩培至108cfu
·
ml-1
，然后将其冻干成菌粉，以105cfu
·
g-1
的初始浓度接种至酒醅中，发酵4个月，取酒样检测其乙酸乙酯和己酸乙酯变化情况。
72.对照样品(未添加菌剂)即为不添加本发明的cctcc no：m 20222053的按照上述方法得到的样品。表2为功能菌株添加与否对乙酸乙酯含量、己酸乙酯含量以及乙己比变化情况。结果显示，利用本发明的功能菌株对酒醅进行干预，酒样中乙酸乙酯含量降低了16.94％，己酸乙酯含量增加了31.64％，显著降低了乙己比，从而达到调控乙酸乙酯的目的。
73.表2功能菌株添加与否对乙酸乙酯、己酸乙酯的含量以及乙己比的变化情况
[0074][0075]
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

技术特征：
1.一株热带假丝酵母candida tropicalis，其特征在于，所述candida tropicalis已于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20222053。2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂权利要求1所述的保藏编号cctcc no：m 20222053的candida tropicalis。3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的主要微生物为权利要求1的cctcc no：m 20222053。4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1的candida tropicalis的菌体活细胞、冷冻干燥得到的candida tropicalis的干菌体、固定化的candida tropicalis菌株的细胞、candida tropicalis的液体菌剂、candida tropicalis菌株的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的candida tropicalis。5.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有任何能够以应用于发酵食品或者发酵食品制备的任意种属的菌株，或者还含有任意能用于发酵食品的载体。6.一种发酵食品中乙酸乙酯的控制方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1的candida tropicalis或者含有权利要求1的candida tropicalis的菌剂，接种到发酵食品的生产过程中。7.根据权利要求6所述的控制方法，其特征在于，所述发酵食品为白酒；可选地，所述方法，是将菌剂的菌液培养至108cfu/ml以上后，接种至酒醅后的初始接种浓度不低于105cfu/g，从而进行白酒酿造。8.权利要求1所述的candida tropicalis的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是应用于食品技术领域；可选地，所述应用，是应用于酿造酒、蒸馏酒生产。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是将candida tropicalis菌株添加到白酒、葡萄酒、黄酒或者果酒酿造过程中。

技术总结
本发明公开了一种抑制乙酸乙酯产生的功能微生物，属于微生物技术领域。本发明得到了一株能够抑制其它微生物产乙酸乙酯且具有降解乙酸乙酯功能的微生物，本发明的功能微生物额外添加到酒醅后，能够降低白酒中乙酸乙酯含量且能够增加己酸乙酯含量，从而降低乙己比。本发明还提供了发酵食品中乙酸乙酯的控制策略。略。略。


技术研发人员：杜海 徐岩 赵东 郑佳 付妍
受保护的技术使用者：宜宾五粮液股份有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/9/20