无抗生素、无IPTG诱导剂的发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法与流程

无抗生素、无iptg诱导剂的发酵生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法
技术领域
1.本发明属于微生物发酵工程技术领域，涉及一种无抗生素、无iptg诱导剂的发酵生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法。


背景技术：

2.母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，hmos)是成熟人乳中含量最丰富的成分之一，而2
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岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2'-fl)又是hmos中含量最高的成分，故受到了广泛的关注。2
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岩藻糖基乳糖能选择性地刺激双歧杆菌和乳杆菌等益生菌的生长，通过形成受体类似物来抑制肠道病原体对肠道的黏附，从而保护婴儿不受肠道病原体(如大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌等)的感染。
3.目前2
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岩藻糖基乳糖的商业化生产方法主要包括化学合成法、酶催化合成法和微生物发酵法三种方式。但是化学合成法的反应过程复杂、副产物高，难以实现高效生产，并且从合成产物中除去副产物的成本也较高。酶催化合成法的原料昂贵，催化活性较低，难以实现工业化、规模化生产。全细胞生物合成法是利用微生物进行发酵的方法，其利用大肠杆菌(escherichia coli)活细胞以乳糖作为原料发酵生产2
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岩藻糖基乳糖，但是其存在发酵周期长、时空产率低等问题，无法满足2
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岩藻糖基乳糖的工业生产需求。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是大肠杆菌全细胞生物合成法生产2
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岩藻糖基乳糖中存在的发酵周期长、时空产率低等问题。因此，本发明提供一种无抗生素、无iptg诱导剂的发酵生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，以解决上述技术问题。利用本发明的重组大肠杆菌进行发酵，并对该重组大肠杆菌的发酵培养条件进行了优化，缩短了2
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岩藻糖基乳糖的发酵时间，提高了其时空产率。
5.本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
6.本发明第一方面提供一种发酵生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，其包括如下步骤：
7.(1)将重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，得到初始发酵体系；
8.(2)当所述初始发酵体系的溶解氧回升时，采用补料培养基以5～10ml/l/h的补料速度对所述初始发酵体系进行补料，并控制补料后的发酵体系的ph为6.8～7.2；
9.(3)待所述补料后的发酵体系的od
600
升至18～22时，将发酵温度调节至25～30℃并维持该发酵温度，加入乳糖，然后继续发酵并间断补充乳糖；发酵结束后得到2
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岩藻糖基乳糖；
10.所述重组大肠杆菌为lacz基因部分失活，wacj基因和pfka基因缺失，lacy基因和fuct基因过表达的大肠杆菌bl21(λde3)；
11.进一步，所述重组大肠杆菌过表达manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因，和/或，所述重组大肠杆菌的fuck-fuci基因、araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因中的两种、三种、四种或五种缺失；
12.在某一较佳实施方案中，lacz基因的部分失活指的是其编码产生的β-半乳糖苷酶的表达量相对于野生型大肠杆菌而言有了大幅度降低，但是仍然具有3％至5％的β-半乳糖苷酶的表达量。
13.在某一具体实施方案中，所述pfka基因的登录号为caq34267.1。
14.在某一具体实施方案中，所述gmm基因的登录号为caq32463.1。
15.在某一具体实施方案中，所述nudk基因的登录号为caq32837.1。
16.在某一具体实施方案中，所述araa基因的登录号为caq30580.1。
17.在某一具体实施方案中，所述rhaa基因的登录号为caq34255.2。
18.在某一具体实施方案中，所述rcsa基因的登录号为wp_182557942.1。
19.在某一具体实施方案中，所述lacy基因的登录号为caq30818.2。
20.在某一具体实施方案中，所述manb基因的登录号为caq32460.1。
21.在某一具体实施方案中，所述manc基因的登录号为caq32461.1。
22.在某一具体实施方案中，所述gmd基因的登录号为caq32465.2。
23.在某一具体实施方案中，所述wcag基因的登录号为caq32464.1。
24.在某一具体实施方案中，所述fuct基因的登录号为rtl12957.1。
25.在某一较佳实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过整合lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
26.araa基因和nudk基因缺失；
27.rhaa基因和gmm基因缺失；
28.araa基因和rhaa基因缺失；
29.araa基因和gmm基因缺失；
30.rhaa基因和nudk基因缺失；
31.nudk基因和gmm基因缺失。
32.在某一较佳实施方案中，所述fuct基因构建于pet28a质粒上。
33.在某一较佳实施方案中，所述lacy基因的过表达是lacy基因整合入大肠杆菌基因组pfka基因处实现。
34.在某一较佳实施方案中，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上。
35.在某一较佳实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
36.araa基因和gmm基因缺失；
37.rhaa基因和nudk基因缺失；
38.nudk基因和gmm基因缺失；
39.araa基因和nudk基因缺失；
40.rhaa基因和gmm基因缺失；
41.araa基因和rhaa基因缺失；
42.araa基因、rhaa基因和nudk基因缺失；
43.araa基因、nudk基因和gmm基因缺失；
44.araa基因、rhaa基因和gmm基因缺失；
45.araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因缺失。
46.在某一较佳实施方案中，lacy基因、fuct基因分别构建于pet28a质粒载体上。
47.在某一较佳实施方案中，lacy基因、fuct基因共同构建于pet28a质粒载体上。
48.在某一较佳实施方案中，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上。
49.在某一较佳实施方案中，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsa基因，所述过表达rcsa基因是通过整合rcsa基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现。
50.在某一较佳实施方案中，rcsa基因整合入大肠杆菌基因组pfka基因处。
51.本发明所述的araa基因与rhaa基因编码将l-岩藻糖转变为墨角藻糖的相关酶，本发明所述的rcsa基因、gmm基因和nudk基因为gdp-甘露糖降解相关的基因，所述pfka基因为果糖-6-磷酸降解相关的基因，所述lacy基因编码乳糖透性酶lacy；所述rcsa基因为转录调控因子。
52.本发明涉及从头合成gdp-岩藻糖必需的四个酶：所述manb基因编码合成磷酸甘露糖变位酶，所述manc基因编码合成甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(mannose-1-phosphate guanosyltransferase)，所述gmd基因编码合成gdp-甘露糖-4,6-脱水酶，所述wcag基因编码合成gdp-l-岩藻糖合酶。
53.在某一较佳实施方案中，接种后至发酵结束之间的时间为100～118h，例如为105h、108h、110h、112h或115h。
54.在某一较佳实施方案中，步骤(3)中，在所述补料后的发酵体系的od
600
升至20时调节所述发酵温度至28～30℃。
55.在某一较佳实施方案中，步骤(3)中，在所述补料后的发酵体系的od
600
升至19、20或21时调节所述发酵温度。
56.在某一较佳实施方案中，步骤(3)中，调节所述发酵温度为26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。
57.在某一较佳实施方案中，步骤(3)中，加入乳糖为添加终浓度为5～30g/l的乳糖，例如10g/l、15g/l、20g/l或25g/l。
58.在某一较佳实施方案中，步骤(3)中，间断补充乳糖以调整所述乳糖的终浓度为5～30g/l(初始终浓度)，例如为10g/l、15g/l、20g/l或25g/l。
59.在某一较佳实施方案中，步骤(3)中，每隔2～4h补充乳糖，例如每隔3h。
60.在补充乳糖后的发酵的过程中，每隔2～4小时补充乳糖，以将乳糖的终浓度调回5～30g/l，并控制每次补充乳糖后的发酵体系的ph值为6.6～7.0。例如，补充乳糖的时间间隔可以为2、3或4小时。又例如，每次补充乳糖后的发酵体系的ph值可以为6.8、6.9或7.0。
61.乳糖的终浓度指的是乳糖刚加入时的初始浓度，并非发酵过程中的浓度。因为随着发酵过程的进行，乳糖的实时浓度会有所变化。
62.在某一较佳实施方案中，步骤(3)还包括发酵结束后提取2
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岩藻糖基乳糖的步骤，所述提取2
’‑
岩藻糖基乳糖的方式可为本领域常规，优选使用沸水浴的方式。
63.在某一较佳实施方案中，步骤(2)中，当所述初始发酵体系的溶解氧回升至50％以
上时进行所述补料，例如溶解氧回升至50％、55％、60％或65％以上时进行补料。
64.当搅拌和/或调节通气量也无法使溶解氧维持在30
±
3％并且大幅度回升至50％以上时表明甘油耗尽，此时，需要继续补料，以使菌体继续生长。
65.在某一较佳实施方案中，步骤(2)中，所述补料培养基包括：500～600g/l甘油、20～30g/l蛋白胨、10～20g/l酵母提取物以及15～20g/lnacl。
66.在某一较佳实施方案中，步骤(2)中，所述补料培养基的补料速度为7.5～8ml/l/h、例如7.6ml/l/h、7.7ml/l/h、7.8ml/l/h或7.9ml/l/h。
67.在某一较佳实施方案中，步骤(2)中，控制补料后的发酵体系的ph为6.8～7.0，例如6.9。
68.在某一较佳实施方案中，步骤(2)中，在进行所述补料后控制所述补料后的发酵体系的溶解氧水平在30
±
3％的范围内，例如溶解氧水平为27％、28％、29％、30％、31％、32％或33％。
69.本发明实施方案一共有两种类型的补料。步骤(2)中的补料为第一类补料，其采用补料培养基进行补料。当初始发酵体系的溶解氧回升时，说明甘油已经耗尽，菌种由于缺少足够的碳源而不再生长和耗氧，此时需要补充碳源等营养物质，以使菌种能够继续生长和维持活力，以达到能够发酵的菌体密度(例如od
600
达到18～22)。因此，第一类补料发生于菌体生长阶段。步骤(3)中的补料为第二类补料，其是对底物乳糖进行补充。当菌体密度达到相应的od值时，该菌种能够利用底物来生成2
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岩藻糖基乳糖产物，故底物会不断消耗。当底物消耗至一定量时，需要补充底物的量，以便尽可能多使底物生成产物。由于发酵过程中发酵液具有一定的挥发量，以及发酵过程中需要取样检测，在补料过程中整个发酵体系的体积不会超过5l。即便超过5l，则只需要放出少部分发酵液，并不会对整个发酵体系的产物浓度产生较大的影响。
70.本发明实施方案从多途径提升了2
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岩藻糖基乳糖的发酵产量和时空产率，具体如下：本发明构建了经过基因改造的重组大肠杆菌，其与出发菌株相比敲除了部分基因，抑制了出发菌株将底物转化为副产物。另外，本发明的重组大肠杆菌相对于出发菌株也过表达了部分基因，有利于使底物朝着2
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岩藻糖基乳糖生成的方向发生反应。此外，本发明通过两次补料过程以及控制发酵条件使得重组大肠杆菌菌株的生长状态更好，发酵时2
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岩藻糖基乳糖的产量更高。
71.在某一较佳实施方案中，步骤(1)中，所述发酵培养基包括：18～20g/l甘油、12～15g/l蛋白胨、8～10g/l酵母提取物和12～15g/lnacl。
72.甘油主要用作重组大肠杆菌生长时的碳源，甘油的浓度可以为18、19或20g/l。蛋白胨的终浓度可以为12、12.5、13、14或15g/l。酵母提取物(yeast extract)又称酵母抽提物，其制备方法具体参见gb/t 20886.2-2021。酵母提取物的终浓度可以为8、8.5、9、9.5或10g/l。氯化钠的终浓度可以为12、12.5、13、14或15g/l。
73.在某一较佳实施方案中，所述发酵培养基还包括镁盐。
74.在某一较佳实施方案中，步骤(1)中，所述发酵培养基的ph为7.1～7.2。
75.在某一较佳实施方案中，步骤(1)中，所述发酵培养基用于在发酵容器例如发酵罐中供所述重组大肠杆菌生长。
76.在某一较佳实施方案中，步骤(1)中使用总体积为5l的发酵罐。
77.在某一较佳实施方案中，步骤(1)，5l的发酵罐中发酵培养基的添加量可以为2l。
78.在某一较佳实施方案中，步骤(1)中，所述重组大肠杆菌以种子液的形式接种至所述发酵培养基中。
79.在某一较佳实施方案中，步骤(1)中，所述种子液的体积占所述发酵培养基体积的1％～10％。
80.在某一较佳实施方案中，步骤(1)中，所述重组大肠杆菌在进行所述接种时的初始温度为35～37℃，例如36℃。
81.在某一较佳实施方案中，步骤(1)中，在进行所述接种后，通过通气和/或搅拌使所述初始发酵体系的溶解氧控制在30
±
3％，例如溶解氧水平为27％、28％、29％、30％、31％、32％或33％。
82.通气量和/或搅拌速度根据溶解氧的实时值而相应调整。本发明中的溶解氧含量用空气饱和度百分数(％)来表示。
83.在某一较佳实施方案中，所述种子液的制备方法包括如下步骤：将所述重组大肠杆菌接入种子培养基中，得到种子培养体系；对所述种子培养体系进行振荡培养，得到所述种子液。
84.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基包括：10～12g/l蛋白胨、5～16g/l酵母提取物、10～12g/l氯化钠；还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/l甘油或1～10g/l的葡萄糖、0.01～0.15mol/l磷酸盐缓冲液、10～100mg/l酸性氨基酸和0.1～1.0mg/l维生素。
85.其中，上述数值范围指的是各种组分在种子培养基中的终浓度。并且上述数值范围的含义是某一组分在对应数值范围内的任意一个数字均可以，而并不限于每个数值范围的端点值。例如，蛋白胨的终浓度可以为10、10.5、11、11.5或12g/l。酵母提取物(yeast extract)又称酵母抽提物，其制备方法具体参见gb/t 20886.2-2021。酵母提取物的终浓度可以为5、5.2、5.3、5.5、5.6、5.8、5.9、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16g/l。酵母提取物既可以作为重组大肠杆菌生长时的氮源，也可以为其提供多种生长因子等。氯化钠的终浓度可以为10、10.5、11、11.5或12g/l。甘油主要用作重组大肠杆菌生长时的碳源，其终浓度可以为1、5、8、9、10、12、15、17、18或20g/l。葡萄糖终浓度可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10g/l。磷酸盐缓冲液可以为重组大肠杆菌的生长提供磷源(例如用于菌体本身核酸、磷脂等的合成，用于质粒的复制)等，也可以作为ph值的缓冲液以及维持重组大肠杆菌菌体细胞的渗透压等。磷酸盐缓冲液可以是kh2po4和k2hpo4、或者nah2po4和na2hpo4，kh2po4的终浓度可以为2、2.1、2.2、2.3、2.31、2.5、2.8或3g/l，nah2po4的终浓度可以为1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.3、2.4、2.5、或2.6g/l。k2hpo4的终浓度可以为12、14、15、16、16.43、18、19或20g/l，na2hpo4的终浓度可以为10、11、12、13、14、15或16g/l。酸性氨基酸的终浓度可以为10、20、30、40、50、60、80、90或100mg/l。维生素的终浓度可以为0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9或1.0mg/l。
86.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基包括10～12g/l蛋白胨、5～10g/l酵母提取物、10～12g/l氯化钠、1～20g/l甘油、2～3g/l kh2po4或1.76～2.64g/l nah2po4、12～20g/l k2hpo4或9.78～16.3g/l na2hpo4、30～80mg/l酸性氨基酸和0.1～0.5mg/l维生素。
87.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基包括10g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、
10g/l氯化钠、5g/l甘油、2.31g/l的kh2po4或2.04g/l的nah2po4、16.43g/l的k2hpo4或13.39g/l的na2hpo4、50mg/l的酸性氨基酸和0.1mg/l的维生素。
88.经实验证明，如果种子培养基中添加了kh2po4或nah2po4、k2hpo4或na2hpo4、酸性氨基酸、维生素中的一种或一种以上，则该种子培养基比不添加上述物质的种子培养基所培养出来的重组大肠杆菌种子液的生长状态更好，在移入发酵培养基中进行发酵时所得产物的产量更高。
89.在一些实施方案中，种子培养基中不含有葡萄糖。与出发菌种(大肠杆菌bl21(λde3))相比，本发明实施方案中的重组大肠杆菌更容易利用甘油作为碳源，并且在同等条件下以甘油作为碳源的发酵产物的产量优于以葡萄糖作为碳源的发酵产物的产量。
90.在某一较佳实施方案中，所述种子培养体系处于摇瓶中。
91.在某一较佳实施方案中，所述重组大肠杆菌以菌液接种入所述种子培养基或以单菌落的形式接入所述种子培养基中；和/或。
92.在某一较佳实施方案中，所述重组大肠杆菌以菌液接入所述种子培养基时的接种量为0.1％至10％(v/v)，例如可以为1％、2％、3％、5％、8％、9％或10％。
93.本发明的接种量是指指移入的菌液或种子液的体积与待接入的培养或发酵液的体积的百分比。
94.在某一较佳实施方案中，当所述种子培养体系的od
600
达到0.6～2.0时终止培养，例如当所述培养基的od
600
达到0.8～1.8时终止培养，如果用于发酵，则od
600
达到1.8～2.0时终止培养并移入发酵罐中进行发酵。在某一较佳实施方案中，所述酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸中的一种或两种。
95.在某一较佳实施方案中，所述维生素选自vb1、vb2或vb12中的一种或多种。
96.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基的ph值为6.0～7.0，例如为6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或6.9。
97.在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的温度为35～37℃，例如，可以为35℃、36℃或37℃。
98.在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的速度为180～240rpm，例如，可以为180rpm、200rpm、220rpm或240rpm。
99.在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的时间为6～10h，例如，可以为6h、7h、8h、9h或10h。
100.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基用于在例如总体积为150ml或250ml的培养容器中培养重组大肠杆菌，以得到重组大肠杆菌的种子液。该种子液可用于后继对种子的扩大化培养或者用作工业化发酵的种子液。
101.在本发明步骤(3)结束后，得到含2
’‑
岩藻糖基乳糖的发酵液，其中2
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岩藻糖基乳糖的含量为100～120g/l，时空产率为0.953～1.20g/l/h。
102.本发明第二方面提供一种发酵液，所述发酵液如本发明第一方面所述的方法获得。
103.本发明第三方面提供一种发酵体系，其包含重组大肠杆菌和发酵培养基，所述重组大肠杆菌如为lacz基因部分失活，wacj基因和pfka基因缺失，lacy基因和fuct基因过表达的大肠杆菌bl21(λde3)；
104.进一步，所述重组大肠杆菌过表达manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因，和/或，所述重组大肠杆菌的fuck-fuci基因、araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因中的两种、三种、四种或五种缺失；
105.所述发酵培养基包括：18～20g/l甘油、12～15g/l蛋白胨、8～10g/l酵母提取物和12～15g/lnacl。
106.在某一较佳实施方案中，所述发酵体系包括重组大肠杆菌的种子液和所述发酵培养基。
107.在某一较佳实施方案中，所述种子液的体积占所述发酵培养基体积的1％～10％。
108.在某一较佳实施方案中，所述发酵体系的ph为6.8～7.2，优选6.8～7.0。
109.在某一较佳实施方案中，所述发酵体系还包括补料培养基，所述补料培养基包括：500～600g/l甘油、20～30g/l蛋白胨、10～20g/l酵母提取物以及15～20g/l nacl。
110.本发明所述的发酵体系中的重组大肠杆菌如下所定义。
111.在某一具体实施方案中，所述pfka基因的登录号为caq34267.1。
112.在某一具体实施方案中，所述gmm基因的登录号为caq32463.1。
113.在某一具体实施方案中，所述nudk基因的登录号为caq32837.1。
114.在某一具体实施方案中，所述araa基因的登录号为caq30580.1。
115.在某一具体实施方案中，所述rhaa基因的登录号为caq34255.2。
116.在某一具体实施方案中，所述rcsa基因的登录号为wp_182557942.1。
117.在某一具体实施方案中，所述lacy基因的登录号为caq30818.2。
118.在某一具体实施方案中，所述manb基因的登录号为caq32460.1。
119.在某一具体实施方案中，所述manc基因的登录号为caq32461.1。
120.在某一具体实施方案中，所述gmd基因的登录号为caq32465.2。
121.在某一具体实施方案中，所述wcag基因的登录号为caq32464.1。
122.在某一具体实施方案中，所述fuct基因的登录号为rtl12957.1。
123.在某一较佳实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过整合lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
124.araa基因和nudk基因缺失；
125.rhaa基因和gmm基因缺失；
126.araa基因和rhaa基因缺失；
127.araa基因和gmm基因缺失；
128.rhaa基因和nudk基因缺失；
129.nudk基因和gmm基因缺失。
130.在某一较佳实施方案中，所述fuct基因构建于pet28a质粒上。
131.在某一较佳实施方案中，所述lacy基因的过表达是lacy基因整合入大肠杆菌基因组pfka基因处实现。
132.在某一较佳实施方案中，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上。
133.在某一较佳实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载
体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
134.araa基因和gmm基因缺失；
135.rhaa基因和nudk基因缺失；
136.nudk基因和gmm基因缺失；
137.araa基因和nudk基因缺失；
138.rhaa基因和gmm基因缺失；
139.araa基因和rhaa基因缺失；
140.araa基因、rhaa基因和nudk基因缺失；
141.araa基因、nudk基因和gmm基因缺失；
142.araa基因、rhaa基因和gmm基因缺失；
143.araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因缺失。
144.在某一较佳实施方案中，lacy基因、fuct基因分别构建于pet28a质粒载体上。
145.在某一较佳实施方案中，lacy基因、fuct基因共同构建于pet28a质粒载体上。
146.在某一较佳实施方案中，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上。
147.在某一较佳实施方案中，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsa基因，所述过表达rcsa基因是通过整合rcsa基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现。
148.在某一较佳实施方案中，rcsa基因整合入大肠杆菌基因组pfka基因处。
149.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过整合lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因和nudk基因缺失。
150.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过整合lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的rhaa基因和gmm基因缺失。
151.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过整合lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因和rhaa基因缺失。
152.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过整合lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因和gmm基因缺失。
153.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过整合lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的rhaa基因和nudk基因缺失。
154.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过整合lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的nudk基因和gmm基因缺失。
155.在本发明的一些实施方案中，所述fuct基因构建于pet28a-fuct表达质粒上。
156.在本发明的一些实施方案中，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于
pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上。
157.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是通过将lacy基因整合入大肠杆菌基因组pfka基因处来实现。
158.在本发明的一些实施方案中，所述重组大肠杆菌为：
159.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：lacy
△
araa
△
nudk；
160.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：lacy
△
rhaa
△
gmm；
161.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：lacy
△
araa
△
rhaa；
162.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：lacy
△
araa
△
gmm；
163.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：lacy
△
rhaa
△
nudk；
164.或，含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：lacy
△
nudk
△
gmm。
165.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因和gmm基因缺失。
166.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的rhaa基因和nudk基因缺失。
167.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的nudk基因和gmm基因缺失。
168.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因和nudk基因缺失。
169.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的rhaa基因和gmm基因缺失。
170.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因和rhaa基因缺失。
171.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因、rhaa基因和nudk基因缺失。
172.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的
基因组的araa基因、nudk基因和gmm基因缺失。
173.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因、rhaa基因和gmm基因缺失。
174.在本发明的一些实施方案中，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因缺失。
175.在本发明的一些实施方案中，lacy基因、fuct基因分别构建于pet28a质粒载体上。
176.在本发明的一些实施方案中，lacy基因、fuct基因共同构建于pet28a质粒载体上。
177.在本发明的一些实施方案中，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上。
178.在本发明的一些实施方案中，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsa基因，所述rcsa基因是通过整合rcsa基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现。
179.在本发明的一些实施方案中，rcsa基因整合入大肠杆菌基因组pfka基因处。
180.在本发明的一些实施方案中，所述重组大肠杆菌为
181.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa；
182.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
araa
△
rhaa；
183.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
araa
△
gmm；
184.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
araa
△
nudk；
185.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
rhaa
△
gmm；
186.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
rhaa
△
nudk；
187.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
nudk
△
gmm；
188.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
araa
△
rhaa
△
nudk；
189.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
araa
△
nudk
△
gmm；
190.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
araa
△
rhaa
△
gmm；
191.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
araa
△
rhaa
△
gmm
△
nudk；
192.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
araa
△
gmm；
193.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
rhaa
△
nudk；
194.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
nudk
△
gmm；
195.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
araa
△
nudk；
196.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
rhaa
△
gmm；
197.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
araa
△
rhaa；
198.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
araa
△
rhaa
△
nudk；
199.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
araa
△
nudk
△
gmm；
200.含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
araa
△
rhaa
△
gmm；
201.或，含有pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc和pet28a-fuct-lacy表达载体的bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj
△
pfka
△
araa
△
rhaa
△
gmm
△
nudk。
202.在某一较佳实施方案中，本发明所述发酵体系中所述发酵培养基还包括镁盐。
203.在某一较佳实施方案中，本发明所述发酵体系中所述发酵培养基的ph为7.1～7.2。
204.在某一较佳实施方案中，所述镁盐为硫酸镁，所述镁盐的含量为0.1～1g/l，例如0.24g/l。
205.在某一较佳实施方案中，所述种子液的制备方法包括：将所述重组大肠杆菌接入种子培养基中，得到种子培养体系；对所述种子培养体系进行振荡培养，得到所述种子液。
206.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基包括：10～12g/l蛋白胨、5～16g/l酵母提取物、10～12g/l氯化钠；还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/l甘油或1～10g/l的葡萄糖、0.01～0.15mol/l磷酸盐缓冲液、10～100mg/l酸性氨基酸和0.1～1.0mg/l维生素。
207.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基包括10～12g/l蛋白胨、5～10g/l酵母提取物、10～12g/l氯化钠、1～20g/l甘油、2～3g/l kh2po4或1.76～2.64g/l nah2po4、12～20g/l k2hpo4或9.78～16.3g/l na2hpo4、30～80mg/l酸性氨基酸和0.1～0.5mg/l维生素。
208.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基包括10g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、10g/l氯化钠、5g/l甘油、2.31g/l的kh2po4或2.04g/l的nah2po4、16.43g/l的k2hpo4或13.39g/l的na2hpo4、50mg/l的酸性氨基酸和0.1mg/l的维生素。
209.在某一较佳实施方案中，所述种子培养体系处于摇瓶中。
210.在某一较佳实施方案中，所述重组大肠杆菌以菌液接种入所述种子培养基或以单菌落的形式接入所述种子培养基中；和/或。
211.在某一较佳实施方案中，所述重组大肠杆菌以菌液接入所述种子培养基时的接种
量为0.1％至10％(v/v)。
212.在某一较佳实施方案中，当所述种子培养体系的od
600
达到0.6～2.0时终止培养。在某一较佳实施方案中，所述酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸中的一种或两种。
213.在某一较佳实施方案中，所述维生素选自vb1、vb2或vb12中的一种或多种。
214.在某一较佳实施方案中，所述种子培养基的ph值为6.0～7.0。
215.在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的温度为35～37℃。
216.在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的速度为180～240rpm。
217.在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的时间为6～10h。
218.本发明第四方面提供一种重组大肠杆菌、如本发明所述的发酵体系或如本发明所述的发酵液在以乳糖为底物发酵生产2
’‑
岩藻糖基乳糖中的应用；所述重组大肠杆菌如本发明第一方面所述方法中所定义。
219.本发明的积极进步效果在于：
220.本发明以大肠杆菌bl21(λde3)为原始菌种得到了重组大肠杆菌，并对该重组大肠杆菌的发酵培养条件进行了优化，缩短了2
’‑
岩藻糖基乳糖的发酵时间，提高了其时空产率。
具体实施方式
221.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例进行详细的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。
222.以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下说明并不视为对本发明的保护范围的限制。
223.实施例1 lacz基因的功能失活
224.研究发现，2'-岩藻糖基乳糖的生物合成以乳糖为受体，以gdp-l-岩藻糖为糖基供体。本实施例使用大肠杆菌bl21(λde3)作为出发菌株，构建了lacz基因功能部分失活的大肠杆菌。该大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的表达量相对于野生型大肠杆菌而言有了大幅度降低，但是仍然具有3％至5％的β-半乳糖苷酶的表达量，且不容易消耗底物乳糖。
225.本实施例中，bl21(λde3)菌株购自novagen公司，货号69450-m。pcas9质粒、ptargetf市售可得。无缝克隆试剂盒clonexpress ii one step cloning kit购买自诺唯赞。pet28a/pcdfduet-1质粒购买自novagen公司。乳糖购自国药试剂。lb液体培养基含有终浓度为10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l氯化钠(nacl)。卡那霉素抗性lb平板是在lb液体培养基的成分的基础上添加终浓度为20g/l的琼脂、50μg/ml的卡那霉素而制成。卡那霉素和壮观霉素抗性lb平板是在lb液体培养基的成分的基础上添加终浓度为20g/l的琼脂、50μg/ml的卡那霉素、50μg/ml的壮观霉素而制成。本发明各个实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加j.萨姆
·
布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
226.本实施例利用《一种lacz失活的基因工程菌及其在人乳寡糖生产中的应用》的专利申请所记载的技术得到lacz基因部分失活的bl21(λde3)宿主细胞(即底盘细胞)，记为
bl21(λde3)lacz(δm15)。该专利申请的申请号为202111422436.6，申请日为2021年11月26日。该专利申请的全文以引用的方式并入本技术文件中。用于使lacz基因部分失活的n20序列如表1所示。
227.表1 lacz基因部分失活的n20序列
228.序列名称具体序列seq id no:δm15 n20序列cgtcgtgactgggaaaaccc1
229.实施例2底盘细胞和相关载体的构建
230.(1)底盘细胞的构建
231.在实施例1的底盘细胞的基础上，敲除wacj和fuck-fuci基因。采用δwacj n20序列敲除wacj基因，采用δfuck/i n20序列敲除fuck-fuci基因。敲除wcaj和fuck/i的相关序列见下表2。实验方法和技术参考实施例1。最终制得底盘细胞bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj。
232.表2敲除wcaj和fuck/i的相关序列
233.序列名称具体序列seq id no:δwacj n20序列gtggtgttccagatgttggg2δfuck/i n20序列ttgagttggtgcgtttgttg3
234.在底盘bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj基础上对基因rcsa、pfka、gmm、nudk、lacy、araa与rhaa进行删除、替换或过表达，对将l-岩藻糖转变为墨角藻糖的araa与rhaa两个基因进行删除；对gdp-甘露糖降解相关的rcsa、gmm、nudk三个基因进行删除；对果糖-6-磷酸降解相关的基因pfka进行删除或置换；对乳糖透性酶lacy表达，对转录调控因子rcsa基因过表达。根据基因登陆号，查找基因序列，设计sgrna(n20序列)，基因操作过程中所使用的sgrna序列(n20序列)以及相关基因的登录号见表3，本轮实验共得到27种底盘细胞，底盘细胞详细信息见表4。
235.表3相关基因登录号以及n20序列
236.基因名称登录号n20序列seq id no:pfkacaq34267.1gtttctgacatgatcaaccg4gmmcaq32463.1ggatttcaccactcactatg5nudkcaq32837.1gctgctggataacgacgaac6araacaq30580.1gccgtgggacagtatcgata7rhaacaq34255.2cgccgggcacttccacccga8rcsawp_182557942.1//lacycaq30818.2//
237.表4底盘细胞基因型信息
[0238][0239]
其中，pfka：：rcsa表示采用rcsa替换掉pfka基因，pfka：：lacy表示采用lacy基因替换掉pfka基因。
△
表示基因删除或敲除。
[0240]
(2)重组质粒的构建
[0241]
pbcgw重组质粒构建：将编码从头合成gdp-岩藻糖必需的四个酶的基因以ncoi和hindiii作为酶切位点插入到载体pcdfduet-1进行外源表达，四个酶分别为磷酸甘露糖变位酶(manb，genbank caq32460.1)，甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(mannose-1-phosphate guanosyltransferase，manc，genbankcaq32461.1)，gdp-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd，genbankcaq32465.2)，gdp-l-岩藻糖合酶(wcag，genbankcaq32464.1)。以bl21(de3)基因组为模板，利用引物对f1-for与f2-rev扩增出gmd与wcag基因，为片段1，引物对f3-for与f4-rev扩增出manb与manc基因，为片段2；以pcdfduet-1质粒为模板，利用引物对f2-for与f3-rev扩增出片段3，f4-for与f1-rev引物对扩增出片段4。使用无缝克隆试剂盒，连接片段1、
片段2、片段3、片段4，得到重组质粒pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc，简写为pbcgw。
[0242]
fuct重组质粒构建：全合成ncbi上公开的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因fuct序列(genbankrtl12957.1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司(上海市松江区香闵路698号)合成，所用酶切位点为nde i、hind iii，克隆至pet28a载体，所得重组质粒命名为pet28a-fuct，简写为pfuct。
[0243]
pet28a-fuct-lacy重组质粒构建：以bl21(de3)基因组为模板，利用引物对f5-for与f6-rev扩增出lacy基因，为片段1；以上述pet28a-fuct为模板，利用引物对f6-for与f5-rev扩增出片段2，使用无缝克隆试剂盒连接片段1与片段2，得到重组质粒pet28a-fuct-lacy-，简写为pfuct-lacy。上述各个片段、引物对的序列如表5所示。
[0244]
表5引物序列
[0245][0246]
表6中的底盘细胞含有从头合成gdp-岩藻糖的各种酶。详述如下：若以葡萄糖为碳源，则葡萄糖在进入底盘细胞后会生成葡萄糖-6-磷酸，随后生成果糖-6磷酸。若以甘油为碳源，则甘油在进入底盘细胞后会生成甘油-3-磷酸，随后也转变为果糖-6-磷酸。果糖-6-磷酸在甘露糖6-磷酸异构酶(mana)作用下生成甘露糖-6-磷酸，甘露糖-6-磷酸在磷酸甘露糖变位酶(manb)作用下生成甘露糖-1-磷酸，甘露糖-1-磷酸在甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(manc)作用下生成gdp-甘露糖，gdp-甘露糖在gdp-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)作用下生成gdp-4-酮基-6-脱氧甘露糖，gdp-4-酮基-6-脱氧甘露糖在gdp-l-岩藻糖合酶(wcag)作用下生成gdp-l-岩藻糖。gdp-l-岩藻糖随后与乳糖反应产生2
’‑
岩藻糖基乳糖。
[0247]
实施例3重组大肠杆菌的构建及其菌液的生产
[0248]
将实施例2中所构建的重组质粒pbcgw与pet28a-fuct共转至实施例2中得到的底盘22/23/24/25/26/27；将实施例2中所构建的重组质粒pbcgw与pfuct-lacy共转至实施例2中得到的底盘0/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/16/17/18/19/20/21以及对照底盘，涂布卡那霉素与壮观霉素双抗平板，37℃过夜培养，挑取单菌落，接种50μg/ml卡那霉素与100μg/ml壮观霉素的lb基础培养基。在上述的培养过程结束后，从双抗平板上挑取单菌落，于甘油管中冻存。将单菌落或者甘油管中的菌液以1％(v/v)的接种量接种于lb基础培养基中进行复苏，于37℃、220rpm的条件下培养8h得到用于接入摇瓶培养的菌液。
[0249]
以8号bl21(λde3)lacz(
△
m15)
△
fuck-fuci
△
wacj pfka：：rcsa
△
araa
△
rhaa
△
nudk为例做进一步的实验。
[0250]
在上述的培养过程结束后，从壮观霉素抗性lb平板上挑取单菌落，于甘油管中冻存。将挑取的单菌落或者将从甘油管中复苏后的菌液以1％(v/v)的接种量接种于100ml的
lb液体培养基中，于37℃、220rpm的条件下培养至瓶内菌液od
600
＝0.8，得到用于接入种子培养基的菌液。
[0251]
将上述菌液按照1％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，于37℃、220rpm的条件下培养。待种子液的od
600
值至2.0时接种至5l发酵罐中。
[0252]
本实施例所采用的壮观霉素抗性lb平板配制方法如下：称取10g蛋白胨(tryptone)、5g酵母提取物(yeast extract)、10g氯化钠(nacl)和20g琼脂，煮沸后加水定容至1000ml，高温灭菌处理，然后冷却至50℃左右，加入壮观霉素储存液至其终浓度为25μg/ml，摇匀后倒至平板中，凝固后得到壮观霉素lb抗性平板。高温灭菌后所得到的培养液中，蛋白胨的终浓度为10g/l，酵母提取物的终浓度为5g/l，氯化钠的终浓度为10g/l，琼脂的含量为20g/l(2％)。
[0253]
本实施例所采用的种子培养基含有以下组分：10g/l蛋白胨、15g/l酵母提取物、10g/l氯化钠、5g/l甘油、2.31g/l kh2po4、16.43g/l k2hpo4、50mg/l天冬氨酸、0.1mg/l vb2。上述数值指的是上述各组分在种子培养基中的最终浓度。本实施例所用酵母提取物遵循gb/t 20886.2-2021。
[0254]
实施例4：补料时ph值对5l发酵罐发酵结果的影响
[0255]
本实施例采用了5l离线灭菌玻璃发酵罐来验证补料时ph值对5l发酵罐中发酵结果的影响。本实施例所用的试剂如下：
[0256]
发酵培养基(用于5l发酵罐)各组分含量：20g/l甘油、15g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、15g/l氯化钠(nacl)。发酵培养基的制备方法如下：称取上述物料，用水溶解至消前体积2l(即加入消泡剂之前的体积)，然后加入消泡剂(二甲基硅油和sio2)，搅匀后用30％氢氧化钠调节ph至7.2左右，灭菌后备用。
[0257]
补料培养基：600g/l甘油、30g/l蛋白胨、20g/l酵母提取物、20g/l nacl。
[0258]
本技术实施例中的培养基均灭菌后使用。灭菌的条件为在115℃～121℃下高温灭菌30min。
[0259]
实施例4-1：发酵开始之前对发酵罐内部进行灭菌处理。然后在无菌环境下向发酵罐内注入发酵培养基。待实施例3的种子液的od
600
值至2.0时，按照1％(v/v)接种量将种子液接种至5l发酵罐中。接种完毕后调节起始温度为37℃、通气量为2l/min、搅拌转速为200rpm，并监测发酵液中溶解氧的含量。根据溶解氧的具体值对应调节搅拌的转速，以使溶解氧维持在30
±
3％。待溶解氧无法维持在30
±
3％而大幅度回升至50％以上时表明甘油耗尽，然后采用补料培养基按照5ml/l/h的速度进行补料，并继续搅拌以控制溶解氧水平恒定在30
±
3％，同时控制ph值在6.8。
[0260]
当发酵液的od
600
升至20时，说明该菌液浓度符合发酵的要求，可以进行后继发酵。此时，降低发酵液温度至25℃并且后继维持在该温度下进行发酵，然后添加终浓度为10g/l的乳糖。
[0261]
之后每隔2h取样，并检测所取样品中乳糖各自的浓度。根据所计算出来的乳糖的浓度，采用300g/l的乳糖补料。每次补料时重新将乳糖的终浓度调节为10g/l。
[0262]
在发酵118h结束之后，取发酵液10ml沸水浴20min，于12000rpm离心5min，弃去沉淀，取上清液，稀释十倍后过滤。取稀释并且过滤后的上清液10μl作为进样，采用高效液相色谱分析检测2
’‑
岩藻糖基乳糖含量。高效液相色谱分析的参数为：2
’‑
岩藻糖基乳糖的检
测采用装备有视差检测器的高效液相色谱仪，使用的色谱柱型号为sepax hp-amide 250*4.6nm，5μm。柱温使用35℃。流动相：乙腈：水＝68：32。流速为1.4ml/min。浓度为1mg/ml。进样量为10μl。
[0263]
根据检测结果可知，实施例4-1的2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为93.5g/l，时空产率为0.792g/l/h。
[0264]
实施例4-2：与实施例4-1相比，不同之处是：采用补料培养基进行补料时控制ph值为7.0。根据检测结果可知，2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为99.2g/l，时空产率为0.841g/l/h。
[0265]
实施例4-3：与实施例4-1相比，不同之处在于：本对比例在采用补料培养基进行补料时控制ph值在7.2。在发酵118h结束之后，测得2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为94.4g/l，时空产率为0.800g/l/h。
[0266]
由实施例4-3、实施例4-1和实施例4-2的结果可知，在补料时控制ph值为7.0时，最终生成的产物含量高于补料ph值为6.8或7.2时的产物含量，这说明该重组大肠杆菌菌株适宜在ph值为7.0的条件下生长，并且在该ph值时生长状态良好，从而得到含量较高的发酵产物2
’‑
岩藻糖基乳糖。
[0267]
实施例5：诱导温度对5l发酵罐发酵结果的影响
[0268]
实施例4确定了补料ph为7.0，实施例5在此基础上研究诱导温度对5l发酵罐中发酵结果的影响。
[0269]
实施例5-1：与实施例4-2相比，不同之处在于：当od
600
升至20后，降低发酵液温度至28℃并且后继维持在该温度下进行发酵。在发酵100h时取样分析，测得2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为99.4g/l，时空产率为0.994g/l/h。由此可知，在产物生成阶段，当发酵液温度为28℃时，达到如实施例4的发酵水平(25℃时发酵118h)所需的发酵时间仅为100h，二者相比缩短15.2％，时空产率提高了0.153g/l/h。因此，在不影响产量的情况下，提高产物生成阶段的诱导生产温度至28℃有助于缩短发酵时间。
[0270]
实施例5-2：与实施例5-1相比，不同之处在于：当od
600
升至20后，降低发酵液温度至30℃并且后继维持在该温度下进行发酵。在发酵100h时取样分析，测得2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为87g/l，时空产率为0.870g/l/h。这说明在产物生成阶段，当发酵液温度为30℃时，产物的产量反而低于在发酵液温度为28℃时的发酵产物的产量。由此说明，在不影响产量的情况下，产物生成阶段的发酵液温度为28℃时发酵效率最高，产物的产量最高。
[0271]
实施例6菌体生长阶段的补料速率对5l发酵罐发酵结果的影响
[0272]
本实施例涉及补料速率对5l发酵罐发酵结果的影响实验。
[0273]
实施例6-1：同实施例5-1(补料时控制ph值为7.0，发酵液温度28℃，补料速率为5ml/l/h)。发酵100h后取样分析，2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为98.4g/l，时空产率为0.984g/l/h。
[0274]
实施例6-2：与实施例6-1相比，补料速度为7.5ml/l/h。发酵100h后取样分析，2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为101.9g/l，时空产率为1.019g/l/h。
[0275]
实施例6-3：与实施例6-1相比，补料速度为10ml/l/h。发酵100h后取样分析，测得2
’‑
岩藻糖基乳糖的含量为96.9g/l，时空产率为0.969g/l/h。
[0276]
根据实施例6-1、实施例6-2和实施例6-3的实验结果可知，若补料速率过低，或者补料速率太高，则会降低产物的生成量，说明在菌体生长阶段的补料速率影响到菌种的生
长状况，进而影响到发酵产物的时空产率。
[0277]
实施例7
[0278]
实施例7-1：同实施例4-3，不同的是所用菌株为序号为24的菌液，在发酵118h之后，测得2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为91.4g/l，时空产率为0.774g/l/h。
[0279]
实施例7-2：同实施例6-2，不同的是所用菌株为序号为24的菌液，在发酵100h之后，测得2
’‑
岩藻糖基乳糖含量为98.9g/l，时空产率为0.989g/l/h。
[0280]
本技术各个实施例的培养条件和产物产量如下表6所示。
[0281]
表6 5l玻璃离线灭菌发酵罐产量表
[0282][0283]
从上表中可知，通过对多个菌种的改造和发酵条件的优化(例如，ph值、诱导温度和补料速度)，本技术实施例的发酵时间可以从118h降低到100h，并且时空产率能够高达1.019g/l/h，可用于产业化发酵，满足对2
’‑
岩藻糖基乳糖的工业化产量需求。

技术特征：
1.一种发酵生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)将重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，得到初始发酵体系；(2)当所述初始发酵体系的溶解氧回升时，采用补料培养基以5～10ml/l/h的补料速度对所述初始发酵体系进行补料，并控制补料后的发酵体系的ph为6.8～7.2；(3)待所述补料后的发酵体系的od
600
升至18～22时，将发酵温度调节至25～30℃并维持该发酵温度，加入乳糖，然后继续发酵并间断补充乳糖；发酵结束后得到2
’‑
岩藻糖基乳糖；其中，所述重组大肠杆菌为lacz基因部分失活，wacj基因和pfka基因缺失，lacy基因和fuct基因过表达的大肠杆菌bl21(λde3)；进一步，所述重组大肠杆菌过表达manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因，和/或，所述重组大肠杆菌的fuck-fuci基因、araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因中的两种、三种、四种或五种缺失；优选地，所述fuct基因的登录号为rtl12957.1。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌中，所述lacy基因的过表达是通过整合所述lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：araa基因和nudk基因缺失；rhaa基因和gmm基因缺失；araa基因和rhaa基因缺失；araa基因和gmm基因缺失；rhaa基因和nudk基因缺失；nudk基因和gmm基因缺失；优选地，所述fuct基因构建于pet28a质粒上；和/或，所述lacy基因整合入大肠杆菌基因组的pfka基因处；和/或，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：araa基因和gmm基因缺失；rhaa基因和nudk基因缺失；nudk基因和gmm基因缺失；araa基因和nudk基因缺失；rhaa基因和gmm基因缺失；araa基因和rhaa基因缺失；araa基因、rhaa基因和nudk基因缺失；araa基因、nudk基因和gmm基因缺失；araa基因、rhaa基因和gmm基因缺失；araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因缺失；
优选地，lacy基因、fuct基因分别构建于pet28a质粒载体上；和/或，lacy基因、fuct基因共同构建于pet28a质粒载体上；和/或，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上；更优选地，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsa基因，所述过表达rcsa基因是通过整合所述rcsa基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现；例如所述rcsa基因整合入大肠杆菌基因组的pfka基因处。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中：在所述补料后的发酵体系的od
600
升至20时调节所述发酵温度至28～30℃；和/或，加入乳糖为添加终浓度为5～30g/l例如10g/l的乳糖；和/或，间断补充乳糖以调整所述乳糖的终浓度为5～30g/l例如10g/l；和/或，每隔2～4h补充乳糖；和/或，还包括发酵结束后提取2
’‑
岩藻糖基乳糖的步骤，优选使用沸水浴的方式。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中：当所述初始发酵体系的溶解氧回升至50％以上时进行所述补料；和/或，所述补料培养基包括：500～600g/l甘油、20～30g/l蛋白胨、10～20g/l酵母提取物以及15～20g/l nacl；和/或，所述补料培养基的补料速度为7.5～8ml/l/h；和/或，控制补料后的发酵体系的ph为6.8～7.0；和/或，在进行所述补料后控制所述补料后的发酵体系的溶解氧水平在30
±
3％的范围内。6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基包括：18～20g/l甘油、12～15g/l蛋白胨、8～10g/l酵母提取物和12～15g/l nacl；优选地，所述发酵培养基还包括镁盐；和/或，所述发酵培养基的ph为7.1～7.2；和/或，所述发酵培养基用于在发酵容器中供所述重组大肠杆菌生长，例如发酵容器为总体积为5l的发酵罐；和/或，所述重组大肠杆菌以种子液的形式接种至所述发酵培养基中；优选地，所述种子液的体积占所述发酵培养基体积的1％～10％；和/或，所述重组大肠杆菌在进行所述接种时的初始温度为35～37℃；和/或，在进行所述接种后，通过通气和/或搅拌使所述初始发酵体系的溶解氧控制在30
±
3％。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子液的制备方法包括如下步骤：将所述重组大肠杆菌接入种子培养基中，得到种子培养体系；对所述种子培养体系进行振荡培养，得到所述种子液。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括：10～12g/l蛋白胨、5～16g/l酵母提取物、10～12g/l氯化钠；还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/l甘油或1～10g/l的葡萄糖、0.01～0.15mol/l磷酸盐缓冲液、10～100mg/l酸性氨基酸和0.1～1.0mg/l维生素；较佳地，所述种子培养基包括10～12g/l蛋白胨、5～10g/l酵母提取物、10～12g/l氯化
钠、1～20g/l甘油、2～3g/l kh2po4或1.76～2.64g/l nah2po4、12～20g/l k2hpo4或9.78～16.3g/l na2hpo4、30～80mg/l酸性氨基酸和0.1～0.5mg/l维生素。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述种子培养体系处于摇瓶中，和/或，所述重组大肠杆菌以菌液接种入所述种子培养基或以单菌落的形式接入所述种子培养基中；和/或，所述重组大肠杆菌以菌液接入所述种子培养基时的接种量为0.1％至10％(v/v)；和/或，当所述种子培养体系的od
600
达到0.6～2.0时终止培养；和/或，所述酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸中的一种或两种；和/或，所述维生素选自vb1、vb2或vb12中的一种或多种；和/或，所述种子培养基的ph为6.0～7.0；和/或，所述振荡培养的温度为35～37℃；和/或，所述振荡培养的速度为180～240rpm；和/或，所述振荡培养的时间为6～10h。10.一种发酵液，其特征在于，所述发酵液由如权利要求1～9任一项所述的方法获得。11.一种发酵体系，其特征在于，其包含重组大肠杆菌和发酵培养基，所述重组大肠杆菌为lacz基因部分失活，wacj基因和pfka基因缺失，lacy基因和fuct基因过表达的大肠杆菌bl21(λde3)；进一步，所述重组大肠杆菌过表达manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因，和/或，所述重组大肠杆菌的fuck-fuci基因、araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因中的两种、三种、四种或五种缺失；优选地，所述fuct基因的登录号为rtl12957.1；所述发酵培养基包括：18～20g/l甘油、12～15g/l蛋白胨、8～10g/l酵母提取物和12～15g/l nacl；优选地，所述发酵培养基还包括镁盐，和/或，所述发酵培养基的ph为7.1～7.2；较佳地，所述发酵体系包括重组大肠杆菌的种子液和所述发酵培养基，所述种子液的体积优选占所述发酵培养基体积的1％～10％；更佳地，所述发酵体系的ph为6.8～7.2，优选6.8～7.0；和/或，所述发酵体系还包括补料培养基，所述补料培养基包括：500～600g/l甘油、20～30g/l蛋白胨、10～20g/l酵母提取物以及15～20g/l nacl。12.如权利要求11所述的发酵体系，其特征在于，所述重组大肠杆菌为满足(i)或(ii)中的任一项：(i)所述lacy基因的过表达是通过整合所述lacy基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：araa基因和nudk基因缺失；rhaa基因和gmm基因缺失；araa基因和rhaa基因缺失；araa基因和gmm基因缺失；rhaa基因和nudk基因缺失；
nudk基因和gmm基因缺失；优选地，所述fuct基因构建于pet28a质粒上；和/或，所述lacy基因整合入大肠杆菌基因组的pfka基因处；和/或，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上；(ii)所述lacy基因的过表达是将所述lacy基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fuck-fuci基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：araa基因和gmm基因缺失；rhaa基因和nudk基因缺失；nudk基因和gmm基因缺失；araa基因和nudk基因缺失；rhaa基因和gmm基因缺失；araa基因和rhaa基因缺失；araa基因、rhaa基因和nudk基因缺失；araa基因、nudk基因和gmm基因缺失；araa基因、rhaa基因和gmm基因缺失；araa基因、rhaa基因、gmm基因和nudk基因缺失；优选地，lacy基因、fuct基因分别构建于pet28a质粒载体上；和/或，lacy基因、fuct基因共同构建于pet28a质粒载体上；和/或，所述manb基因、manc基因、gmd基因和wcag基因位于pcdfduet-gmd-wcag-manb-manc共表达质粒上；更优选地，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsa基因，所述过表达rcsa基因是通过整合所述rcsa基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现；例如所述rcsa基因整合入大肠杆菌基因组的pfka基因处。13.如权利要求11或12所述的发酵体系，其特征在于，所述种子液的制备方法包括如下步骤：将所述重组大肠杆菌接入种子培养基中，得到种子培养体系，对所述种子培养体系进行振荡培养，得到所述种子液；较佳地，所述种子液的制备方法满足以下条件中的一项或多项：(1)所述种子培养基包括：10～12g/l蛋白胨、5～16g/l酵母提取物、10～12g/l氯化钠；还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/l甘油或1～10g/l的葡萄糖、0.01～0.15mol/l磷酸盐缓冲液、10～100mg/l酸性氨基酸和0.1～1.0mg/l维生素，优选地，所述种子培养基的ph为6.0～7.0；(2)所述重组大肠杆菌以菌液接种入所述种子培养基或以单菌落的形式接入所述种子培养基中；优选地，所述重组大肠杆菌以菌液接入所述种子培养基时的接种量为0.1％至10％(v/v)；(3)当所述种子培养体系的od
600
达到0.6～2.0时终止培养；(4)所述酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸中的一种或两种；和/或，所述维生素选自vb1、vb2或vb12中的一种或多种。
14.如权利要求10所述的发酵液或如权利要求11～13任一项所述的发酵体系在以乳糖为底物发酵生产2
’‑
岩藻糖基乳糖中的应用。

技术总结
本发明提供了一种无抗生素、无IPTG诱导剂的发酵生产2


技术研发人员：杨昊 张源 闵涛玲 徐泓 刘雨柔 张志尧 李妙
受保护的技术使用者：虹摹生物科技（上海）有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/9/20