一种检测MDM2基因SNP309多态性的引物，探针组合和方法与流程

一种检测mdm2基因snp309多态性的引物，探针组合和方法
技术领域
1.本发明属于分子诊断检测领域，特别涉及一种检测mdm2基因snp309多态性的引物，探针组合和方法。


背景技术：

2.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)，是指基因序列中基因组水平上特定核苷酸位置上的单个核苷酸变异所引起的基因序列多态性，包括单个碱基的插入、颠换、缺失、转换等，大多数情况下为单个碱基的转换，即一种嘧啶(或嘌呤)碱基转换成另一种嘧啶(或嘌呤)，是人类诸多可遗传的变异中最常见的并且研究最多的一种。单核苷酸多态性在基因组中广泛存在，大约每1000个碱基对中就有一个多态位点。基因多态性通常会导致基因活性强度的显著变化，从而造成不同个体差异。多方的研究结论指出：不同的单核苷酸多态性与疾病的易感性之间有一定的关联，因此snps也被经常用作研究疾病的重要分子标志物。
3.p53是一种肿瘤抑制基因，它介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，但其在恶性肿瘤中经常发生突变，这突出了其在肿瘤发生和发展中的重要性。而mdm2基因是p53的一个重要负调控因子，可与p53相互作用形成负反馈环，参与细胞调控。人类mdm2基因定位于第12号染色体(12q13.14)，具有多种mrna剪接形式，广泛存在于人体正常的组织器官中，是近年来发现的一种与恶性肿瘤密切相关的癌基因。关于mdm2基因snp309多态性的研究国内外非常多，此位点可自发性地从胸腺嘧啶(t)向鸟嘌呤(g)的转换，与野生型snp309t/t相比，g/g基因型可明显提高mdm2与转录激活因子spl的亲合力，增加mdm2 mrna和蛋白的表达水平，从而抑制p53的作用，导致肿瘤发病率增加，病程加快。
4.结直肠癌(colorectal cancer，crc)是全世界最常见的癌症之一，其发病率和死亡率都非常高，但目前的研究还未明确其具体致病机制，可能与遗传基因、生活环境以及饮食习惯等多种因素相关。因此几年来国内外学者就结直肠癌病因研究非常广泛，随着研究的深入，利用分子甚至基因水平技术逐渐证实遗传因素与结直肠癌有着密切联系，可能影响着结直肠癌的整个发生、发展过程。已证明mdm2基因snp309位点不仅与结直肠癌的发生发展相关，与胃癌、食管癌、肝癌等其他恶性肿瘤发生也有关联性。此外，mdm2 snp309的gg或tg基因型患者有早期癌症发生的倾向。snp309检测可以辅助疾病诊断，提高诊断水平，降低疾病发生风险。本项目通过snp309基因突变的研究与分析，优化检测条件，可快速检测snp309的突变情况，提高检测效率以及节约检测成本。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种mgb探针检测mdm2基因snp309多态性的引物，探针组合，采用qpcr技术，可用于快速准确检测患者体内mdm2基因的snp309位点的多态性。所述检测mdm2基因snp309多态性引物和探针，包括：
6.扩增mdm2基因的snp309位点的引物，其碱基序列为：
binder，mgb)是一种二氢环吡咯三肽，它可以选择性地结合到dna分子的小沟，即dna螺旋中的浅沟。mgb标记的寡核苷酸与互补的dna和rna靶序列形成稳定的杂合复合物。
30.图2mgb探针qpcr检测3号样本，fam通道信号出现，表示这个样本是野生型tt。
31.图3mgb探针qpcr检测1号样本，cy5通道信号出现，表示这个样本是完全突变型gg。
32.图4mgb探针qpcr检测2号样本，fam和cy5通道都有信号出现，表示这个样本是杂合型tg。
33.图5是sanger测序验证样本，证实mgb探针qpcr检测结果的准确的测序演示图。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
35.实施例1抽提石蜡组织中的基因组dna
36.1)抽提石蜡组织dna：取石蜡切片(5-10μm厚，1
×
1cm2大小)5-8张，将石蜡包埋组织收集到1.5ml离心管内，短暂离心；
37.2)加入1ml组织透明液，充分振荡，13200rpm离心1min，移除上清液；加入0.5ml组织透明液，充分振荡，13200rpm离心1min，移除上清液；
38.3)加入1ml乙醇(96-100％)，剧烈振荡，13200rpm室温离心2min，移除上清液；打开盖子，室温(15-25℃)或金属浴37℃孵育直到剩余乙醇完全挥发；
39.4)取180μl buffer atl对管内组织进行吹吸重悬，然后加入20μl蛋白酶k，再次振荡；将含有混合液的离心管置于56℃的金属浴上，孵育1h，期间颠倒混匀3次，直至样品完全溶解；
40.5)将离心管转移至90℃的金属浴上，再次孵育1h；短暂离心，将管盖上的溶液甩至管底；向管内加入200μl buffer al，充分振荡混匀。然后加入200μl乙醇(96-100％)，再次振荡混匀；短暂离心，将管盖上的溶液甩至管底；
41.6)小心将混合液用移液器转移至含有qiaamp minelute column吸附柱的2ml收集管内，8000rpm离心1min，弃收集管，将吸附柱置于一个新的收集管上；
42.7)向吸附柱内加入500μl buffer aw1，务必不要打湿吸附柱管口边缘。8000rpm离心1min，弃收集管，将吸附柱置于一个新的收集管上；
43.8)向吸附柱内加入500μl buffer aw2，务必不要打湿吸附柱管口边缘。8000rpm离心1min，弃收集管，将吸附柱置于一个新的收集管上；13200rpm室温离心3min，以彻底甩掉吸附膜上残留的溶液；
44.9)将吸附柱将吸附柱置于一个干净的1.5ml离心管上(自备)，小心向膜中央滴加50μl buffer ate；13200rpm室温离心1min；
45.10)取收集到的dna溶液1.5μl用nanodrop检测所得dna的浓度和纯度；将剩余的dna溶液于-20℃保存。
46.实施例2qpcr检测样本中mdm2基因snp309多态性
47.随机取临床样本10例，用qpcr方法检测mdm2基因snp309多态性。
48.(1)qpcr试剂配置：单个反应的试剂配置如下：
[0049][0050][0051]
10例样本、阴性对照和空白对照，共配置13份试剂。
[0052]
(2)加样：qpcr反应液中加入2μl cdna；阴性对照直接加2μl阴性对照品；空白对照加2μl depc水；
[0053]
(3)检测：使用实时荧光定量pcr仪检测，可用仪器包括abi7500,abi7300等。反应条件：95℃预变性30s；95℃5s，60℃35s 40个循环，荧光信号于60℃35s时采集。
[0054]
结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，阴性对照和空白对照应该都是没有信号的，如果阴性对照和空白对照有信号，说明有可能样本被污染，需要重新检测。如果fam有信号，并且ct《38,可确定snp309是野生型“t”碱基；如果cy5有信号，并且ct《38,可确定snp309是突变型“g”碱基；如果fam和cy5都有信号，并且ct《38,可确定snp309是杂合型“t/g”碱基。具体结果见下表和图2，图3，图4。
[0055]
样本编号qpcr检测结果1snp309t》g2snp309t》tg3snp309t》t4snp309t》tg5snp309t》g6snp309t》t7snp309t》tg8snp309t》tg9snp309t》tg10snp309t》tg
[0056]
实施例3 sanger测序验证qpcr检测
[0057]
(1)设计扩增引物snp309 s-f,snp309 s-r
[0058]
(2)试剂配置：pcr扩增体系试剂配制如下总体积20ul,对于一个样本而言，直接按以下试剂配置：
[0059]
[0060][0061]
(3)加样：每个反应加1ul提取的dna溶液。
[0062]
(4)扩增条件如下：
[0063][0064]
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，35min，凝胶成像系统观察。
[0065]
(6)sanger测序：
[0066]
取9μl pcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
[0067][0068]
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
[0069][0070]
测序反应程序：
[0071]
[0072][0073]
(7)沉淀环节：向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl cbl后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(abi3730)测序。
[0074]
(8)结果判断：分别将测序结果与mdm2(ng_016708)标准序列进行比对，根据分析结果进行报告。具体结果见下表：
[0075]
样本编号测序分析突变类型1snp309t》g2snp309t》tg3snp309t》t4snp309t》tg5snp309t》g6snp309t》t7snp309t》tg8snp309t》tg9snp309t》tg10snp309t》tg
[0076]
通过测序验证了mgb探针进行qpcr检测mdm2基因的snp309多态性符合率能达到100％。

技术特征：
1.检测mdm2基因snp309多态性的引物和mgb探针，其特征在于，所述引物和探针包括：snp309-f：taaaggtcacgggggccsnp309-r：agactacgcgcagcgttcasnp309-p1：fam-tgcggggccgcttcggsnp309-p2：cy5-tgcggggccgctgcgg。2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针的5'端标记荧光基团，3'端标记不发荧光的淬灭基团nfq，末端还连接一个小沟结合物mgb。3.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述上游,下游引物和探针使用浓度都是10μm。4.如权利要求1所述的探针，其特征在于，由于探针5'端标记了不同荧光基团，所以判定多态性可以在一管中进行。5.检测mdm2基因snp309多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抽提待测样本的基因组dna；(2)用权利要求1的引物和探针在一管中对(1)的dna检测：snp309-f：taaaggtcacgggggccsnp309-r：agactacgcgcagcgttcasnp309-p1：fam-tgcggggccgcttcggsnp309-p2：cy5-tgcggggccgctgcgg(3)根据探针的荧光信号，确定样本中的snp309的多态性。

技术总结
本发明公开了一种MGB探针检测MDM2基因SNP309多态性的引物，探针组合和方法，其包括针对SNP309位点扩增的上下游引物和针对SNP309多态性的MGB探针。本发明可快速检测样本中是否存在SNP309位点的多态性。利用本发明完成的检测结果准确且灵敏快速，通过对MDM2基因SNP309多态性的检测，可以预测肠癌的风险，为预防肠癌的发生提供参考依据。为预防肠癌的发生提供参考依据。为预防肠癌的发生提供参考依据。


技术研发人员：王淑一 蔡嘉慧
受保护的技术使用者：杭州艾迪康医学检验中心有限公司
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/20