一株原囊菌属黏细菌及其在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜清除药物中的应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株原囊菌属黏细菌及其在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜清除药物中的应用。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种常见的人畜共患条件致病菌，在宿主免疫力低下时可以导致宿主多种组织的感染以及菌血症，已成为导致感染的主要原因，也是全球最普遍的食源性致病菌之一。抗生素一直是治疗金黄色葡萄球菌感染的有效药物，但随着抗生素使用的增加，金黄色葡萄球菌耐药株逐渐流行，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,mrsa)具有耐药性更不易治愈，已成为院感的重要病原菌。金黄色葡萄球菌粘附宿主细胞并形成生物被膜是其引发疾病的重要机制之一。当细菌形成完整的生物膜后，抗生素等抗菌药物无法起到有效的杀菌作用，并且还会不断有细菌从生物膜中逸出导致长期感染，成为引起耐药性增强和持续性感染的主要因素之一。
3.目前尚无针对细菌生物膜的特效治疗药物，抗生素仍为主要治疗手段，但近年临床金黄色葡萄球菌耐药率逐年上升，研发具有新作用靶点的高效低毒抗菌药物已成为临床对抗病原菌感染的迫切需要。常见的抗生素来源菌在一定程度上出现了过度开发的情况，亟需从新型药源微生物中寻找不同类型的抑菌化合物。黏细菌是一类分布广泛的捕食类细菌，在捕食过程中通过产生多种抗菌物质、次级代谢产物、水解酶等，以多种策略杀死猎物细胞，是继放线菌之后的又一大类尚待开发的新型战略药源微生物资源。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株原囊菌属黏细菌archangium sp.cy-1。该菌株于2022年10月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号：gdmcc no：63225。
5.本发明的第二个目的是提供一种菌剂，包含上述的黏细菌archangium sp.cy-1。
6.优选的，所述的菌剂还包含能延长菌株活性时间的辅料，或其它菌剂可接受的辅料。
7.本发明的第三个目的是提供上述的黏细菌archangium sp.cy-1或菌剂在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的产品中的应用。
8.本发明的第四个目的是提供上述的黏细菌archangium sp.cy-1或其培养物、菌液、发酵液或发酵上清浓缩液在制备细菌生物膜清除药物中的应用。优选的，所述的细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
9.本发明的第五个目的是提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜清除药物，该药物含有上述的黏细菌archangium sp.cy-1或其培养物、菌液、发酵液或发酵上清浓缩液
作为活性成分。
10.优选的，所述的黏细菌archangium sp.cy-1的培养物、菌液、发酵液或发酵上清浓缩液是以vy/4液体培养基进行发酵获得，所述的vy/4液体培养基的配方为：安琪酵母0.25％，cacl2·
2h2o 0.1％，ph 7.2，溶剂为水。
11.本发明的第六个目的是提供一种清除细菌生物膜的方法，包括使上述的黏细菌archangium sp.cy-1或其培养物、菌液、发酵液或发酵上清浓缩液与细菌生物膜接触的步骤。优选的，所述的细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
12.本发明具有以下有益效果：
13.本发明采用大肠杆菌诱导法从采自养猪场的土壤中分离纯化出一株原囊菌属黏细菌archangium sp.cy-1，该菌株能够捕食耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)，其发酵上清浓缩液能清除已经形成的mrsa生物膜。上述结果表明，本发明所涉及的黏细菌archangium sp.cy-1能够在mrsa治疗方面发挥作用。
14.原囊菌属黏细菌archangium sp.cy-1于2022年10月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号：gdmcc no：63225。
附图说明
15.图1是archangium sp.cy-1的形态特征；a，菌株cy-1在vy/2固体培养基上的菌落形态；b，菌株cy-1在体视显微镜下的子实体形态；c，菌株cy-1在相差显微镜下的营养细胞形态。
16.图2是archangium sp.cy-1对mrsa的捕食。
17.图3是不同浓度archangium sp.cy-1发酵上清液对mrsa生物膜的清除作用。
具体实施方式
18.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
19.实施例1：菌株的分离、纯化与鉴定
20.从汕尾市某猪场采集土壤样品，样品运回实验室后立即于室温下自然风干。采用大肠杆菌诱导法分离黏细菌，步骤如下：在水琼脂培养基wcx(cacl2·
2h2o 0.1％和琼脂1.5％，ph 7.2，溶剂为水；配制：将各成分溶于水，搅拌混匀，调节ph，灭菌即得，待琼脂凝固后以划线的方式接种大肠杆菌菌悬液)上接种黄豆大小经放线菌酮浸泡处理的土壤样品。30℃培养5d后在体视显微镜下挑取子实体接种于vy/2培养基(安琪酵母0.5％，cacl2·
2h2o0.1％，vb
12 0.5mg/l和琼脂1.5％，ph 7.2，溶剂为水；配制：将各成分溶于水，搅拌混匀，调节ph，灭菌即得)进行纯化，通过不断转接菌落边缘菌体获得纯化的菌株cy-1。
21.菌株cy-1在vy/2固体培养基上表现为滑动扩展的深紫色菌落，整体菌落呈明显的放射状，成熟的子实体为肾形、棕色、无柄，在透射电镜下可观察到营养细胞呈长杆状(图1)。刮取菌株cy-1的新鲜菌体用ctab法提取基因组dna后用illumina hiseq平台测定基因组序列，采用spades软件对测序数据进行从头组装，构建contig和scaffold；并使用quast和checkm软件评估基因组拼装的完整性。拼接好的基因组用于计算与近源物种基因组杂交值dddh和平均核苷酸相似度ani，菌株cy-1基因组与archangium属近源近源模式物种之间
的dddh值在28.6％-30.3％，远低于物种划分的临界值(》70％)，ani值(84.91-85.93％)也低于原核生物物种划分阈值(95-96％)(表1)。因此，将该菌株鉴定为原囊菌属的一个新物种，将其命名为：archangium sp.cy-1，其于2022年10月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号：gdmcc no：63225。
22.表1菌株cy-1与同属近缘模式物种基因组之间的平均核苷酸相似度ani和杂交值dddh
[0023][0024]
实施例2：archangium sp.cy-1对mrsa的捕食
[0025]
挑取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus gdmcc 1.1263单菌落接种到5ml营养肉汤培养基(蛋白胨0.1％，牛肉膏0.03％，nacl 0.05％，ph 7.2，溶剂为水；配制：将各成分溶于水，搅拌混匀，灭菌即得)，30℃，180rpm震荡培养24h获得种子液，然后按体积分数1％的接种量接种种子液至新鲜的营养肉汤培养基中，30℃，180rpm震荡培养24h后，8000rpm离心10min收集菌体，用tpm缓冲液(kh2po
4 1mm，tris-hcl 10mm，mgso4·
7h2o 8mm，ph 7.6，溶剂为水)清洗三次并重悬菌体至细胞浓度为1.0
×
10
11
cells/ml，吸取150μl菌悬液接种至tpm固体培养基(kh2po
4 1mm，tris-hcl 10mm，mgso4·
7h2o8mm，琼脂15g/l，ph 7.6，溶剂为水；配制：将各成分溶于水，调节ph，搅拌混匀，灭菌即得)中央，形成直径约2cm的菌斑，晾干备用。用200μl吸头钻取新鲜培养的cy-1并接种至mrsa菌斑中心，置于30℃恒温培养箱培养，同时设置只接种mrsa的tpm平板为阴性对照，实验设置3个重复，2d后开始观察捕食情况。
[0026]
如图2所示，菌株cy-1能够捕食mrsa菌斑，并利用裂解产生的营养物质生长，5d后观察到mrsa菌斑被完全裂解。
[0027]
实施例3：archangium sp.cy-1发酵上清液对mrsa生物膜的清除
[0028]
挑取菌株cy-1于vy/4液体培养基(安琪酵母0.25％，cacl2·
2h2o 0.1％，ph 7.2，溶剂为水；配制：将各成分溶于水，搅拌混匀，调节ph，灭菌即得)中，置于摇床180rpm、30℃震荡培养5d，8000rpm、4℃离心10min，收集发酵上清液。上清液用0.22μm孔径滤器抽滤处理后再用3kda分子截留量超滤管浓缩100倍，并用pbs缓冲液置换，将获得的浓缩上清液分装于2ml无菌离心管，置于-80℃冰箱保存备用。
[0029]
用实施案例2中相同的方法获得mrsa细胞悬液，调整细胞浓度约1.0
×
107cells/ml，然后接种200μl菌悬液至96孔板中，37℃静置培养48h形成成熟的生物膜，弃上清并用pbs缓冲液洗涤3次去除未黏附的细菌，室温下晾干后加入200μl发酵上清浓缩液以及稀释2、5、10、20、40倍的发酵上清浓缩液，并以pbs缓冲液和100℃热处理后的发酵上清浓缩液作为对照，所有条件均设置3个重复。37℃静置培养2h后弃上清并用pbs缓冲液洗涤3次，室温下晾干后，再用0.5％的结晶紫染液在室温下染色20min来确定剩余的总生物膜量，用无菌水轻柔洗去结晶紫染液，随后用30％的乙酸充分溶解附在孔板底部的生物膜，并测定550nm
处的吸光值。结果如图3所示，加入cy-1发酵上清液的孔的mrsa生物膜显著被清除，并且随着发酵上清液浓度的稀释，生物膜的清除效果也随之减弱，说明cy-1发酵上清液中发挥作用的物质存在剂量效应；热处理的上清液失去清除mrsa生物膜的能力，表明发酵液及浓缩液中的热敏感蛋白可能是清除mrsa生物膜的功能物质。
[0030]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株原囊菌属黏细菌archangium sp.cy-1，其保藏编号为：gdmcc no：63225。2.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的黏细菌archangium sp.cy-1。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述的菌剂还包含能延长菌株活性时间的辅料，或其它菌剂可接受的辅料。4.权利要求1所述的黏细菌archangium sp.cy-1或权利要求2所述的菌剂在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的产品中的应用。5.权利要求1所述的黏细菌archangium sp.cy-1或其培养物、菌液、发酵液或发酵上清浓缩液在制备细菌生物膜清除药物中的应用。6.根据根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。7.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜清除药物，其特征在于，含有权利要求1所述的黏细菌archangium sp.cy-1或其培养物、菌液、发酵液或发酵上清浓缩液作为活性成分。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述的黏细菌archangium sp.cy-1的培养物、菌液、发酵液或发酵上清浓缩液是以vy/4液体培养基进行发酵获得，所述的vy/4液体培养基的配方为：安琪酵母0.25％，cacl2·
2h2o 0.1％，ph 7.2，溶剂为水。9.一种清除细菌生物膜的方法，其特征在于，包括使权利要求1所述的黏细菌archangium sp.cy-1或其培养物、菌液、发酵液或发酵上清浓缩液与细菌生物膜接触的步骤。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

技术总结
本发明公开了一株原囊菌属黏细菌及其在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜清除药物中的应用。该菌株命名为Archangium sp.CY-1，其保藏编号为：GDMCC No：63225。本发明采用大肠杆菌诱导法从养猪场土壤中分离纯化出一株原囊菌属黏细菌Archangium sp.CY-1，该菌株能够捕食耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，并且其发酵液及发酵上清浓缩液能够清除MRSA生物膜。上述结果表明，本发明所涉及的Archangium sp.CY-1及其发酵液在制备清除MRSA生物膜药物方面具有巨大的应用潜力。MRSA生物膜药物方面具有巨大的应用潜力。MRSA生物膜药物方面具有巨大的应用潜力。


技术研发人员：周杨 朱红惠 姚青
受保护的技术使用者：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/20