一种Myf5-Cre构建脂肪组织特异性STAU1敲除小鼠模型的方法

一种myf5-cre构建脂肪组织特异性stau1敲除小鼠模型的方法
技术领域
1.本发明属于动物实验模型的构建技术领域，尤其涉及一种myf5-cre构建脂肪组织特异性stau1敲除小鼠模型的方法。


背景技术：

2.肥胖已成为一种全球性慢性代谢性疾病，可导致2型糖尿病、心脑血管疾病、脂肪肝、严重危害着人类健康。一般认为哺乳动物体内的脂肪组织主要包括具有能量储存功能的白色脂肪组织(white adipose tissue，wat)和产热耗能的棕色脂肪组织(brown adipose tissue，bat)。近年来研究发现，当机体暴露于寒冷或药物等刺激时，wat中出现一些多房性解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，ucp1)阳性脂肪细胞，其功能与棕色脂肪细胞相似。这种具有白色和棕色脂肪细胞中间形态的脂肪细胞称为米色脂肪细胞。这种米色脂肪细胞可以通过复杂的过程在wat贮库中被诱导，并且在刺激时表现出与bat相似的产热。有研究表明，哺乳动物的脂肪细胞主要来源于神经峭或中胚层的前体，其中神经峭可以直接分化为成熟的脂肪细胞，而来自中胚层的前体可分化成具有特定分化能力的不同类型的前体细胞，从而分化成不同类型的脂肪细胞或肌肉细胞。棕色脂肪细胞由轴旁中胚层发育而来，其中表达myf5的中胚层祖细胞可分化为肌肉或棕色脂肪前体细胞。棕色脂肪前体细胞在受到ehmt1、prdm16、c/ebps、ews等因素的调控后，可逐渐分化为棕色脂肪细胞。然而，人们对米色脂肪细胞的发育起源知之甚少，既往研究报道，经典棕色脂肪和骨骼肌细胞来源于myf5肌源性前体细胞谱系，白色和米色脂肪细胞来源于myf5前体细胞，了解棕色和米色脂肪在发育谱系上的不同，能为治疗肥胖以及代谢性疾病提供更多指导。
3.脂肪细胞分化异常是肥胖的病理生理学基础，在此过程中涉及许多转录因子，rna结合蛋白在转录后水平也调控脂肪细胞的分化，其中stau1参与脂肪组织及糖脂代谢的调解。前期研究结果发现stau1可能能够通过影响ucp1及prdm16产热基因的表达，从而抑制脂肪组织的产热，具体机制尚不明确。本发明在stau1/adipo小鼠小鼠中观察到stau1缺失可能会促进小鼠产热，但由于bat中adipoq表达量较低，且敲除效率有限，目前，用于科学研究的基因敲除型肥胖动物模型非常有限，且市场没有具有稳定遗传性的基因敲除型肥胖模型小鼠，都是需要后天培养改造的，建模时间较长，造模成功率低，死亡率高。因此，需要一种myf5-cre构建脂肪组织特异性stau1敲除小鼠模型的方法。


技术实现要素：

4.本发明提供一种通过生存状况、体貌体征及运动状态观察，流式细胞术和wester blot、pcr等方法评估模型建立状况，筛选最优的建模方案的myf5-cre构建脂肪组织特异性stau1敲除小鼠模型的方法。
5.本发明包括以下步骤：
6.1)sgrna靶点设计：根据如seq id no：1所示的stau1基因序列的第3-6号外显子设
计四个sgrna靶点，第一sgrna靶点序列如seq id no：2所示，第二sgrna靶点序列如seq id no：3所示；第三sgrna靶点序列如seq id no：4所示，第四sgrna靶点序列如seq id no：5所示；
7.2)构建crisper/cas9重组质粒：利用引物如seq id no：6进行pcr扩增，获得crisper/cas9重组质粒；
8.3)将所述crisper/cas9重组质粒质粒dna扩增后，酶切线性化，经体外转录后，显微注射到小鼠的精卵中，注射后的受精卵胚胎移植到假孕母鼠体内，获得f0小鼠；
9.4)所述f0代小鼠与异性野生型小鼠交配，后代基因型鉴定获得f1代杂合型基因敲除小鼠；
10.5)通过对所述f1代杂合型基因敲除小鼠雌雄近交，采用引物seq id no：7通过pcr筛选基因型鉴定获得f2代纯合型基因敲除小鼠，即为stau1/myf5小鼠模型。
11.进一步地，所述pcr扩增体系为
[0012][0013]
其中，pcr反应程序为94℃、3min，94℃、30s，60℃、35s，72℃、35s，72℃、5min，共38个循环。
[0014]
进一步地，所述对4～6周龄的c57/bl6雌性小鼠注射10iu孕马血清促性腺激素，48h后注射10iu人绒毛促性腺素，与c57/bl6雄性小鼠合笼交配，收集有阴道栓的小鼠；对4周龄以上的具有生殖功能的雄性小鼠与母鼠合笼制备受体母鼠
[0015]
进一步地，在注射后存活的受精卵转至m16培养液中，放置于37℃、5％co2、5％o2、饱和湿度培养箱内30～60min后移植。
[0016]
进一步地，选择阴道栓的c57/bl6雌性小鼠的卵巢显微注射后培养存活的受精卵。
[0017]
一种基因缺陷导致的小鼠肥胖模型，为敲除脂肪组织特异性stau1的小鼠，选择了myf5启动子，拟构建stau1/myf5作为小鼠建模模型。
[0018]
本发明的意义：
[0019]
本发明选择myf5启动子，根据小鼠stau1基因部分3-6号外显子序列，基于crispr/cas9系统设计靶向sgrna，并通过多次杂交繁育构建stau1/myf5敲除动物模型，来探究棕色脂肪细胞中敲除stau1后小鼠产热功能的变化。设置建模条件，通过小鼠生存状况、体表体征及代谢水平等方法评估模型，筛选最优的stau1/myf5敲除动物模型方案，为进一步研究代谢性疾病及肥胖基因治疗提供可靠简便的动物模型。
附图说明
[0020]
图1为本发明实施例中stau1特异型敲除鼠基因小鼠基因鉴定示意图；
[0021]
图2为本发明中stau1特异型敲除小鼠正常交配繁殖后的基因检测结果图；
[0022]
图3为dnamarker说明书。
[0023]
图4体重增长曲线显示，高脂饮食喂养6周后stau1/myf5小鼠体重即明显高于对照小鼠，而高脂喂养到17周时，stau1/myf5小鼠平均体重比对照小鼠体重重轻了约4克，差异有统计学意义。
具体实施方式
[0024]
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0025]
实施例1crisper-cas9重组质粒的构建
[0026]
sgrna靶点设计
[0027]
1)sgrna靶点设计：根据如seq id no：1所示的stau1基因序列的第3-6号外显子设计四个sgrna靶点，第一sgrna靶点序列如seq id no：2所示，第二sgrna靶点序列如seq id no：3所示；第三sgrna靶点序列如seq id no：4所示，第四sgrna靶点序列如seq id no：5所示；
[0028]
2)构建crisper/cas9重组质粒：利用引物如seq id no：6进行pcr扩增，获得crisper/cas9重组质粒；
[0029]
3)将所述crisper/cas9重组质粒质粒dna扩增后，酶切线性化，经体外转录后，显微注射到小鼠的精卵中，注射后的受精卵胚胎移植到假孕母鼠体内，获得f0小鼠；
[0030]
4)所述f0代小鼠与异性野生型小鼠交配，后代基因型鉴定获得f1代杂合型基因敲除小鼠；
[0031]
5)通过对所述f1代杂合型基因敲除小鼠雌雄近交，采用引物seq id no：7通过pcr筛选基因型鉴定获得f2代纯合型基因敲除小鼠，即为stau1/myf5小鼠模型。
[0032]
用于stau1/myf5基因敲除的crispr—cas9系统，crispr—cas9系统中sgrna作用位点位于stau1基因的第3-6号外显子上，sgrna作用位点的dna序列为：
[0033]
exon3:5'—atacttttacccatttccagtcccacctttactctaccaagttga gctctccgtgggcggacagcagtttaatgggaaaggaaagatgagaccac ccgtgaaacacgatgcccctgcccgtgcgctgaggactctgcagagtgaa cccctgccagaaaggttggag—3'
[0034]
exon4:5'—gtaaatggaagagaagcagaggaagaaaacctcaataaatcgg aaataagccaagtgtttgaaattgcgctgaagcggaatttgcctgtgaatt ttgag—3'
[0035]
exon5:5'—gtggcccgggagagtggcccaccacacatgaagaactttgtga ccagggtttcagttggggaatttgtaggggaaggagaagggaaaagcaagaagatctccaagaagaatgcggccagggctgttctggagcagcttaggaggctgccacccctccctgctgtggagcgagtgaagcccagaatcaagaagaaaagtcagcccacctgcaag—3'
[0036]
exon6:5'—ctacagacagccccggattatggccaagggatgaatcctatt agtagacttgcacagatccagcaggcaaaaaaggagaaggagccagagt acatgctccttacagaacgaggtcttccacgtcgcagggagtttgtgatgc ag—3'
[0037]
在本实施例子中，所述pcr扩增体系为
[0038][0039]
其中，pcr反应程序为94℃、3min，94℃、30s，60℃、35s，72℃、35s，72℃、5min，共38个循环。
[0040]
所述pcr特定引物为seq id no：6
[0041]
primers for myf5-cre-wt pcr:
[0042]
myf5-cre-p3:5'-aaccagagactccccaaggt-3’[0043]
myf5-cre-p2:5'-cggctcttaaagcaatggtc-3'
[0044]
显微注射用基因片段的准备
[0045]
将质粒dna扩增后，酶切线性化，用凝胶回收法纯化后融于无菌的te(5mmolltris，0.1mmolledta，ph 7.4)缓冲液中，溶解稀释定量至5ng/ul，置于-20℃保存等待注射。
[0046]
供体鼠、结扎公鼠、受体鼠的制备
[0047]
动物饲养室的光照时间调节为5:0019:00，19:00至次日5:00为夜晚。
[0048]
对4～6周龄的c57/bl6雌性小鼠注射10iupmsg，48h后注射10iu h cg，与c57/bl6雄性小鼠合笼交配，收集有阴道栓的小鼠；对4周龄以上的具有生殖功能的km雄性小鼠进行麻醉，通过外科手术将其输精管剪断，缝合后，静养4周，与母鼠合笼制备受体母鼠；选4周龄以上的km雌性小鼠与结扎公鼠合笼，次日收集见栓的雌性小鼠，进行胚胎移植。
[0049]
受精卵的收集及处理
[0050]
对有阴道栓的c57/bl6雌性小鼠人道处死，剖腹，取卵巢及部分子宫角。取出的组织用m2清洗，放置在新的m2溶液中，在体式显微镜下，用利器划开输卵管，使受精卵从输卵管中流出。用移液器将带颗粒细胞的受精卵转至1mg/ml透明质酸酶中消化去除颗粒细胞。在m2操作液中清洗若干次后，挑选有2个原核、形态良好的受精卵，转至m16培养液放于37℃、5％co2、5％o2、饱和湿度培养箱中待用。
[0051]
显微注射
[0052]
取20～30枚受精卵于注射盘内，对较大原核(雄原核)进行注射，见到原核体积明显增大原来1/3才算成功注射。若受精卵原核无明显增大，说明外源dna注射液未注入原核中，此类注射为无效注射。注射完毕，将注射后存活的受精卵转至m16培养液中，放置于37℃、5％co2、5％o2、饱和湿度培养箱内30～60min后移植。
[0053]
胚胎移植
[0054]
取同日见栓的受体鼠，麻醉后通过外科手术在腹部侧位取出卵巢，用镊子撕破卵
巢浆膜，找到输卵管壶腹部，吸有25枚左右注射后胚胎的移植针插入其中，将胚胎移植入输卵管内，后将卵巢、输卵管送回受体鼠体内，缝合。
[0055]
bat敲除stau1基因小鼠的获得及基因型鉴定
[0056]
将经显微注射后培养存活的受精卵通过输卵管伞端移植入假孕雌鼠体内，19～21d后小鼠出生剪尾提取dna，pcr及测序进行基因型鉴定筛选，获得f0代小鼠；f0代小鼠与异性野生型小鼠交配，后代基因型鉴定获得f1代杂合型基因敲除小鼠；f1代杂合小鼠雌雄近交，后代基因型鉴定获得f2代纯合型基因敲除小鼠。引物seq id no：7所示，
[0057]5’‑
catttccaaaagacgtcaccctta-3’；
[0058]5’‑
agtagctgacacatgctatgtacg-3’。
[0059]
因此本发明选择了myf5启动子，拟构建stau1/myf5作为主要动物模型来探索stau1在棕色脂肪细胞分化及成熟的过程中的作用功能，探究stau1抑制bat的产热机制，所述棕色脂肪细胞起源于原肠中胚层间充质干细胞，在转录因子myf5的驱动下，逐渐分化成为成熟的棕色脂肪细胞，因此可以在棕色脂肪组织中特意启动cre酶的表达，从而敲除stau1。本发明采用转基因小鼠技术将构建的广泛表达启动子-lox-stop-lox-转基因载体通过显微注射制备组织特异性转基因小鼠模型，转基因在正常情况下并不表达，只有与相应的组织特异性表达cre/creert2小鼠杂交后，因stop终止序列在特定的组织中被去除，从而达到转基因在诱导性/特定组织中特异性表达的目的。
[0060]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种myf5-cre构建脂肪组织特异性stau1敲除小鼠模型的方法，其特征在于包括以下步骤：1)sgrna靶点设计：根据如seq id no：1所示的stau1基因序列的第3-6号外显子设计四个sgrna靶点，第一sgrna靶点序列如seq id no：2所示，第二sgrna靶点序列如seq id no：3所示；第三sgrna靶点序列如seq id no：4所示，第四sgrna靶点序列如seq id no：5所示；2)构建crisper/cas9重组质粒：利用引物如seq id no：6进行pcr扩增，获得crisper/cas9重组质粒；3)将所述crisper/cas9重组质粒质粒dna扩增后，酶切线性化，经体外转录后，显微注射到小鼠的精卵中，注射后的受精卵胚胎移植到假孕母鼠体内，获得f0小鼠；4)所述f0代小鼠与异性野生型小鼠交配，后代基因型鉴定获得f1代杂合型基因敲除小鼠；5)通过对所述f1代杂合型基因敲除小鼠雌雄近交，采用引物seq id no：7通过pcr筛选基因型鉴定获得f2代纯合型基因敲除小鼠，即为stau1/myf5小鼠模型。2.根据权利要求1所述的一种stau1/myf5敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述pcr扩增体系为pcr扩增体系为其中，pcr反应程序为94℃、3min，94℃、30s，60℃、35s，72℃、35s，72℃、5min，共38个循环。3.根据权利要求1所述的肥胖小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述受体母鼠的制备方法包括：所述对4～6周龄的c57/bl6雌性小鼠注射10iu孕马血清促性腺激素，48h后注射10iu人绒毛促性腺素，与c57/bl6雄性小鼠合笼交配，收集有阴道栓的小鼠；对4周龄以上的具有生殖功能的雄性小鼠与母鼠合笼制备受体母鼠。4.根据权利要求1所述的肥胖小鼠模型的建立方法，其特征在于，在步骤b中注射后存活的受精卵转至m16培养液中，放置于37℃、5％co2、5％o2、饱和湿度培养箱内30～60min后移植。5.根据权利要求1所述的肥胖小鼠模型的建立方法，其特征在于，选择阴道栓的c57/bl6雌性小鼠的卵巢显微注射后培养存活的受精卵。6.一种基因缺陷导致的小鼠肥胖模型，其特征在于，为敲除脂肪组织特异性stau1的小鼠，选择了myf5启动子，拟构建stau1/myf5作为小鼠建模模型。

技术总结
本发明公开了一种Myf5-Cre构建脂肪组织特异性STAU1敲除小鼠模型的方法，根据小鼠STAU1基因部分3-6号外显子序列，基于CRISPR/Cas9系统设计靶向sgRNA，sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，显微注射到小鼠的精卵中，注射后的受精卵胚胎移植到假孕母鼠体内，获得F0小鼠；提取F0代小鼠尾血DNA,经PCR扩增产物测序，鉴定基因型，获得阳性F0代小鼠；将F0小鼠分别与野生型小鼠交配，获得杂合子小鼠Fl代，再进行鼠尾鉴定；将Fl代小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠即STAU1/myf5敲除小鼠模型。本发明拟构建STAU1/myf5敲除动物模型来探索STAU1在棕色脂肪细胞分化过程中的作用，通过小鼠的体重、葡萄糖耐量及胰岛素释放等方法探究STAU1抑制BAT的产热机制。BAT的产热机制。BAT的产热机制。


技术研发人员：梁小弟 孟轩羽 关亚群 胡博文
受保护的技术使用者：新疆医科大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/20