一种制备表雄酮的方法与流程

1.本发明涉及生物领域，更具体地，涉及制备表雄酮的方法。


背景技术：

2.表雄酮(epiandrosterone)结构式如下所示，是人体分泌的甾体化合物，同时，也是合成甾体激素药物的前体。
[0003][0004]
目前已经公开的制备表雄酮的方法中，均为化学法。例如，有报道，4-雄烯二酮经醚化保护反应、钯炭催化加氢还原反应、酸催化水解脱保护反应三步反应合成表雄酮，这种方法存在反应路线长，收率低且环境问题严重等问题。此外，并未有生物法制备表雄酮的报道。
[0005]
在4-ad生成5α-ad中间体的生物转化的发酵法(如下反应式所示)的报道中，存在产率低，产物不纯，存在分离提取等问题，同样存在实用性问题。因此，期待进一步的改进。
[0006]


技术实现要素：

[0007]
本技术提供了一种简单易行的合成表雄酮的生物方法。该方法操作简单，条件温和，对环境友好，并且能够大幅度降低生产的成本，适合大规模工业化生产。
[0008]
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009]
步骤1)，用分枝杆菌细胞膜固定化5α-还原酶，用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α-还原酶的过表达载体，电转化至分枝杆菌中，在30℃下表达，并收集带有5α-还原酶的细胞或膜碎片。
[0010]
往步骤1)中加入4-雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80等，在温度30℃下反应30-60h，控制整个反应过程的ph值在6.5～8.5，tlc检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中固定化细胞或膜碎片和底物投料质量比为2～0.5：1。
[0011]
优选地，所述的5α-还原酶的基因序列经分枝杆菌密码子优化的序列。
[0012]
优选地，所述的5α-还原酶的基因序列与序列11-21中的任一序列具有至少80％以上的同源性。
[0013]
优选地，所述的5α-还原酶的n端接入信号肽。
[0014]
优选地，所述的信号肽基因为微生物自身所特有的。
[0015]
进一步优选地，所述的带有信号肽的5α-还原酶是在非致病微生物中的表达产物。
[0016]
更进一步优选地，所述的非致病微生物为分枝杆菌。
[0017]
优选地，步骤1)中所述的固定化为5α-还原酶需处于脂膜环境。
[0018]
优选地，步骤1)中所述的脂膜选择细胞膜。
[0019]
优选地，分枝杆菌包括分枝杆菌3805、分枝杆菌3863、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌等。
[0020]
更优选地，所述分枝杆菌为新金分支杆菌。
[0021]
更优选地，所述分枝杆菌具体为新金分枝杆菌b-3805，本发明将其命名为abi10菌种。
[0022]
进一步优选地，所述新金分枝杆菌b-3805，可从leibniz institute dsmz-german collection of microorganisms and cell cultures gmbh购买，货号为：dsm 2967，b-3805为快速生长、非致病性微生物。
[0023]
优选地，步骤2)中所述的水相缓冲液为ph为7.5的0.01m磷酸盐缓冲液，该缓冲液由8g/l nacl，0.27g/l kh2po4，0.2g/l kcl，1.14g/l na2hpo4组成。
[0024]
优选地，步骤2)中所述的吐温80的浓度为0.01-1％。
[0025]
更优选地，步骤2)中所述的吐温80的浓度为0.05％。
[0026]
优选地，步骤2)中所述的羟丙基-β-环糊精与4-ad的质量比为0.1：1。
[0027]
优选地，所述的4-雄烯二酮底物浓度为50-100g/l。
[0028]
更优选地，固定化5α-还原酶与4-ad投料质量比为2-0.5：1。
[0029]
优选地，具体实施过程如下：
[0030]
步骤1)，用分枝杆菌细胞膜固定化5α-还原酶，用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α-还原酶的过表达载体，电转化至分枝杆菌中，在30℃下表达，并收集带有5α-还原酶的细胞或膜碎片。
[0031]
往步骤1)中加入4-雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80等，在温度30℃下反应30-60h，控制整个反应过程的ph值在6.5～8.5，tlc检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中固定化细胞或膜碎片和底物投料质量比为2～0.5：1。
[0032]
在一个实施方式中，所述信号肽具有seq id no.2所示的氨基酸序列或者与序列seq id no.3-10中的任一序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列。
[0033]
优选地，所述脂蛋白lpqh的信号肽基因来源于放线菌和假单胞菌，优选地，所述放线菌包括红球菌、诺卡氏菌、分枝杆菌、链霉菌和节杆菌。更佳地，所述脂蛋白lpqh的信号肽基因来源于分枝杆菌。
[0034]
本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明的一种制备表雄酮的方法，与现有路线相比，通过一步生物法，采用更温和的反应条件，使得本发明的制备方法实现了产物收率高、纯度高的目的，同时解决了辅酶再生的技术难题，具有较高的实用价值。
附图说明
[0035]
图1为基因工程菌abi10
p261-lpqh-5α-re
重组菌pcr验证图，m：dl2000dna marker；1-10：不同菌落pcr扩增条带，其中3和8号显示正确条带。
[0036]
图2为纯化产物的异核单量子相干谱(hsqc)图。
[0037]
图3为纯化产物的二维noe谱(noesy)图。
具体实施方式
[0038]
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0039]
实施例一、1.1带有信号肽的5α-还原酶基因过表达载体的构建
[0040]
首先，结合ncbi序列查找及比对分析，发现分枝杆菌中细胞膜表面有许多带信号肽的脂蛋白，这里选择分支杆菌脂蛋白lpqh的信号肽基因(即seq id no.1)作为5α-还原酶n端连接的信号肽。
[0041]
将来自treponema.sp的5α-还原酶氨基酸序列进行人工合成pcr组装，合成分枝杆菌密码子偏好性的5α-还原酶基因，所述的5α-还原酶基因对应的氨基酸序列为seq id no:11，与seq id no:12-seq id no:20中的任一序列具有至少90％以上的同源性。
[0042]
应用引物lpqh-f和lpqh-r扩增来自mycobacterium sp.abi10基因组中的lpqh基因，分别用munⅰ和ecor1,ecor1和hindⅲ对lpqh基因和5α-还原酶基因进行双酶切，此外，用ndeⅰ和hindⅲ对质粒pmv261进行双酶切，酶切纯化获得单片段进行连接，获得重组表达质粒p261-lpqh-m5α-re。
[0043]
pcr体系：
[0044][0045][0046]
pcr程序：95℃5min；95℃30s变性，56℃30s退火，72℃15s延伸，35个循环；72℃10min。其中所用引物序列为：
[0047]
lpqh-f:catgcaattggtgaagcgtgggttcgta
[0048]
lpqh-r:ccggaattcaccggattcggctgccgc
[0049]
将连接产物转化到dh5α感受态细胞中，涂kan抗性lb平板，37℃过夜培养。挑单菌落培养后提质粒进行酶切验证后，再测序进一步确证是否构建成功。
[0050]
1.2分枝杆菌基因工程菌的构建
[0051]
通过电转化将构建好的重组表达质粒p261-lpqh-m5α-re导入分枝杆菌感受态细胞中，经kan抗性筛选得到带有质粒p261-lpqh-m5α-re的重组菌株。具体步骤如下：
[0052]
吸取体积不超过5μl，总量在1μg左右的质粒加入分枝杆菌感受态细胞并混匀，放置在冰上10min；将混合好的感受态细胞转入电击杯，电压2.5kv，电阻1000ω，电容25μf，电击时间为23ms左右，电击一次；取800μllb-t液体培养基加入电击杯，吹吸均匀将所有菌液转入无菌1.5ml离心管，30℃，200rpm培养3-5h；取100-150μl全部涂布到卡那霉素抗性lb固体培养基中，30℃培养3-5d。挑取单菌落进行菌落pcr筛选(图1)，图1显示成功获得了带有质粒p261-lpqh-m5α-re的重组菌株，其中3号和8号为验证正确的重组菌株，将验证正确的阳性转化子即为基因工程菌abi10
p261-lpqh-m5α-re
。
[0053]
实施例2、基因工程菌abi10
p261-lpqh-m5α-re
转化4-ad合成表雄酮
[0054]
种子培养基：葡萄糖8g/l，酵母粉15g/l，nano35.4g/l，甘油2g/l，nh4h2po40.6g/l，ph7.5，115℃灭菌30分钟。
[0055]
发酵培养基：15g/l酵母粉、6g/l葡萄糖、2g/lmgso4·
7h2o、1.0g/lk2hpo4、2.0g/lkno3和2g/l吐温-80，ph7.5，121℃灭菌30分钟。
[0056]
发酵培养步骤：
[0057]
1、30℃下lb平板(胰蛋白胨：10g/l，酵母提取物：5g/l，氯化钠：10g/l，琼脂：15g/l)培养72小时以活化菌种；
[0058]
2、从活化平盘接种至种子培养基中，180rpm，30℃培养3天；将种子液在无菌条件下取样进行取样镜检，镜检无染菌方可接种；
[0059]
3、按10％的接种量接种至3l发酵培养基中，500rpm，30℃发酵培养，通气比为0.5vvm，发酵温度维持30℃，整个发酵过程ph在7-8之间，培养3-5天；
[0060]
4、发酵液通过离心获取分枝杆菌细胞，并用磷酸盐缓冲液重悬；
[0061]
5、往步骤4)中加入40g/l的4-雄烯二酮、0.5g/l的吐温80、4g/l的羟丙基-β-环糊精，在温度30℃下反应30-60h，控制整个反应过程的ph值在6.5～8.5，薄层色谱法(tlc)检测反应进程，当tlc检测底物点直至消失时，反应结束，将产物纯化后，经hsqc(图2)和noesy(图3)核磁检测鉴定其结构为表雄酮。
[0062]
本发明所提供的过表达lpqh-5α-还原酶基因工程菌株一方面避免了产物被开环降解，另一方面选择性地产生表雄酮，提高了生产效率(摩尔收率可达95％)和产品品质，使产物易于分离纯化，具有极高的实用价值。
[0063]
本发明公开的制备表雄酮的方法，以4-雄烯二酮为初始底物，通过生物转化法一步制备表雄酮，在生物法制备表雄酮的过程中，采用了5α-还原酶作为催化剂，并通过细胞膜固定化，并利用宿主细胞自身的3-酮基还原酶，组成双酶级联反应系统，使得所制备的产物的收率和纯度更高。同时，整个反应过程中无需额外添加辅酶等原料，可实现从4-雄烯二酮到表雄酮的一步生物转化，从而实现表雄酮的绿色高效生产，具有较高的使用价值。
[0064]
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

技术特征：
1.一种制备表雄酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α-还原酶过表达载体，转化至分枝杆菌中进行表达，并收集带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片；往带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片中加入4-雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80、羟丙基-β-环糊精，反应30-60h，控制整个反应过程的ph值在6.5～8.5，利用薄层色谱法检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片和4-雄烯二酮的质量比为2～0.5：1。2.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述分枝杆菌为kstd基因和ksh基因已失活的基因工程菌。3.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述水相缓冲液为ph为7.5～9.0的磷酸盐缓冲溶液。4.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述吐温80的浓度为0.01-0.05％。5.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述羟丙基-β-环糊精与所述4-雄烯二酮的质量比为0.05～0.2：1。6.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述信号肽序列与seq id no:3至seq id no:10中的任一序列具有至少80％的同源性。7.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述4-雄烯二酮的投料浓度为50-100g/l。8.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述分枝杆菌为分枝杆菌3805、分枝杆菌3863、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌或新金分枝杆菌。9.根据权利要求8所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述分枝杆菌为新金分枝杆菌b-3805。

技术总结
本申请提供了一种制备表雄酮的方法，包括如下步骤：用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α-还原酶过表达载体，转化至分枝杆菌中进行表达，并收集带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片；往带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片中加入4-雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80、羟丙基-β-环糊精，反应30-60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，利用薄层色谱法检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片和4-雄烯二酮的质量比为2～0.5：1。本发明的制备方法实现了产物收率高、纯度高的目的。度高的目的。度高的目的。


技术研发人员：苏正定 宋士奎 成细瑶 张海艳 周曦
受保护的技术使用者：武汉艾默佳华生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/20