一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法与流程

1.本技术涉及疫苗检测领域，更具体地说，它涉及一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法。


背景技术：

2.流行性乙型脑炎(以下简称乙脑)是由黄病毒科虫媒病毒
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乙脑病毒引起的一种侵害中枢神经系统的急性传染病。本病主要分布在亚洲远东和东南亚地区，经蚊传播，多见于夏秋季，临床上急起发病，有高热、意识障碍、惊厥、强直性痉挛和脑膜刺激征等，重型患者病后往往留有后遗症。
3.冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)是预防流行性乙脑的有效措施,系乙型脑炎病毒接种于vero细胞，经培养、收获、灭活病毒、浓缩、纯化后，加入适宜稳定剂冻干制成。由于冻干乙型脑炎灭活疫苗的成分较为复杂，不仅含有乙型病毒抗原成分，而且还含有牛血清白蛋白和其他杂质蛋白。而这些杂质蛋白可能对疫苗的稳定性、安全性及功效产生负面影响，故在产品检测中必须对牛血清白蛋白残留、vero细胞蛋白质残留进行严格的指标控制。《中国药典》(2020版)对冻干乙型脑炎灭活疫苗的蛋白残留量、vero细胞dna残留量、vero细胞蛋白质残留量就有明确的质控要求。
4.同时，冻干乙型脑炎灭活疫苗中还含有大量的保护病毒的人血白蛋白，其作为稳定剂保持药物成分和状态的稳定性。并且，冻干乙型脑炎灭活疫苗中的人血白蛋白的纯度与疫苗的有效性密切相关。然而，现有质控方法中并没有对冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白的纯度做出质控要求。
5.而且目前，对冻干乙型脑炎灭活疫苗中蛋白的检测主要是检测有害的、残留的杂质蛋白，其中牛血清白蛋白及vero细胞蛋白质残留量均采用酶联法免疫吸附法；vero细胞dna残留量采用dna探针杂交法，这些方法检测的是微量残留蛋白，不能体现人血白蛋白的蛋白纯度。因此，为了对冻干乙型脑炎灭活疫苗的人血白蛋白的蛋白纯度进行有效检测，提升冻干乙型脑炎灭活疫苗质量，特提出本技术。


技术实现要素：

6.为了对冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度进行有效检测，建立良好的质控标准，本技术提供一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法。
7.本技术提采用如下的技术方案：一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其包括：对冻干乙型脑炎灭活疫苗进行前处理，得到供试品溶液；采用hplc对供试品溶液进行色谱分析，并采用面积归一化法计算所得色谱图中人血白蛋白的单体峰和二聚体峰的峰面积占比，二者之和即为冻干乙型脑炎灭活疫苗的蛋白纯度；其中，hplc的色谱条件为：采用凝胶色谱柱，以ph为4.5～5.5的缓冲液为流动相，
进行等度洗脱，流速为0.3～0.8ml/min。
8.进一步地，上述缓冲液为醋酸缓冲液，且含有氯化钠和吐温80。
9.进一步地，上述流动相中，氯化钠的浓度为0.4-0.6m；吐温80的体积百分含量为0.1-0.4
‰
。
10.进一步地，上述hplc的色谱条件还包括：检测波长：270～290nm、进样量：8～20μl、洗脱时间为50～90min。
11.进一步地，上述凝胶色谱柱为tsk-gel系列色谱柱，柱直径为5-10mm，柱长为30-60cm，填料粒径为5-10μm。
12.进一步地，上述凝胶色谱柱为tsk gel g3000sw色谱柱。
13.进一步地，上述供试品溶液的制备方法包括：将冻干乙型脑炎灭活疫苗用水稀释后震荡溶解，于8000-12000rpm下离心8-12min，取上清液作为供试品溶液。
14.进一步地，上述还包括配制人血白蛋白对照品溶液，进样至色谱柱，采用hplc的色谱条件分析，以进行系统适用性验证。
15.优选地，在进行系统适用性验证中，当人血白蛋白对照品溶液的色谱图中人血白蛋白的单体峰与二聚体峰间的分离度》1.5，拖尾因子在0.95-1.40范围内时，判定为系统适用性满足检测需求。
16.优选地，在进行人血白蛋白对照品溶液中人血白蛋白的含量为10-30mg/ml。
17.综上所述，本技术具有以下有益效果：本技术提供的测定方法，通过对冻干乙型脑炎灭活疫苗进行前处理，得到供试品溶液，以凝胶色谱柱为分离柱，通过优化色谱参数(尤其是对流动相进行优化)，对供试品溶液进行hplc分析，最后采用面积归一化法计算得到单体峰和二聚体峰的峰面积占比，二者之和即为所述冻干乙型脑炎灭活疫苗的蛋白纯度。该方法利用分子排阻色谱分离的原理，以凝胶色谱柱为分离柱，仅以ph为4.5～5.5的缓冲液作为单一流动相进行等度洗脱，不但能够实现人血白蛋白与其它杂质蛋白的有效分离，并且还能实现人血白蛋白的单体峰和二聚体峰有效分离，分离度大、拖尾因子小。
18.通过本技术提供的这种测定方法能够有效测定冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度，对其中的人血白蛋白纯度指标进行有效评价和控制，再辅之以对其他杂质蛋白残留量的质控标准，能够更进一步的提升冻干乙型脑炎灭活疫苗的安全性和效价。
附图说明
19.图1是本技术实施例1中提供的人血白蛋白对照液的hplc色谱图；图2是本技术实施例1中提供的冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(麦芽糖赋形剂)供试品溶液的hplc色谱图；图3是本技术实施例1中提供的冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(右旋糖酐40赋形剂)供试品溶液的hplc色谱图。
具体实施方式
20.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会
理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
21.现有的对冻干乙型脑炎灭活疫苗的质控标准主要是监测冻干乙型脑炎灭活疫苗的蛋白残留量、vero细胞dna残留量、vero细胞蛋白质残留量。且目前主要用来蛋白残留量检测的方法是控制有害的残留的微量蛋白，而目前缺少对冻干乙型脑炎灭活疫苗含有的大量的人血白蛋白纯度进行有效监控，不利于冻干乙型脑炎灭活疫苗的质量提升和安全控制。
22.鉴于此，本实施方式提供一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其包括：步骤s1：对冻干乙型脑炎灭活疫苗进行前处理，得到供试品溶液；由于冻干乙型脑炎灭活疫苗在培养过程中需要以vero细胞为基质进行病毒培养，因此其成分复杂，含有大量的细胞碎片和生物大分子物质。为了进一步提高人血白蛋白的检测效率，降低干扰性，需要在进行hplc检测前，对样品进行前处理。
23.进一步地，供试品溶液的制备方法包括：将冻干乙型脑炎灭活疫苗用灭菌注射用水稀释后震荡溶解，于8000-12000rpm下离心8-12min，取上清液作为所述供试品溶液。在这种参数下离心处理，能够将待测蛋白与细胞碎片等物质有效分离。优选地，离心参数为：9000-11000rpm下离心8-12min；更为优选地，离心参数为：10000rpm下离心9-11min。
24.步骤s2：采用hplc对所述供试品溶液进行色谱分析，并采用面积归一化法计算所得色谱图中人血白蛋白的单体峰和二聚体峰的峰面积占比，二者之和即为冻干乙型脑炎灭活疫苗的蛋白纯度。
25.本技术中，面积归一化法指在不添加校正因子的前提下测定供试品中各杂质及杂质的总量限度。通过计算色谱图中每个色谱峰的峰面积及其总和，以求出待测物质(即人血白蛋白)占总峰面积的百分比。本技术中，人血白蛋白的色谱峰有两个，一个为单体峰，另一个为二聚体峰。
26.其中，所述hplc的色谱条件为：色谱柱：采用凝胶色谱柱；优选地，采用tsk-gel系列色谱柱，柱直径为5-10mm，柱长为30-60cm，填料粒径为5-10μm。更为优选地，色谱柱为tsk gel g3000sw色谱柱，填料粒径10μm，柱直径7.5mm，长60cm。采用这种凝胶色谱柱对供试品溶液，进行hplc，有助于更好的分离人血白蛋白中分子量不同的蛋白单体、二聚体及多聚体。
27.流动相：以ph为4.5～5.5的缓冲液为流动相。选用酸性的缓冲液作为流动相，有助于色谱柱硅胶的化学稳定性；优选地，该缓冲液为醋酸缓冲液，且含有氯化钠和吐温80。其中，氯化钠及吐温80有助于增加蛋白质的稳定性。更为优选地，氯化钠的浓度为0.4-0.6m，或者为0.45-0.55m；吐温80的体积百分含量为0.1-0.4
‰
，或者为0.2-0.3
‰
。
28.流速：0.3～0.8ml/min，优选为0.4～0.7ml/min，更为优选地为0.5～0.6ml/min，例如可以是0.5ml/min。
29.柱温：37-41℃，优选为38～40℃,更为优选地，柱温为39℃。
30.进样量：8～20μl，优选为10～20μl，例如可以是15μl、20μl。
31.检测波长：270～290nm，优选为277～283nm，更为优选地为280nm。
32.洗脱时间：50～90min，优选地60～90min。从检测色谱图来看，在保留时间大于50min中，并未出现其他色谱峰，因此洗脱时间设置大于50min即可满足检测要求。
33.洗脱程序：等度洗脱。本实施方式中采用等度洗脱，即可实现人血白蛋白与其它杂质蛋白的有效分离，从而实现检测目的，洗脱程序简单，无须使用梯度洗脱，对流动相的要求低，对色谱柱友好，操作方便。
34.进一步地，该方法还包括配制人血白蛋白对照品溶液，进样至所述色谱柱，采用hplc的色谱条件分析，以进行系统适用性验证。
35.通过采用人血白蛋白对照品溶液进行hplc分析，能够有效定位在相同色谱条件下，人血白蛋白的单体峰与二聚体峰的保留时间，对供试品样品中的相应的色谱峰进行归属，并且对色谱系统的适用性进行验证。
36.优选地，在进行系统适用性验证中，当人血白蛋白对照品溶液的色谱图中人血白蛋白的单体峰与二聚体峰间的分离度》1.5，拖尾因子在0.95-1.40范围内，且其他色谱峰不干扰单体峰与二聚体峰，则判定为系统适用性满足检测需求。
37.更为优选地，人血白蛋白对照品溶液中人血白蛋白的含量为10-30mg/ml，或者为15-25mg/ml，例如可以是20mg/ml。
38.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
39.实施例1本实施例提供一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其包括：一、实验材料：1.仪器或设备：高效液相色谱仪(waters alliance e2695、waters2 489uv/vis)、色谱柱(tskgel g3000sw 7.5mm
×
60cm 10μm)、xs205电子天平(mettler)、seven multi ph计(mettler)、离心机(eppendorf ag)、10ml容量瓶、100～1000μl移液器、微孔滤膜、针头滤器。
40.2.试剂试药：冰醋酸(分析纯)、三水合乙酸钠(分析纯)、氯化钠(分析纯)、吐温-80(化学纯)均为国药化试集团。
41.3.样品：人血白蛋白(20％,50ml)(批号：202207047)华兰生物工程重庆有限公司2～8℃贮存。
42.冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(麦芽糖赋形剂)(批号：sb2209002x)辽宁成大生物股份有限公司2～8℃贮存。
43.冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(右旋糖酐40赋形剂)(批号：b202205018y)辽宁成大生物股份有限公司产品，均于2～8℃贮存。
44.灭菌注射用水(批号：28220903-4)江苏迪赛诺制药有限公司，室温贮存。
45.二、检测方法：1.流动相的配制：
冰醋酸溶液(1mol/l)：量取冰醋酸57.75ml，加超纯水定容至1000ml，摇匀，室温保存。
46.乙酸钠溶液(1mol/l)：称取三水合乙酸钠136.1g，加超纯水溶解定容至1000ml，室温保存。
47.氯化钠溶液(5mol/l)：称取氯化钠292.2g，加超纯水溶解定容至1000ml，室温保存。
48.吐温80溶液(10vol％)：量取吐温80溶液5ml，加超纯水45ml，摇匀，室温保存。
49.流动相：精密吸取1mol/l冰醋酸缓冲液2.525ml、1mol/l乙酸钠溶液17.475ml、5mol/l氯化钠溶液100ml、10％吐温80溶液2ml，加水至980ml，调节ph至5.0，定容至1000ml，用0.45μm微孔滤膜进行过滤脱气处理后，待用。
50.2.对照品溶液的制备：精密量取20％人血白蛋白1ml至10ml容量瓶中，加水定容后混匀，制成每1ml含蛋白质20mg的人血白蛋白对照品溶液。
51.3.供试品溶液的制备：以含有麦芽糖赋形剂为赋形剂冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)作为检测对象。
52.取冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(麦芽糖赋形剂)加0.5ml灭菌注射用水稀释后振荡器上充分溶解，用台式离心机10000rpm离心10分钟，取上清样品置于进样瓶中制成冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(麦芽糖赋形剂)供试品溶液。
53.4.色谱条件：色谱柱：tsk gel g3000sw色谱柱，粒度10μm，柱直径7.5mm，长60cm；检测波长：280nm；流速：0.5ml/min进样量：20μl；柱温：38℃；洗脱时间：90分钟；洗脱方式：等度洗脱。
54.5.系统适用性试验：取人血白蛋白对照品溶液20μl，注入色谱柱，记录色谱图，如图1所示，其中保留时间为34.533min的色谱峰为人血白蛋白的单体峰，保留时间为29.883min的色谱峰为人血白蛋白的二聚体峰，保留时间为19.898min的色谱峰为人血白蛋白的多聚体峰。其中，人血白蛋白的多聚体作为杂质是有质控要求的，《中国药典》对其含量的要求是：不大于5.0％。因此在本技术中人血白蛋白纯度以人血白蛋白的单体峰和二聚体峰来计算。
55.同时，以流动相作为空白溶液，进样20μl，进行空白对照。系统适用性试验检测结果如表1所示。
56.表1.系统适用性试验检验结果
即，采用前述色谱条件及系统进行人血白蛋白对照品溶液的检测色谱图中，人血白蛋白对照品单体峰与二聚体峰间的分离度为3.0，大于1.5；拖尾因子按人血白蛋白单体峰计算为1.01，在0.95～1.40范围内。
57.6.对供试品溶液的测定：取冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(麦芽糖赋形剂)供试品溶液20μl，注入色谱柱，记录色谱图90分钟，重复进样两次，其中一次进样的hplc谱图如图2所示，其中保留时间为34.700min的色谱峰为人血白蛋白的单体峰，保留时间为29.952min的色谱峰为人血白蛋白的二聚体峰，保留时间为20.047min的色谱峰为人血白蛋白以及其他杂质蛋白的多聚体峰。
58.以面积归一化法计算，色谱图中单体峰加二聚体峰的％峰面积，即为冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(麦芽糖赋形剂)供试品溶液中人血白蛋白的蛋白含量。
59.表2.冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)纯度检验结果即，冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(麦芽糖赋形剂)中人血白蛋白的含量为95.4，大于90％，满足质控要求。
60.7.方法学考察：(1)重复性试验：精密量取预处理后的供试品溶液6份，采用同样的色谱条件进行hplc分析。计算供试品中人血白蛋白纯度的含量，并计算rsd，结果如表3所示：表3.重复性实验结果
由表3可见，本实施例提供的方法在经过6次重复分析后，rsd为0.05％，表明该方法的重复性良好，结果的准确性高。
61.(2)耐用性试验：分别在流动相ph(4～6)、流速(0.2～1.0)ml/min范围内考察系统参数微小变化对冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(麦芽糖赋形剂)的测得结果的影响，结果如下：表4.耐用性试验结果由表3可见，在流动相的ph在4.5～5.5、流速在0.3～0.8ml/min范围内，人血白蛋白的测得结果差异性很小，说明选用该参数范围内的色谱条件进行检测，方法的耐用性好。而当流动相的ph为4或6时，由于酸可以使蛋白沉淀或因影响样品ph值平衡，导致检测结果的误差较大；同样地，当流动相的流速为0.2ml/min或1.0ml/min时，由于流速过慢或过快，导致出峰时间延迟或分离度不佳，从而使得检测结果误差较大。
62.实施例2本实施例提供一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其方法与实施例1相同，不同之处在于，以右旋糖酐40为赋形剂的冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)作为检测对象。
63.(1)供试品溶液的制备方法如下：
取冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(右旋糖酐40赋形剂)加0.5ml灭菌注射用水稀释后振荡器上充分溶解，用台式离心机10000rpm离心10分钟，取上清样品置于进样瓶中制成冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(右旋糖酐40赋形剂)供试品溶液。
64.(2)对供试品溶液的测定：取冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(右旋糖酐40赋形剂)供试品溶液及冻干乙型20μl，注入色谱柱，记录色谱图90分钟，重复进样两次。其中一次进样的hplc谱图如图3所示，其中保留时间为34.746min的色谱峰为人血白蛋白的单体峰，保留时间为30.050min的色谱峰为人血白蛋白的二聚体峰，保留时间为20.026min的色谱峰为人血白蛋白以及其他杂质蛋白的多聚体峰。
65.以面积归一化法计算，色谱图中单体峰加二聚体峰的％峰面积，即为冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)(右旋糖酐40赋形剂)供试品溶液中人血白蛋白的蛋白含量。
66.表5.冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)纯度检验结果由表5可见，本技术提出的测定方法具有很好的普适性，能够对多种冻干乙型脑炎灭活疫苗(vero细胞)中人血蛋白的纯度进行测定。
67.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，其包括：对冻干乙型脑炎灭活疫苗进行前处理，得到供试品溶液；采用hplc对所述供试品溶液进行色谱分析，并采用面积归一化法计算所得色谱图中人血白蛋白的单体峰和二聚体峰的峰面积占比，二者之和即为所述冻干乙型脑炎灭活疫苗的蛋白纯度；其中，所述hplc的色谱条件为：采用凝胶色谱柱，以ph为4.5~5.5的缓冲液为流动相，进行等度洗脱，流速为0.3~0.8 ml/min。2.根据权利要求1所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，所述缓冲液为醋酸缓冲液，且含有氯化钠和吐温80。3.根据权利要求2所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，所述流动相中，所述氯化钠的浓度为0.4-0.6 m；所述吐温80的体积百分含量为0.1-0.4
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。4.根据权利要求1所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，所述hplc的色谱条件还包括：检测波长：270~290 nm、进样量：8~20 μl、洗脱时间为50~90min。5.根据权利要求1所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为tsk-gel系列色谱柱，柱直径为5-10mm，柱长为30-60cm，填料粒径为5-10μm。6.根据权利要求5所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为tsk gel g3000sw色谱柱。7.根据权利要求1所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：将冻干乙型脑炎灭活疫苗用水稀释后震荡溶解，于8000-12000rpm下离心8-12min，取上清液作为所述供试品溶液。8.根据权利要求1所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，还包括配制人血白蛋白对照品溶液，进样至所述色谱柱，采用所述hplc的色谱条件分析，以进行系统适用性验证。9.根据权利要求8所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，在进行系统适用性验证中，当人血白蛋白对照品溶液的色谱图中人血白蛋白的单体峰与二聚体峰间的分离度>1.5，拖尾因子在0.95-1.40范围内时，判定为系统适用性满足检测需求。10.根据权利要求8所述的冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法，其特征在于，所述人血白蛋白对照品溶液中人血白蛋白的含量为10-30 mg/ml。

技术总结
本申请涉及疫苗检测领域，具体公开了一种冻干乙型脑炎灭活疫苗中人血白蛋白纯度的测定方法。该测定方法包括：对冻干乙型脑炎灭活疫苗进行前处理，得到供试品溶液；采用HPLC对供试品溶液进行色谱分析，并采用面积归一化法计算所得色谱图中人血白蛋白的单体峰和二聚体峰的峰面积占比，二者之和即为冻干乙型脑炎灭活疫苗的蛋白纯度。该方法利用分子排阻色谱分离的原理，以凝胶色谱柱为分离柱，仅以pH为4.5~5.5的缓冲液作为单一流动相进行等度洗脱，不但能够实现人血白蛋白与其它杂质蛋白的有效分离。通过该方法能够对冻干乙型脑炎灭活疫苗中的人血白蛋白纯度指标进行有效评价和控制，进而提升疫苗的安全性和效价。进而提升疫苗的安全性和效价。进而提升疫苗的安全性和效价。


技术研发人员：赵鑫 张晓非 栗生威 孙非非 毛昱 张伟
受保护的技术使用者：辽宁成大生物股份有限公司
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/20