基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像系统及方法

1.本发明涉及光学成像系统及同步多色荧光分离方法技术领域，特别是基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像系统及方法。


背景技术：

2.荧光涨落超分辨技术利用荧光信号的涨落特性，突破了传统光学显微成像的衍射极限。现有的基于荧光涨落超分辨显微成像技术，如超分辨光学闪烁显微成像技术(sofi)、超分辨率径向波动算法(srrf)、基于荧光涨落的多信号分类算法(musical)、均值偏移超分辨算法(mssr)等，均能显著提升成像的分辨率。现有的多色荧光显微成像主要为空间分波长或时间上分波长的方式进行多色图像采集。从空间上分波长就是引入多个波长通道和图像探测光路，这不仅会显著增加多色荧光信号的损耗，也会提高系统的成本和复杂性、降低系统的稳定性；从时间上分波长就是对多色样本分多次在不同时间段采集不同波长的荧光，这会导致不同波长之间出现时间差，并且会显著降低成像的时间分辨率。通过多波长激发与高阶累积量分离多色光谱的技术需要多路激发光路，显著增加了系统的复杂性、降低系统稳定性，并且高阶累积量函数分析方法会导致多种伪影信号影响图像重建的质量。现有的多色超分辨成像技术在处理图像序列的过程中通常是通过空间分波长采集或者时间分波长的方法才能实现多波长信号的信号分离。空间分波长采集信号会大大增加成像系统复杂度与成本，时间分波长则会降低成像速率。因此，进一步发展多色荧光显微技术在激发光路数、占用空间分波长通道数与消除通道延时之间相互制约的问题限制了基于荧光涨落超分辨显微成像在同步观察多色标记的亚细胞器等生命科学研究中的应用。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像系统及方法，该方法能够在仅使用单波长激发光、两个荧光信号采集通道和单相机图像采集的情况下，实现对多色荧光样品的采集与分离，有效解决了激发光路数、占用空间分波长通道数与消除通道延时之间相互制约的问题。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像系统，包括一激发光源，用以提供一束激发光；
5.一第一会聚透镜，对来自所述激发光源的所述激发光进行聚光，并且来自所述激发光源的所述激发光穿透所述第一会聚透镜；
6.一第一二向色镜，反射来自所述第一会聚透镜的所述激发光；
7.一物镜，透射来自所述第一二向色镜的所述激发光；
8.一载物台，其上设置有生物细胞样品，并且来自所述物镜的所述激发光照射在所述生物样品上，所述生物样品在来自所述物镜的所述激发光的激发下会发射荧光，所述荧光通过所述物镜发射到所述第一二向色镜，所述第一二向色镜透射来自所述物镜的所述荧光；
9.一第二会聚透镜，对来自所述第一二向色镜的所述荧光进行聚光，并且来自所述第二二向色镜的所述荧光穿透所述第二会聚透镜；
10.一第三会聚透镜，对来自所述第二会聚透镜的所述荧光进行聚光，并且来自所述第二会聚透镜的所述荧光穿透所述第三会聚透镜；
11.一第二二向色镜，对来自所述第三会聚透镜的所述荧光进行分光，一部分来自所述第三会聚透镜的所述荧光被所述第二二向色镜反射，另一部分来自所述第三会聚透镜的所述荧光被所述第二二向色镜透射；
12.一第一反射镜，对被所述第二二向色镜反射的所述荧光进行反射；
13.一第二反射镜对被所述第一反射镜反射的所述荧光进行反射；
14.一第三反射镜，对被所述第二反射镜反射的所述荧光进行反射；
15.一第四反射镜，对被所述第二二向色镜透射的所述荧光进行反射；
16.一第五反射镜，对被所述第四反射镜反射的所述荧光进行反射；
17.一第六反射镜，对被所述第五反射镜反射的所述荧光进行反射；
18.一第七反射镜，对被所述第六反射镜反射的所述荧光进行反射；
19.一cmos相机，用于对来自所述第三反射镜反射的所述荧光进行成像，与对来自所述第七反射镜反射的所述荧光进行成像。
20.本发明还提供了基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像方法，采用所述的基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像系统，包括以下步骤：
21.步骤1：设置基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像系统，所述基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像系统包括有激发光源、第一会聚透镜、第一二向色镜、物镜、载物台、第二会聚透镜、第三会聚透镜、基于缓变透过率的第二二向色镜、第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第六反射镜、第七反射镜和cmos相机；
22.步骤2：使用六种不同荧光发射波长的量子点分别标记生物样品中的不同细胞结构，并使用单波长激发光对六种量子点进行短波激发发光；
23.步骤3：将经过标记的生物样品放置并固定在载物台上；
24.步骤4：调节物镜与生物样品之间的距离，使生物样品位于物镜的焦点上，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；
25.步骤5：激发光源发出的激发光经第一会聚透镜发射到第一二向色镜，经第一二向色镜反射的光经物镜照射生物样品，生物样品受激发产生荧光，荧光经物镜发射到第一二向色镜，经第一二向色镜透射的光发射到第二会聚透镜进行会聚，经第二会聚透镜透射的光发射到第三会聚透镜进行会聚，经第三会聚透镜透射的光发射到具有缓变透过率的第二二向色镜，经第二二向色镜反射的光经第一反射镜反射到第二反射镜，经第二反射镜反射的光经第三反射镜反射到cmos相机进行荧光成像，经第二二向色镜透射的光发射到第四反射镜，经第四反射镜反射的光反射到第五反射镜，经第五反射镜反射的光反射到第六反射镜，经第六反射镜反射的光反射到第七反射镜，经第七反射的光反射到cmos相机进行荧光成像；
26.步骤6：使用并调节单波长激发光的输出功率，同时激发多种波长量子点发光，并用单个相机观察采集荧光图像，当观察到明显的荧光强度闪烁现象时，稳定激发光的输出
功率；
27.步骤7：使用单个相机同步采集经过sigmoid曲线缓变透过率二向色镜分光的反射通道与透射通道信号，并对采集的反射通道和投射通道的图像时间序列使用亚像素定位算法定位出相同区域；
28.步骤8：使用经亚像素定位算法定位后的两个通道图像序列计算不同组合的相关函数，并组成方程组求解对应单色相关函数，分离出不同波长信号；
29.步骤9：使用多通道相互迭代的方法对分离后单色波长信号进行降低串色处理；
30.步骤10：用降低串色后的不同波长的荧光图像进行超分辨算法处理，即可得到不同细胞结构的高分辨率图像。
31.在一较佳的实施例中，所述第一二向色镜选用能够反射来自所述第一会聚透镜的激发光并且透射所标记的六种量子点发射的荧光的波长；所述第二二向色镜的透过率是基于sigmoid曲线的缓变透过率，对多色荧光信号进行分光且其对不同波长的荧光信号有不同的反射和透射响应系数；所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七反射镜将所述第二二向色镜分光产生的反射光和透射光反射到同一cmos相机上。
32.在一较佳的实施例中，缓变透过率通过sigmoid函数的表达式进行表示：
[0033][0034]
式中：λ为波长；a与b为曲线斜率参数，a取值0.05，b取值600。
[0035]
在一较佳的实施例中，对经过亚像素对齐的双通道荧光信号图片进行不同组合求出多组n阶相关函数；经过基于sigmoid函数缓变透过率的二向色镜3分光产生的反射和透射的荧光信号表示为：
[0036][0037][0038]
式中：r表示像素点坐标；t表示信号采集的时间；sa表示反射通道信号与sb表示透射通道信号；ai表示二向色镜对第i个波长信号的反射率；bi表示二向色镜对第i个波长信号的透射率，反射率ai与透射率bi和的理论值为1；
[0039]
对两个通道荧光涨落信号计算n阶相关函数corrn，得到：
[0040][0041]
式中：r表示像素点坐标；t表示信号采集的时间；sa表示反射通道信号与sb表示透射通道信号；n为波长通道数；ai表示二向色镜对第i个波长信号的反射率；bi表示二向色镜对第i个波长信号的透射率；si(r,t)表示第i种荧光分子的强度信号分布；corrn{si(r,t)}表示第i波长荧光涨落信号的单色相关函数；对反射通道信号与透射通道信号组合计算n阶相关函数可以得到n+1个方程；当波长通道数n等于n+1时，方程组中未知数与方程数量相等，直接通过解方程求解出单色相关函数corrn{si(r,t)}，即提取出每个波长的信号；
[0042]
对分离出的不同波长图片进行降低串色处理，即得到多色生物样品每个波长单独的图像，降低串色的迭代公式如下所示：
[0043][0044]
式中：为串色系数；λ(0《λ《1)为缩放系数。
[0045]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0046]
1、本发明对同一生物样本的不同细胞结构同时进行荧光标记，同时提出了使用基于sigmoid函数构建具有缓变透过率分布曲线的二向色镜，对多色荧光信号进行分光，并通过同步多色荧光涨落超分辨成像算法对图像序列进行处理，实现不同波长信号光的分离，解决了激发光路数、占用空间分波长通道数与消除通道延时之间相互制约的问题。
[0047]
2、本发明中采用的六种不同荧光发射波长的量子点作为生物标记物，其可以由同一波长光源激发，大大降低了系统的复杂性和成本。
[0048]
3、本发明通过两组反射镜对反射通道和透射通道的荧光信号进行汇聚，仅需要使用一个cmos相机即采集双通道多色荧光信号，大大减少了成像设备成本。本发明可以广泛应用于生物样品的荧光成像过程中。
附图说明
[0049]
图1是本发明优选实施例中一种基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像系统的结构示意图；
[0050]
图2本发明优选实施例中基于sigmoid曲线的缓变二向色镜透过率示意曲线。
[0051]
图3本发明优选实施例中生物细胞样本多色标记的示意图。
具体实施方式
[0052]
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
[0053]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0054]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式；如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0055]
如图1所示，本发明提出了一种基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像系统，它包括一激发光源1、两个二向色镜2、3、一物镜4、一载物台5、三个会聚透镜6、7、8、七个反射镜9、10、11、12、13、14、15和一个cmos相机16。
[0056]
激发光源1用以提供一束单波长激发光。会聚透镜6设置在激发光所行经的光路上，并对激发光源1所发出的激发光进行聚光。二向色镜2反射来自会聚透镜6的激发光，反射后的激发光通过物镜4照射在载物台5上的生物样品17上。生物样品17在激发光的激发下会发射荧光，荧光通过物镜4发射到二向色镜2。二向色镜2透射来自物镜4的荧光。会聚透镜7设置在来自二向色镜2的透射荧光的光路上，并对来自二向色镜2的荧光进行会聚。会聚透
镜8设置在来自会聚透镜7的透射荧光的光路上，并对来自会聚透镜7的荧光进行会聚。二向色镜3设置在来自会聚透镜8的透射荧光的光路上，并对来自会聚透镜8的荧光进行分光，一部分荧光被二向色镜3反射，一部分荧光被二向色镜3透射。反射镜9设置在来自二向色镜3的反射荧光的光路上，并对来自二向色镜3的反射荧光进行反射。反射镜10设置在来自反射镜9的反射荧光的光路上，并对来自反射镜9的反射荧光进行反射。反射镜11设置在来自反射镜10的反射荧光的光路上，并对来自反射镜10的反射荧光进行反射使反射荧光在cmos相机16上成像。反射镜12设置在来自二向色镜3的透射荧光的光路上，并对来自二向色镜3的透射荧光进行反射。反射镜13设置在来自反射镜12的反射荧光的光路上，并对来自反射镜12的反射荧光进行反射。反射镜14设置在来自反射镜13的反射荧光的光路上，并对来自反射镜13的反射荧光进行反射。反射镜15设置在来自反射镜14的反射荧光的光路上，并对来自反射镜14的反射荧光进行反射使反射荧光在cmos相机16上成像。
[0057]
本发明使用一个cmos相机采集经基于缓变透过率二向色镜分光的透射通道和反射通道两个信号，对样品17进行多帧荧光涨落图像序列采集成像。对采集的透射通道和反射通道的信号进行亚像素对齐，并对不同波长的信号进行分离，即可得到不同波长荧光信号的图像序列。对分离出的每种波长图像使用超分辨算法处理，最终可以获得每种量子点标记的不同细胞结构的高分辨率图像。
[0058]
上述实施例中，激发光源1可采用激光器。
[0059]
上述实施例中，物镜4可以选用数值孔径大于1.4的物镜，以便cmos相机16能够采集到尽可能高分辨率的宽场图像，便于后期利用超分辨涨落显微成像算法实现对空间分辨率的进一步提升，突破光学衍射极限。
[0060]
上述实施例中，采用的是倒置荧光显微镜的方式对生物样品14进行成像，也可以采用正置式荧光显微镜的方式，两者的区别仅是将光路进行上下翻转，即当采用正置式荧光显微镜时，生物样品14设置在物镜4的下部，当采用倒置式荧光显微镜时，生物样品14设置在物镜4的上部(如图1所示)。
[0061]
基于上述基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像系统，本发明还提出了一种基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像方法，该方法包括以下步骤：
[0062]
1)使用多种不同荧光发射波长的量子点18、19、20、21、22、23分别标记生物样品17中的不同的细胞结构24、25、26、27、28、29。
[0063]
2)将经过标记的生物样品17放置并固定在载物台5上。
[0064]
3)精细调节物镜4与生物样品17之间的距离，使得生物样品17位于物镜4的焦点上，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系。
[0065]
4)开启激发光源1，调节激发光的输出功率，并同时通过cmos相机16观察采集到的荧光图像，当观察到明显的荧光强度闪烁现象时，稳定激发光的输出功率。
[0066]
5)设置合适的cmos相机曝光时间(通常设置为10～30毫秒)，用cmos相机16同时采集由基于缓变(如图2所示)透过率的二向色镜3分光产生的反射和透射的荧光信号，采集的帧数为1000帧，缓变透过率可以通过sigmoid函数的表达式进行表示：
[0067]
[0068]
式中：λ为波长；a与b为曲线斜率参数，a取值0.05，b取值600。
[0069]
6)对采集的两个通道的图像时间序列分别使用亚像素定位算法进行同区域定位。
[0070]
7)对经过亚像素对齐的双通道荧光信号图片进行不同组合求出多组n阶相关函数。理论上，经过基于sigmoid函数缓变透过率的二向色镜3分光产生的反射和透射的荧光信号可以表示为：
[0071][0072][0073]
式中：r表示像素点坐标；t表示信号采集的时间；sa表示反射通道信号与sb表示透射通道信号；ai表示二向色镜对第i个波长信号的反射率；bi表示二向色镜对第i个波长信号的透射率，反射率ai与透射率bi和的理论值为1。
[0074]
对两个通道荧光涨落信号计算n阶相关函数corrn，可以得到：
[0075][0076]
式中：r表示像素点坐标；t表示信号采集的时间；sa表示反射通道信号与sb表示透射通道信号；n为波长通道数；ai表示二向色镜对第i个波长信号的反射率；bi表示二向色镜对第i个波长信号的透射率；si(r,t)表示第i种荧光分子的强度信号分布；corrn{si(r,t)}表示第i波长荧光涨落信号的单色相关函数。对反射通道信号与透射通道信号组合计算n阶相关函数可以得到n+1个方程。当波长通道数n等于n+1时，方程组中未知数与方程数量相等，可以直接通过解方程求解出单色相关函数corrn{si(r,t)}，即提取出每个波长的信号。
[0077]
8)对分离出的不同波长图片进行降低串色处理，即可得到多色生物样品每个波长单独的图像，降低串色的迭代公式如下所示：
[0078][0079]
式中：为串色系数；λ(0《λ《1)为缩放系数。
[0080]
9)对每个波长图像使用超分辨算法srrf或mssr处理，实现多色生物样本的超分辨荧光成像。
[0081]
上述各实施例中，如图3所示，生物样品17标记了六种量子点18、19、20、21、22、23，六种量子点18、19、20、21、22、23标记与不同的细胞结构24、25、26、27、28、29上。其中，量子点18的荧光发射中心波长为525nm，量子点19的荧光发射中心波长为545nm，量子点20的荧光发射中心波长为565nm，量子点21的荧光发射中心波长为585nm，量子点22的荧光发射中心波长为625nm，量子点23的荧光发射中心波长为655nm，六种量子点可由同一个波长的激发光进行激发。
[0082]
上述各实施例中，二向色镜2应当针对所标记的不同量子点选用合适的波长。二向色镜2应反射来自会聚透镜6的激发光，透射所标记的三种量子点18、19、20、21、22、23发射的荧光；二向色镜3基于sigmoid曲线的缓变透过率，对不同波长的荧光信号有不同的反射和透射系数；cmos相机16采集反射和透射通道的信号，然后使用分离算法对不同波长信号
进行分离。
[0083]
本产品基于宽场荧光显微镜，仅需搭建基于缓变透过率二向色镜的分光光路，通过单波长激发多色荧光信号，并通过采集反射和透射双通道多色信号，无需占用更多通道数，可使用单个cmos相机实现多色波长通道的同步图像采集，为同步多色观测多种亚细胞结构的研究提供新的方法和途径。
[0084]
一种基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像系统及方法。首先单波长激发光激发多种波长量子点同时发出荧光信号；其次使用基于缓变透过率二向色镜的成像系统对所述多色荧光信号进行分光，将多色信号光分成反射通道和透射通道信号，并使用单个cmos相机同时采集双通道荧光信号；接着使用基于荧光涨落的高阶相关函数运算方法对所述反射通道和透射通道信号进行分离处理，实现多色荧光信号的分离；然后对所述分离后的每个单色荧光信号进行降低串色处理；最后使用超分辨算法处理所述单色荧光信号，实现多色生物样本的超分辨成像。
[0085]
上述实施例仅用于说明本发明，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

技术特征：
1.基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像系统，其特征在于包括一激发光源，用以提供一束激发光；一第一会聚透镜，对来自所述激发光源的所述激发光进行聚光，并且来自所述激发光源的所述激发光穿透所述第一会聚透镜；一第一二向色镜，反射来自所述第一会聚透镜的所述激发光；一物镜，透射来自所述第一二向色镜的所述激发光；一载物台，其上设置有生物细胞样品，并且来自所述物镜的所述激发光照射在所述生物样品上，所述生物样品在来自所述物镜的所述激发光的激发下会发射荧光，所述荧光通过所述物镜发射到所述第一二向色镜，所述第一二向色镜透射来自所述物镜的所述荧光；一第二会聚透镜，对来自所述第一二向色镜的所述荧光进行聚光，并且来自所述第二二向色镜的所述荧光穿透所述第二会聚透镜；一第三会聚透镜，对来自所述第二会聚透镜的所述荧光进行聚光，并且来自所述第二会聚透镜的所述荧光穿透所述第三会聚透镜；一第二二向色镜，对来自所述第三会聚透镜的所述荧光进行分光，一部分来自所述第三会聚透镜的所述荧光被所述第二二向色镜反射，另一部分来自所述第三会聚透镜的所述荧光被所述第二二向色镜透射；一第一反射镜，对被所述第二二向色镜反射的所述荧光进行反射；一第二反射镜对被所述第一反射镜反射的所述荧光进行反射；一第三反射镜，对被所述第二反射镜反射的所述荧光进行反射；一第四反射镜，对被所述第二二向色镜透射的所述荧光进行反射；一第五反射镜，对被所述第四反射镜反射的所述荧光进行反射；一第六反射镜，对被所述第五反射镜反射的所述荧光进行反射；一第七反射镜，对被所述第六反射镜反射的所述荧光进行反射；一cmos相机，用于对来自所述第三反射镜反射的所述荧光进行成像，与对来自所述第七反射镜反射的所述荧光进行成像。2.基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像方法，其特征在于采用权利要求1所述的基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像系统，包括以下步骤：步骤1：设置基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像系统，所述基于缓变透过率二向色镜的同步多色荧光涨落超分辨成像系统包括有激发光源、第一会聚透镜、第一二向色镜、物镜、载物台、第二会聚透镜、第三会聚透镜、基于缓变透过率的第二二向色镜、第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第六反射镜、第七反射镜和cmos相机；步骤2：使用六种不同荧光发射波长的量子点分别标记生物样品中的不同细胞结构，并使用单波长激发光对六种量子点进行短波激发发光；步骤3：将经过标记的生物样品放置并固定在载物台上；步骤4：调节物镜与生物样品之间的距离，使生物样品位于物镜的焦点上，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；步骤5：激发光源发出的激发光经第一会聚透镜发射到第一二向色镜，经第一二向色镜反射的光经物镜照射生物样品，生物样品受激发产生荧光，荧光经物镜发射到第一二向色
镜，经第一二向色镜透射的光发射到第二会聚透镜进行会聚，经第二会聚透镜透射的光发射到第三会聚透镜进行会聚，经第三会聚透镜透射的光发射到第二二向色镜，经第二二向色镜反射的光经第一反射镜反射到第二反射镜，经第二反射镜反射的光经第三反射镜反射到cmos相机进行荧光成像，经第二二向色镜透射的光发射到第四反射镜，经第四反射镜反射的光反射到第五反射镜，经第五反射镜反射的光反射到第六反射镜，经第六反射镜反射的光反射到第七反射镜，经第七反射的光反射到cmos相机进行荧光成像；步骤6：使用并调节单波长激发光的输出功率，同时激发多种波长量子点发光，并用单个相机观察采集荧光图像，当观察到明显的荧光强度闪烁现象时，稳定激发光的输出功率；步骤7：使用单个相机同步采集经过sigmoid曲线缓变透过率二向色镜分光的反射通道与透射通道信号，并对采集的反射通道和投射通道的图像时间序列使用亚像素定位算法定位出相同区域；步骤8：使用经亚像素定位算法定位后的两个通道图像序列计算不同组合的相关函数，并组成方程组求解对应单色相关函数，分离出不同波长信号；步骤9：使用多通道相互迭代的方法对分离后单色波长信号进行降低串色处理；步骤10：用降低串色后的不同波长的图片进行超分辨算法处理，即可得到不同细胞结构的高分辨率图像。3.根据权利要求1所述的基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像方法，其特征在于，所述第一二向色镜选用能够反射来自所述第一会聚透镜的激发光并且透射所标记的六种量子点发射的荧光的波长；所述第二二向色镜的透过率是基于sigmoid曲线的缓变透过率，对多色荧光信号进行分光且其对不同波长的荧光信号有不同的反射和透射响应系数；所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七反射镜将所述第二二向色镜分光产生的反射光和透射光反射到同一cmos相机上。4.根据权利要求1所述的基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像方法，其特征在于，缓变透过率通过sigmoid函数的表达式进行表示：式中：λ为波长；a与b为曲线斜率参数。5.根据权利要求1所述的基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像方法，其特征在于，对经过亚像素对齐的双通道荧光信号图片进行不同组合求出多组n阶相关函数；经过基于sigmoid函数缓变透过率的二向色镜3分光产生的反射和透射的荧光信号表示为：基于sigmoid函数缓变透过率的二向色镜3分光产生的反射和透射的荧光信号表示为：式中：r表示像素点坐标；t表示信号采集的时间；s
a
表示反射通道信号与s
b
表示透射通道信号；a
i
表示二向色镜对第i个波长信号的反射率；b
i
表示二向色镜对第i个波长信号的透射率，反射率a
i
与透射率b
i
和的理论值为1；对两个通道荧光涨落信号计算n阶相关函数corr
n
，得到：
式中：r表示像素点坐标；t表示信号采集的时间；s
a
表示反射通道信号与s
b
表示透射通道信号；n为波长通道数；a
i
表示二向色镜对第i个波长信号的反射率；b
i
表示二向色镜对第i个波长信号的透射率；s
i
(r,t)表示第i种荧光分子的强度信号分布；corr
n
{s
i
(r,t)}表示第i波长荧光涨落信号的单色相关函数；对反射通道信号与透射通道信号组合计算n阶相关函数可以得到n+1个方程；当波长通道数n等于n+1时，方程组中未知数与方程数量相等，直接通过解方程求解出单色相关函数corr
n
{s
i
(r,t)}，即提取出每个波长的信号；对分离出的不同波长图片进行降低串色处理，即得到多色生物样品每个波长单独的图像，降低串色的迭代公式如下所示：式中：为串色系数；λ(0<λ<1)为缩放系数。

技术总结
本发明涉及基于缓变透过率二向色镜的多色荧光涨落成像系统及方法，它包括：采用多种波长量子点荧光标记不同亚细胞器结构，并使用单一波长激发光进行激发获得多色荧光信号；采用基于缓变透过率二向色镜对所述多色荧光信号进行分光，并用单相机同时采集反射通道与透射通道的多色荧光信号；采用基于高阶相关函数计算的方法分离不同波长荧光信号；采用多波长通道信号相互迭代的方式降低不同通道之间串色；采集基于荧光涨落的超分辨成像方法对降低串色后的不同波长的图像进行超分辨算法处理，得到不同亚细胞器精细结构的高分辨率图像。最终通过单波长激发、双通道信号的单相机采集，多色荧光信号的分离，实现不同亚细胞器结构的同步多色超分辨成像。同步多色超分辨成像。同步多色超分辨成像。


技术研发人员：曾志平 李文波 邱锦 许必晴 许灿华 黄衍堂
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/20