一种用于检测多种西番莲病毒的多重LAMP引物组、试剂盒及其应用的制作方法

一种用于检测多种西番莲病毒的多重lamp引物组、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物检疫技术领域，具体涉及一种用于检测多种西番莲病毒的多重lamp引物组、试剂盒及其应用，特别涉及一种基于lamp技术检测多种西番莲病毒的方法，该方法适用于农业生产和口岸植物检疫上西番莲病毒的快速检测。


背景技术：

2.西番莲原产于南美洲，是我国南方重要的特色果树，可用作鲜食、加工或观赏绿化。近年来，随着人们对西番莲需求的增长，我国西番莲的种植面积不断增大。然而，西番莲在栽培生产过程中，病毒病的发生日益严重，已成为影响其产量和品质的第二大病害。东亚西番莲病毒(east asian passiflora virus，eapv)、夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus，temv)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，cmv)是当前危害我国西番莲的主要病毒种类。其中，eapv、temv是近年来我国西番莲上新报道的2种马铃薯病毒科马铃薯y病毒属病毒。eapv侵染西番莲后引起叶片花叶、果实畸形和木质化等症状，能引起西番莲木质化病，造成的危害十分严重，西番莲商品价值几乎完全丧失。temv侵染西番莲后能引起一系列症状，包括叶片花叶、扭曲和果实斑驳、变小等，造成西番莲产量和品质大幅度下降。cmv为雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属成员，是国际上最重要的十大植物病毒之一，该病毒侵染西番莲能引起环斑、花叶、皱缩、顶部坏死和果实木质化等症状，严重影响西番莲的生产安全。eapv、temv和cmv引起的西番莲病毒病，至今尚无有效的防治手段，因此建立快速检测和筛查技术，是防控三种病毒为害的关键。
3.目前，西番莲病毒常用的检测方法包括电镜观察、elisa检测和rt-pcr。电镜观察方法一般用于病毒的辅助鉴定，因需要昂贵的电镜设备和专业的技术人员，不适合用于基层实验室和现场快速检测eapv、temv和cmv。elisa检测虽然具有操作简单、特异、一次性检测样品量大等优点，但存在灵敏度低，易出现假阴性的问题。与elisa检测技术相比，rt-pcr特异性更强、灵敏度更高，但该方法需要使用精密的pcr仪，且检测时间仍需4-5小时。因此，亟需建立一种快速、简单、高效的检测方法，用于西番莲上eapv、temv和cmv的检测，以期为及时采取防控措施提供技术支持。
4.环介导等温扩增(lamp)是一种新型核酸扩增技术，无需变温反应，该技术利用4-6条特异性引物和链置换dna聚合酶(bst dna聚合酶)在60～65℃的恒温条件下反应30～60min即可高效、特异地扩增目标序列，扩增产物可以直接通过肉眼观察混浊程度或加入荧光染料后颜色变化来判定有无。相比传统的pcr检测方法，lamp技术具有检测时间短、仪器设备要求低、操作简便、结果易于判定、特异性强和灵敏度高的优点，已被应用于植物病毒的检测鉴定，但关于同时检测西番莲上东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的多重rt-lamp检测方法至今尚未见报道，更未见专门的多重lamp检测试剂盒。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是如何快速、简单、高效的实现同时检测西番莲上的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒三种病毒。
6.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测或辅助检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的成套引物组。
7.本发明提供的用于检测或辅助检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的成套引物组由检测或辅助检测东亚西番莲病毒的引物组、检测或辅助检测夜来香花叶病毒的引物组和检测或辅助检测黄瓜花叶病毒的引物组组成；
8.所述检测或辅助检测东亚西番莲病毒的引物组由eapv-f3、eapv-b3、eapv-fip和eapv-bip组成；
9.所述检测或辅助检测夜来香花叶病毒的引物组由temv-f3、temv-b3、temv-fip和temv-bip组成；
10.所述检测或辅助检测黄瓜花叶病毒的引物组由cmv-f3、cmv-b3、cmv-fip和cmv-bip组成；
11.所述eapv-f3为如下a1)或a2)：
12.a1)序列表中序列1所示的单链dna分子；
13.a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；
14.所述eapv-b3为如下a3)或a4)：
15.a3)序列表中序列2所示的单链dna分子；
16.a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子；
17.所述eapv-fip为如下a5)或a6)：
18.a5)序列表中序列3所示的单链dna分子；
19.a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；
20.所述eapv-bip为如下a7)或a8)：
21.a7)序列表中序列4所示的单链dna分子；
22.a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；
23.所述temv-f3为如下a9)或a10)：
24.a9)序列表中序列5所示的单链dna分子；
25.a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链dna分子；
26.所述temv-b3为如下a11)或a12)：
27.a11)序列表中序列6所示的单链dna分子；
28.a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链dna分子；
29.所述temv-fip为如下a13)或a14)：
30.a13)序列表中序列7所示的单链dna分子；
31.a14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链dna分子；
32.所述temv-bip为如下a15)或a16)：
33.a15)序列表中序列8所示的单链dna分子；
34.a16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链dna分子；
35.所述cmv-f3为如下a17)或a18)：
36.a17)序列表中序列9所示的单链dna分子；
37.a18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链dna分子；
38.所述cmv-b3为如下a19)或a20)：
39.a19)序列表中序列10所示的单链dna分子；
40.a20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的单链dna分子；
41.所述cmv-fip为如下a21)或a22)：
42.a21)序列表中序列11所示的单链dna分子；
43.a22)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的单链dna分子；
44.所述cmv-bip为如下a23)或a24)：
45.a23)序列表中序列12所示的单链dna分子；
46.a24)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的单链dna分子。
47.进一步的，所述检测或辅助检测东亚西番莲病毒的引物组中，所述eapv-f3、所述eapvb3、所述eapv-fip和所述eapv-bip的摩尔比可为1:1:8:8。
48.所述检测或辅助检测夜来香花叶病毒的引物组中，所述temv-f3、所述temv-b3、所述temv-fip和所述temv-bip的摩尔比可为1:1:8:8。
49.所述检测或辅助检测黄瓜花叶病毒的引物组中，所述cmv-f3、所述cmv-b3、所述cmv-fip和所述cmv-bip的摩尔比可为1:1:8:8。
50.更进一步的，所述成套引物组中，所述eapv-f3、所述eapvb3、所述eapv-fip、所述eapv-bip、所述temv-f3、所述temv-b3、所述temv-fip、所述temv-bip、所述cmv-f3、所述cmv-b3、所述cmv-fip和所述cmv-bip的摩尔比可为1:1:8:8:1:1:8:8:1:1:8:8。
51.为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种用于检测或辅助检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的试剂盒。
52.本发明提供的用于检测或辅助检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的试剂盒包括上述成套引物组。
53.进一步的，所述试剂盒还可包括如下组分中的至少一种：rm反应缓冲液、bst dna聚合酶、amv逆转录酶、荧光染料试剂。在本发明中对所述rm反应缓冲液、所述bst dna聚合酶、所述amv逆转录酶和所述荧光染料试剂的来源不做具体限定，采用本技术领域所熟知的
rm反应缓冲液、bst dna聚合酶、amv逆转录酶和荧光染料试剂即可。
54.更进一步的，所述试剂盒还可包括阴性对照和阳性对照。所述阴性对照可为不携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的样品。所述阳性对照可为携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的样品。
55.为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述成套引物组或上述试剂盒的新用途。
56.本发明提供了上述成套引物组或上述试剂盒在如下b1)-b6)任一种中的应用：
57.b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒；
58.b2)检测或辅助检测待测样品是否携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒；
59.b3)区分或辅助区分东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒与其它西番莲病毒；
60.b4)制备鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒的产品；
61.b5)制备检测或辅助检测待测样品是否携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒的产品；
62.b6)制备区分或辅助区分东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒与其它西番莲病毒的产品。
63.为了解决上述技术问题，本发明最后提供了如下c1)-c3)任一种方法：
64.c1)一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒的方法，包括如下步骤：提取待测病毒的rna，以待测病毒rna为模板，采用上述成套引物组进行反转录-环介导等温扩增反应；反应结束后通过观察反应体系颜色判断待测病毒是否为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒：若反应体系呈绿色，则待测病毒为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒；若反应体系呈橙色，则待测病毒不为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒；
65.c2)一种检测或辅助检测待测样品是否携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒的方法，包括如下步骤：提取待测样品的rna，以待测样品rna为模板，采用上述成套引物组进行反转录-环介导等温扩增反应；反应结束后通过观察反应体系颜色判断待测样品是否携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒：若反应体系呈绿色，则待测样品携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒；若反应体系呈橙色，则待测样品不携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒；
66.c3)一种区分或辅助区分东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒与其它西番莲病毒的方法，包括如下步骤：提取待测病毒的rna，以待测病毒rna为模板，采用上述成套引物组进行反转录-环介导等温扩增反应；反应结束后通过观察反应体系颜色判断待测病毒为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒还是其它西番莲病毒：若反应体系呈绿色，则待测病毒为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒；若反应体系呈橙色，则待测病毒为其它西番莲病毒。
67.进一步的，所述反转录-环介导等温扩增反应的条件可为61～65℃(或61～63℃或
63～65℃或61℃或63℃或65℃)反应45～60min(或45min或60min)，80℃灭活5min。
68.所述反转录-环介导等温扩增反应的体系可包括rna模板、rm反应缓冲液、bst dna聚合酶、amv逆转录酶、eapv-f3、eapv-b3、eapv-fip、eapv-bip、temv-f3、temv-b3、temv-fip、temv-bip、cmv-f3、cmv-b3、cmv-fip、cmv-bip、荧光染料试剂和rnase-free ddh2o。
69.更进一步的，所述eapv-f3、所述eapv-b3、所述eapv-fip、所述eapv-bip、所述temv-f3、所述temv-b3、所述temv-fip、所述temv-bip、所述cmv-f3、所述cmv-b3、所述cmv-fip和所述cmv-bip在反应体系中的终浓度分别为0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm、0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm、0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm。
70.上述任一所述方法或应用中，所述其它西番莲病毒为如下病毒中的至少一种：西番莲潜隐病毒、木槿潜隐皮尔斯堡病毒、芜菁花叶病毒、西番莲重型斑驳相关病毒。
71.为了克服现有技术中存在的缺陷和不足，本发明根据西番莲上已报道的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒基因组序列，选择特异性靶标片段，分别设计了lamp引物，经反复优化筛选，最终获得了用于同时检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的特异性lamp引物组，同时经反应体系和反应程序优化，确定了最佳反应体系和反应程序，建立了用于检测多种西番莲病毒的多重lamp技术。通过实验证明，本发明设计的lamp引物组具有特异性强、灵敏度高、准确性好、操作简便和结果直观的显著优点，具体体现为：
72.1)特异性强：lamp检测利用4条特异性引物对靶标基因的6个区域进行扩增，任意一条引物与扩增区域不匹配都不能进行反应，因此具有很强的特异性。本发明的多重rt-lamp引物组可以特异性检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒，而不与西番莲上其他病毒及阴性对照发生交叉反应。
73.2)灵敏度高：lamp具有很高的扩增效率，本发明的灵敏度高，最低仍可检测稀释到10-3
倍的总rna原液，与各个病毒单一引物的一步rt-pcr检测灵敏度相当，非常适合西番莲植株上病毒的早期检测。
74.3)高效：本发明在一个小时内可完成对病毒的检测，与一步rt-pcr相比，显著缩短了检测时间，且通过一次实验可以同时检测西番莲上三种病毒，大大提高了检测效率。
75.4)实用性强：本发明操作简便，无需特殊的仪器设备，在普通的水浴锅中也可完成，且检测结果直观，通过肉眼即可判断。
附图说明
76.图1为实施例2的多重lamp试剂盒检测结果。a为可视化检测图。b为扩增曲线图。其中，1：携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品；2：阴性对照；3：空白对照。
77.图2为实施例3的多重lamp试剂盒特异性测定结果。a为可视化检测图。b为扩增曲线图。其中，1：携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品；2：携带东亚西番莲病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品；3：携带夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品；4：携带东亚西番莲病毒和夜来香花叶病毒的西番莲样品；5：携带东亚西番莲病毒的西番莲样品；6：携带夜来香花叶病毒的西番莲样品；7：携带黄瓜花叶病毒的西番莲样品；8：携带西番莲潜隐病毒的西番莲样品；9：携带木槿潜隐皮尔斯堡病毒的西番莲样
品；10：携带芜菁花叶病毒的西番莲样品；11：携带西番莲重型斑驳相关病毒的西番莲样品；12：阴性对照；13：空白对照。
78.图3为实施例4的多重lamp试剂盒灵敏度测定结果。其中，1：10-1
稀释；2：10-2
稀释；3：10-3
稀释；4：10-4
稀释；5：10-5
稀释；6：10-6
稀释；7：10-7
稀释；8：阴性对照。
79.图4为实施例4的一步法rt-pcr灵敏度测定结果。a为东亚西番莲病毒一步rt-pcr灵敏度测定结果。b为夜来香花叶病毒一步rt-pcr灵敏度测定结果。c为黄瓜花叶病毒一步rt-pcr灵敏度测定结果。其中，1：10-1
稀释；2：10-2
稀释；3：10-3
稀释；4：10-4
稀释；5：10-5
稀释；6：10-6
稀释；7：10-7
稀释；8：阴性对照。
80.图5为实施例5的西番莲果园样品可视化检测结果。其中，1-20：西番莲样品；21：阴性对照；22：空白对照。
具体实施方式
81.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
82.下述实施例中的rm反应缓冲液、bst dna聚合酶、amv逆转录酶和荧光染料试剂均为日本荣研公司的产品，其中，rm反应缓冲液、bst dna聚合酶、amv逆转录酶货号为slp244，荧光染料试剂货号为slp221。
83.实施例1、用于检测多种西番莲病毒的多重lamp引物组及试剂盒
84.一、用于检测多种西番莲病毒的多重lamp引物组
85.本发明根据西番莲上已报道的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒基因组序列，选择特异性靶标片段，分别设计了不同的lamp引物组，具体序列如表1所示。经过反复设计、测试和优化，最终筛选出了用于检测或辅助检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的成套引物组。
86.本发明的用于检测或辅助检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的成套lamp引物组由检测或辅助检测东亚西番莲病毒的引物组、检测或辅助检测夜来香花叶病毒的引物组和检测或辅助检测黄瓜花叶病毒的引物组组成，其中，检测或辅助检测东亚西番莲病毒的lamp引物组由eapv-f3、eapv-b3、eapv-fip和eapv-bip组成；检测或辅助检测夜来香花叶病毒的lamp引物组由temv-f3、temv-b3、temv-fip和temv-bip组成；检测或辅助检测黄瓜花叶病毒的lamp引物组由cmv-f3、cmv-b3、cmv-fip和cmv-bip组成。
87.表1、引物序列
88.ddh2o溶解。
97.2、配制反转录-环介导等温扩增反应体系
98.反应体系的总体积为25μl，包括待测样品的总rna 2μl，2
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rm反应缓冲液12.5μl，酶溶液(bst dna聚合酶、amv逆转录酶的混合溶液)1μl，eapv-f3(10μm)0.25μl，eapv-b3(10μm)0.25μl，eapv-fip(40μm)0.5μl，eapv-bip(40μm)0.5μl，temv-f3(5μm)0.5μl，temv-b3(5μm)0.5μl，temv-fip(40μm)0.5μl，temv-bip(40μm)0.5μl，cmv-f3(5μm)0.5μl，cmv-b3(5μm)0.5μl，cmv-fip(40μm)0.5μl，cmv-bip(40μm)0.5μl，fd(荧光染料试剂)1μl，补rnase-free ddh2o至25μl。同时以rnase-free ddh2o作为空白对照。其中，eapv-f3、eapv-b3、eapv-fip、eapv-bip、temv-f3、temv-b3、temv-fip、temv-bip、cmv-f3、cmv-b3、cmv-fip和cmv-bip在反应体系中的终浓度分别为0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm、0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm、0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm。
99.3、反应
100.将步骤1配制的反转录-环介导等温扩增反应体系进行反应，反应程序为63℃反应60min，80℃灭活5min，结束反应。
101.4、结果判定
102.反应结束后，根据反应体系的颜色变化来判定检测结果：若反应体系呈绿色为阳性反应，若反应体系呈橙色为阴性反应。结果表明：携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品的检测结果为阳性，反应体系呈绿色，而阴性对照、空白对照的检测结果均为阴性，反应体系均呈橙色(图1a)。实时浊度检测系统监测的扩增曲线和反应体系的颜色变化相符，携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品的检测结果为阳性，出现扩增曲线，而阴性对照、空白对照的检测结果均为阴性，均未出现扩增曲线(图1b)。
103.实施例3：多重lamp试剂盒的特异性测定
104.待测样品：编号1-13。
105.编号1：携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品。
106.编号2：携带东亚西番莲病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品。
107.编号3：携带夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品。
108.编号4：携带东亚西番莲病毒和夜来香花叶病毒的西番莲样品。
109.编号5：携带东亚西番莲病毒的西番莲样品。
110.编号6：携带夜来香花叶病毒的西番莲样品。
111.编号7：携带黄瓜花叶病毒的西番莲样品。
112.编号8：携带西番莲潜隐病毒(passiflora latent virus，plv)的西番莲样品。
113.编号9：携带木槿潜隐皮尔斯堡病毒(hibiscus latent fort pierce virus，hlfpv)的西番莲样品。
114.编号10：携带芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus，tumv)的西番莲样品。
115.编号11：携带西番莲重型斑驳相关病毒(passion fruit severe mottle-associated virus，pfsmoav)的西番莲样品。
116.编号12(阴性对照)：不携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的西番莲样品。
117.编号13(空白对照)：rnase-free ddh2o。
118.采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1-3。反应结束后，根据反应体系的颜色变化来判定检测结果，若反应体系呈绿色为阳性反应，若反应体系呈橙色为阴性反应。
119.结果如图2所示。由图2可知，携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒三种病毒任一种或任二种或任三种的西番莲样品的检测结果均为阳性，反应体系均呈绿色，而携带西番莲潜隐病毒的西番莲样品、携带木槿潜隐皮尔斯堡病毒的西番莲样品、携带芜菁花叶病毒的西番莲样品、携带西番莲重型斑驳相关病毒的西番莲样品、阴性对照和空白对照的检测结果均为阴性，反应体系均呈橙色(图2a)。实时浊度检测系统监测的扩增曲线和反应体系的颜色变化相符，携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒三种病毒任一种或任二种或三种的西番莲样品的检测结果均为阳性，均出现扩增曲线，而携带西番莲潜隐病毒的西番莲样品、携带木槿潜隐皮尔斯堡病毒的西番莲样品、携带芜菁花叶病毒的西番莲样品、携带西番莲重型斑驳相关病毒的西番莲样品、阴性对照和空白对照的检测结果均为阴性，均未出现扩增曲线(图2b)。
120.实施例4、多重lamp试剂盒的灵敏度测定
121.待测样品：将东亚西番莲病毒rna、夜来香花叶病毒rna和黄瓜花叶病毒rna等量混合，得到浓度为145ng/μl的总rna样品，然后将总rna样品按10倍梯度进行稀释，分别得到稀释至10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
和10-7
倍的rna样品。
122.采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1-3。同时以采用单一引物的一步rt-pcr方法检测各个病毒作为对照。分别采用正向引物eapv-f和反向引物eapv-r对东亚西番莲病毒进行检测，采用正向引物temv-f和反向引物temv-r对夜来香花叶病毒进行检测，采用正向引物cmv-f和反向引物cmv-r对黄瓜花叶病毒进行检测。一步rt-pcr方法反应体系的总体积为25μl，包括2
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one step mix(dye plus)12.5μl，one step enzyme mix 1.25μl，各病毒正向引物(10μm)1μl，各病毒反向引物(10μm)1μl，rna模板2μl，rnase-free ddh2o 7.25μl。一步rt-pcr方法的反应程序如下：50℃反应30min后94℃预变性3min，94℃变性30s，退火温度(东亚西番莲病毒：53℃；夜来香花叶病毒：48℃；黄瓜花叶病毒：52℃)退火30s、72℃延伸1min，共35个循环，最后一轮循环后72℃延伸7min。一步rt-pcr所使用的引物序列如表2所示。
123.表2、一步rt-pcr引物序列
[0124][0125]
结果如图3所示。由图3可知，本发明方法最低可以检测稀释至10-3
倍的总rna样品，反应体系呈绿色，实时浊度检测系统仍能监测到扩增曲线，而东亚西番莲病毒、夜来香花叶
病毒和黄瓜花叶病毒一步rt-pcr的检测灵敏度也均为最低可以检测稀释至10-3
倍的总rna样品(即检测灵敏度为145
×
10-3
ng/μl总rna)，分别能扩增预期大小的目的片段。本发明方法的检测灵敏度与一步rt-pcr的检测灵敏度相当，说明本发明方法具有较高的检测灵敏度，非常适合西番莲植株上病毒的早期检测。
[0126]
实施例5、西番莲果园样品的实际检测
[0127]
待测样品：采集自福建省福州市、厦门市、漳州市、泉州市、龙岩市等地区的西番莲果园的20份西番莲样品，分别记作编号1-20。
[0128]
采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1-3。同时以采用单一引物的一步rt-pcr方法检测各个病毒作为对照，分别采用正向引物eapv-f和反向引物eapv-r对东亚西番莲病毒进行检测，采用正向引物temv-f和反向引物temv-r对夜来香花叶病毒进行检测，采用正向引物cmv-f和反向引物cmv-r对黄瓜花叶病毒进行检测，具体步骤参照实施例4中一步rt-pcr方法的步骤。
[0129]
结果见图5和表3。结果表明：采用本发明方法对20份西番莲样品中的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测结果为16份阳性(编号为1-7、9、11、13-16、18-20)、4份阴性(编号为8、10、12和17)，阳性检出率为80％。采用一步rt-pcr对20份西番莲样品中的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测结果为16份阳性(编号为1-7、9、11、13-16、18-20)、4份阴性(编号为8、10、12和17)，阳性检出率为80％。由图5和表3可知，本发明方法的检测结果与一步rt-pcr方法的检测结果完全一致，说明本发明方法的检测结果准确可靠，可有效用于西番莲样品上东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的同时快速检测。
[0130]
表3、多重lamp试剂盒和一步rt-pcr检测结果
[0131][0132]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.用于检测或辅助检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的成套引物组，所述成套引物组由检测或辅助检测东亚西番莲病毒的引物组、检测或辅助检测夜来香花叶病毒的引物组和检测或辅助检测黄瓜花叶病毒的引物组组成；所述检测或辅助检测东亚西番莲病毒的引物组由eapv-f3、eapv-b3、eapv-fip和eapv-bip组成；所述检测或辅助检测夜来香花叶病毒的引物组由temv-f3、temv-b3、temv-fip和temv-bip组成；所述检测或辅助检测黄瓜花叶病毒的引物组由cmv-f3、cmv-b3、cmv-fip和cmv-bip组成；所述eapv-f3为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链dna分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；所述eapv-b3为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链dna分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子；所述eapv-fip为如下a5)或a6)：a5)序列表中序列3所示的单链dna分子；a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；所述eapv-bip为如下a7)或a8)：a7)序列表中序列4所示的单链dna分子；a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；所述temv-f3为如下a9)或a10)：a9)序列表中序列5所示的单链dna分子；a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链dna分子；所述temv-b3为如下a11)或a12)：a11)序列表中序列6所示的单链dna分子；a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链dna分子；所述temv-fip为如下a13)或a14)：a13)序列表中序列7所示的单链dna分子；a14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链dna分子；所述temv-bip为如下a15)或a16)：a15)序列表中序列8所示的单链dna分子；
a16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链dna分子；所述cmv-f3为如下a17)或a18)：a17)序列表中序列9所示的单链dna分子；a18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链dna分子；所述cmv-b3为如下a19)或a20)：a19)序列表中序列10所示的单链dna分子；a20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的单链dna分子；所述cmv-fip为如下a21)或a22)：a21)序列表中序列11所示的单链dna分子；a22)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的单链dna分子；所述cmv-bip为如下a23)或a24)：a23)序列表中序列12所示的单链dna分子；a24)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的单链dna分子。2.根据权利要求1所述的成套引物组，其特征在于：所述检测或辅助检测东亚西番莲病毒的引物组中，所述eapv-f3、所述eapvb3、所述eapv-fip和所述eapv-bip的摩尔比为1:1:8:8。3.根据权利要求1或2所述的成套引物组，其特征在于：所述检测或辅助检测夜来香花叶病毒的引物组中，所述temv-f3、所述temv-b3、所述temv-fip和所述temv-bip的摩尔比为1:1:8:8。4.根据权利要求1-3任一所述的成套引物组，其特征在于：所述检测或辅助检测黄瓜花叶病毒的引物组中，所述cmv-f3、所述cmv-b3、所述cmv-fip和所述cmv-bip的摩尔比为1:1:8:8。5.用于检测或辅助检测东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4任一所述的成套引物组。6.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下组分中的至少一种：rm反应缓冲液、bst dna聚合酶、amv逆转录酶、荧光染料试剂、阴性对照和阳性对照。7.权利要求1-4任一所述的成套引物组或权利要求5或6所述的试剂盒在如下b1)-b6)任一种中的应用：b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒；b2)检测或辅助检测待测样品是否携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒；b3)区分或辅助区分东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒与其它西番莲病毒；
b4)制备鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒的产品；b5)制备检测或辅助检测待测样品是否携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒的产品；b6)制备区分或辅助区分东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒与其它西番莲病毒的产品。8.如下c1)-c3)任一种方法：c1)一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒的方法，包括如下步骤：提取待测病毒的rna，以待测病毒rna为模板，采用权利要求1所述的成套引物组进行反转录-环介导等温扩增反应；反应结束后通过观察反应体系颜色判断待测病毒是否为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒：若反应体系呈绿色，则待测病毒为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒；若反应体系呈橙色，则待测病毒不为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒；c2)一种检测或辅助检测待测样品是否携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒的方法，包括如下步骤：提取待测样品的rna，以待测样品rna为模板，采用权利要求1所述的成套引物组进行反转录-环介导等温扩增反应；反应结束后通过观察反应体系颜色判断待测样品是否携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒：若反应体系呈绿色，则待测样品携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒；若反应体系呈橙色，则待测样品不携带东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和/或黄瓜花叶病毒；c3)一种区分或辅助区分东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒与其它西番莲病毒的方法，包括如下步骤：提取待测病毒的rna，以待测病毒rna为模板，采用权利要求1所述的成套引物组进行反转录-环介导等温扩增反应；反应结束后通过观察反应体系颜色判断待测病毒为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒还是其它西番莲病毒：若反应体系呈绿色，则待测病毒为东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒或黄瓜花叶病毒；若反应体系呈橙色，则待测病毒为其它西番莲病毒。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述反转录-环介导等温扩增反应的条件为61～65℃反应45～60min，80℃灭活5min。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述成套引物组中的eapv-f3、eapv-b3、eapv-fip、eapv-bip、temv-f3、temv-b3、temv-fip、temv-bip、cmv-f3、cmv-b3、cmv-fip和cmv-bip在反应体系中的终浓度分别为0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm、0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm、0.1μm、0.1μm、0.8μm、0.8μm。

技术总结
本发明公开了一种用于检测多种西番莲病毒的多重LAMP引物组、试剂盒及其应用。所述成套引物组由检测东亚西番莲病毒的引物组、检测夜来香花叶病毒的引物组和检测黄瓜花叶病毒的引物组组成；具体由序列1-序列12所示的DNA分子组成。本发明利用多重LAMP检测技术，在同一体系和反应条件下实现了西番莲上东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的同时检测，不仅具有特异性强、灵敏度高、准确性好的优点，而且操作简便、结果直观，显著提高了检测效率，可以高效地用于西番莲上东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测，尤其适用于现场诊断，在农业生产和口岸植物检疫上具有广泛的应用前景。上具有广泛的应用前景。


技术研发人员：谢丽雪 陈细红 沈建国 廖富荣 高芳銮 张立杰 张小艳 李韬
受保护的技术使用者：福州海关技术中心
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/20