一种预测胶质瘤预后的标志物及其应用

1.本发明涉及一种预测胶质瘤预后的标志物及其应用，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.胶质瘤(glioma)是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。由于其高度异质性，分子特征差别较大，胶质瘤的治疗效果差异显著。准确的分类和预后评估是选择治疗措施的关键。随着对胶质瘤分子特征研究的深入，who提出的最新分型综合了肿瘤的组织病理学特征、恶性程度分级和分子信息，但由于分子诊断水平的区域性差异，此分型在临床实施中存在挑战。因此，探索出具有临床价值的分子分型对胶质瘤患者的预后评估进行指导迫在眉睫。
3.泛凋亡(panoptosis)是细胞程序性死亡(pcd)途径之一，它整合多种pcd通路的组成成分，受泛凋亡复合物(panoptosome)的调控，是一种独特的先天性免疫介导的炎性通路。已有大量研究表明在机体受到细菌、病毒等病原体感染时，泛凋亡途径发挥重要作用，诱导炎症细胞死亡。也有越来越多的证据证实，泛凋亡在肿瘤中同样起着重要作用。如果其他程序性细胞死亡途径被抑制或者产生突变，泛凋亡可以通过激活免疫系统，增强抗肿瘤免疫，杀死肿瘤细胞，克服治疗过程中耐药性的问题。
4.目前，国内外研究发现一些肿瘤的分子标志物的表达水平，例如pten基因，可以作为一项独立的因子来影响胶质瘤患者的预后生存时间，但是像这样能够独立影响胶质瘤患者预后生存时间的分子标志物还比较少，因此需要发现更多的影响胶质瘤患者预后生存时间的分子标志物。尤其综合预后分类与经典分子生物标志物还需要进一步研究。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种预测胶质瘤预后的标志物及其应用。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种预测胶质瘤预后的标志物，所述标志物由基因meox2、ibsp、gfra1、nog和ephb1组成。
8.本发明中预测胶质瘤预后的标志物的应用采用如下技术方案：如上所述的标志物在预测胶质瘤预后中的应用；所述应用包括但不限于评价或预测预后情况、预测生存率、构建预测胶质瘤预后风险的模型、构建预测胶质瘤生存率的模型、制备用于预测胶质瘤预后风险的检测试剂或装置、制备预测胶质瘤生存率的检测试剂或装置中的任意一种或几种的组合。
9.一种预测胶质瘤预后的试剂盒，所述试剂盒包含有上述标志物的检测试剂和一个风险模型，所述风险模型包括风险评分计算公式，所述风险评分计算公式如下：风险评分＝(0.170008438280127
×
meox2的表达水平)+(0.196870811688214
×
ibsp的表达水平)+(-0.431404278334841
×
gfra1的表达水平)+(-0.34193718212311
×
nog的表达水平)+(0.292158077431546
×
ephb1的表达水平)。所述表达水平指的是：是指特定的mrna序列从
其基因组基因座被转录的程度，即mrna在一个或多个被分析血清中的浓度。
10.根据本发明优选的，所述检测试剂包括sybr green试剂、ddh2o和风险模型中5种基因的引物。
11.进一步优选的，所述引物序列如下：
12.meox2-f：5
’‑
gcgatacgagatagcagtgaatc-3’；
13.meox2-r：5
’‑
gctgtccaccctttaccctc-3’；
14.ibsp-f：5
’‑
ccccaccttttgggaaaacca-3’；
15.ibsp-r：5
’‑
tccccgttctcactttcatagat-3’；
16.gfra1-f：5
’‑
ccaagcacagctacggaatg-3’；
17.gfra1-r：5
’‑
caggcacgatggtctgtcg-3’；
18.nog-f：5
’‑
ccatgccgagcgagatcaaa-3’；
19.nog-r：5
’‑
tcggaaatgatggggtactgg-3；
20.ephb1-f：5
’‑
atgcgcttcactgtgagagac-3’；
21.ephb1-r：5
’‑
attccgagtaagaggcccaaa-3’。
22.一种使用上述试剂盒预测胶质瘤预后的方法，所述方法的步骤如下：
23.(1)检测胶质瘤患者样本中基因meox2、ibsp、gfra1、nog和ephb1的表达水平；
24.(2)将步骤(1)所得的表达水平代入风险评分计算公式中，计算出风险评分；当风险评分高于cut-off值时，该胶质瘤患者属于高风险组，提示该胶质瘤患者预后不良，生存期短：当风险评分低于cut-off值时，该胶质瘤患者属于低风险组，提示该胶质瘤患者预后良好，生存期长。
25.进一步优选的，步骤(1)中，所述样本包括但不限于组织、体液。在本发明的具体实施方案中，所述样本是体液，体液具体是血液。
26.进一步优选的，步骤(2)中，所述cut-off值是0.3658584，该值是geo数据集的中位数。
27.一种胶质瘤生存率预测模型，所述预测模型根据上述风险模型得出的风险评分结合年龄和患者分期构建列线图得到。
28.进一步优选的，所述预测模型可以预测患有胶质瘤后1年、3年、5年的生存率。
29.本发明上述5个基因的表达水平的测定遵循本领域熟知的已建立的标准程序(sambrook，j.et al.(1989)molecular cloning：a laboratory manual.2nd ed.，cold springharbor laboratory press，cold spring harbor，ny；ausubel，f.m.et al.(2001)current protocolsin molecular biology.wiley&sons，hoboken，nj)。所述的测定可以在rna水平进行，例如使用mrna的探针进行northern印记分析；或者在rna逆转录后检测cdna水平，例如通过实时荧光定量pcr技术。
30.本发明中公开的meox2、ibsp、gfra1、nog和ephb1的序列均为已公开序列，储存于“primerbank”网站(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)中。
31.本发明具有以下有益效果：
32.1、本发明通过生物信息学的技术找到与胶质瘤进展相关标志物meox2、ibsp、gfra1、nog和ephb1，然后根据这5个基因构建的风险模型，进而获得风险评分，通过风险评分能预测胶质瘤的预后；并且进一步结合年龄、患者分期构建胶质瘤生存率预测模型，能够
有效预测胶质瘤患者1年，3年，5年的生存率。
33.2、本发明提出一种由5个基因作为生物标志物构成的预测胶质瘤患者的预后的模型。本发明为分析胶质瘤患者的预后评估提供了可靠的方法。
附图说明：
34.图1为数据被分成两类时，cgga队列胶质瘤患者的一致性评分矩阵。
35.图2为应用nbclust r软件包得到的26项指标所支持的聚类数结果。
36.图3为来自tcga-lgg和tcga-gbm队列的871例胶质瘤患者的突变状态，每个瀑布图代表一个泛凋亡小体相关基因的突变信息；
37.图中，上方的条形图表示突变负荷。右侧的数字表示突变频率。
38.图4为tcga-lgg和tcga-gbm队列中泛凋亡小体相关基因的拷贝数变异(cnvs)频率，不同类型变异的比例用柱状图的高度表示。
39.图5为cgga队列中聚类与年龄、组织学分型、idh突变状态、1p19q共缺失状态和mgmt启动子甲基化状态的多变量cox回归分析结果。
40.图6分别为cgga、tcga和geo队列中两个泛凋亡聚类之间基于gsva的go富集分析的热图差异(student’s t检验，****p《0.0001)；
41.图中，a为cgga队列分析，b为tcga队列分析，c为geo队列分析。
42.图7为geo队列中的基因集富集分析(gsea)结果。
43.图8为444个在单变量cox回归中有统计学意义的差异表达基因(degs)的lasso回归分析结果。
44.图9为geo队列中347例胶质瘤患者的高、低泛凋亡评分亚组的os曲线，截断点为0.3658584。(log-rank检验，p《0.0001)
45.图10为cgga队列中626例胶质瘤患者的不同泛凋亡评分亚组的os曲线，截断点为0.3658584。(log-rank检验，p《0.0001)
46.图11为tcga队列的663例胶质瘤患者中不同泛凋亡评分亚组的os曲线，截断点为0.3658584。(log-rank检验，p《0.0001)
47.图12为tcga队列的663例胶质瘤患者中不同泛凋亡评分亚组的pfs曲线，截断点为0.3658584。(log-rank检验，p《0.0001)
48.图13为在cgga队列中比较泛凋亡评分和其他三种先前开发的胶质瘤预后模型的时间依赖性roc曲线，以评估和比较它们预测1年、3年和5年生存率的准确性。
49.图14为cgga队列中泛凋亡评分与年龄、who分级、idh突变状态、1p19q共缺失状态和mgmt启动子甲基化状态的多变量cox回归分析结果。
50.图15为在cgga队列中应用列线图预测1、3和5年os的校准曲线。其中，x轴代表列线图预测的生存概率，y轴代表实际生存率。
具体实施方式：
51.下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
52.以下实施例中所涉及consensusclusterplus r软件包、nbclust r软件包、limma软件包、survival r软件包和rms r软件包均为现有技术，来源于http://www.bioconductor.org/，加载后在r软件中运行。
53.实施例1、泛凋亡小体相关基因的一致性聚类分析
54.1、在先前的研究中，christgen等指出存在一种细胞死亡复合体，可以作为分子框架启动焦亡、凋亡和坏死性凋亡过程，并命名其为泛凋亡小体(panoptosome)，最初发现在细菌和病毒感染激发的泛凋亡过程中，ripk1、ripk3、casp8、nlrp3、asc和fadd相互作用组成泛凋亡小体。此后，place等指出在对病毒感染的应答中，zbp1、caspase-1、caspase-11、ripk3和caspase-8同样是泛凋亡的关键组分。babamale等阐述了nlrp3炎症小体在微生物和寄生虫感染所激发的泛凋亡中的关键作用，并给出了一个泛凋亡小体模型，包含nlrp3、zbp1、asc、pro-caspase-1、caspase-6、caspase-8、fadd、cflip以及ripk3。继而sundaram等指出，除nlrp3以外，nlrp1、nlrc4、nlrp6、nlrp9、aim2和pyrin同样可作为传感器参与构建炎症小体，并特别强调了nlrc4炎症小体可能在泛凋亡中发挥重要作用。sharma等描述了这些炎症小体在结直肠癌中的作用并提出炎症小体也是泛凋亡小体的必要组分。基于以上研究，本技术发明人认为泛凋亡小体相关基因的表达水平很有可能与胶质瘤预后有关。
55.从基因表达综合数据库(geo，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载胶质瘤数据集gse16011、gse43378和gse43289的转录组芯片原始数据和临床数据，删去重复及临床信息不全的样本，经秩转换标化后合并为geo队列(n＝347)；从基因组数据共享数据门户(gdc，https://portal.gdc.cancer.gov/)下载癌症基因组图谱数据库(tcga)中的胶质瘤数据集tcga-lgg和tcga-gbm的rna测序数据(count格式)及相应临床信息，除去重复样本，并筛选出生存信息完整的原发性胶质瘤样本，将count格式转换为tpm格式，经秩转换标化后合并为tcga队列(n＝663)；从中国胶质瘤基因组图谱(cgga，http://www.cgga.org.cn/)下载胶质瘤数据集cgga-325和cgga-693的mrna测序数据(fpkm格式)及相应临床信息，筛选出生存信息完整的原发性胶质瘤样本，将fpkm格式转换为tpm格式，经秩转换标化后合并为cgga队列(n＝626)。取geo、tcga和cgga三个队列数据集的基因交集，共15097个基因纳入后续分析。
56.采用k-means方法，在geo、tcga和cgga三个队列数据集中分别应用一致性聚类方法来区分不同的泛凋亡小体相关基因表达模式。所述一致性聚类应用consensusclusterplusr软件包来完成，当k＝2时，所得结果矩阵如图1所示。最佳聚类数的确定应用nbclust r软件包来完成，分析结果如图2所示。
57.由图1可知，若两个样本在不同的迭代中有更高的一致性得分，则它们将被倾向于分组到同一聚类中。由图2可知，应用nbclust r软件包得到的26项指标所支持的聚类数结果中最佳聚类数为2。
58.从gdc下载了tcga-lgg和tcga-gbm数据集的单核苷酸变异(snv)和拷贝数变异(cnv)数据，使用"maftools"r软件包绘制瀑布图来呈现突变状态，并使用gistic2.0分析软件应用于cnv分析，结果如图3和图4所示。
59.由图3和图4可知，在基因水平，胶质瘤患者的17个基因在基因突变情况和拷贝数的变化有广泛性改变。在分子水平，利用主成分分析(pca)可以很好地区分胶质瘤的肿瘤样本和正常样本。
60.2、在此基础上，使用无监督聚类的方法，将患者划分为两个分子亚型。随后将聚类、年龄、组织学分型、idh突变、1p/19q共缺失、mgmt启动子甲基化等特征纳入多因素cox回归分析，多因素cox回归分析应用survival r软件包实现，结果如图5所示。
61.由图5可知，聚类是影响胶质瘤患者预后的独立因素，证实了分子亚型有独立预后效能。
62.3、分别应用gsva和clusterprofiler r软件包对两个分子亚型进行gsva富集分析和gsea富集分析，探索亚型之间富集通路的差异。所述gsva富集分析通过“gsva”r包实现对基因组学进行分析、gsea富集分析通过“clusterprofiler”r包实现，结果分别如图6和图7所示。
63.图6和图7的gsva富集分析和gsea富集分析结果反映了胶质瘤间的异质性和生物学行为的不同，说明泛凋亡小体相关基因很有可能影响胶质瘤两个亚型的预后。并且两个胶质瘤分子亚型在免疫细胞浸润和免疫抑制检查点分子表达水平的不同，也为预测胶质瘤免疫治疗效果和胶质瘤预后生存情况提供了潜在理论支持。
64.实施例2、胶质瘤相关基因数据处理
65.1、差异表达基因的获得
66.以geo队列(n＝347)为训练数据集，应用limma r软件包获取不同聚类间的差异表达基因(differentially expressed genes，degs)，得到450个差异表达基因，纳入单变量cox回归分析。
67.所述degs被定义为校正p值《0.05以及log2(fc)的绝对值大于log2(1.5)。
68.2、单变量cox回归分析
69.应用survival r软件包对以上450个差异表达基因进行单变量cox回归分析，以p《0.05作为统计界值，得到444个基因，纳入lasso回归分析。
70.3、lasso回归分析
71.应用glmnt r软件包对以上444个基因进行lasso回归分析，并采用lasso回归获得的lamda.min作为截断点来选择最佳模型，最终得到18个与胶质瘤预后有关的泛凋亡小体相关基因(非零系数)，纳入多因素cox回归分析，结果如图8所示。
72.实施例3、胶质瘤预后风险模型的构建与评估
73.1、多变量cox回归分析及风险模型的构建
74.应用survival r软件包对实施例2得到的18个基因进行多因素cox回归分析，以p《0.05作为统计界值，得到5个用于预测胶质瘤预后的泛凋亡小体相关基因，分别是基因meox2、ibsp、gfra1、nog和ephb1，然后根据这5个基因和cox的回归系数(表1)进行计算，得到预测胶质瘤预后的风险评分公式：风险评分＝(0.170008438280127
×
meox2的表达水平)+(0.196870811688214
×
ibsp的表达水平)+(-0.431404278334841
×
gfra1的表达水平)+(-0.34193718212311
×
nog的表达水平)+(0.292158077431546
×
ephb1的表达水平)，构建预测胶质瘤预后的风险评分模型。
75.表1
76.genecoefhrwald.testpvalueibsp0.1968708121.2175867332.942087450.003260078gfra1-0.4314042780.64959624-2.5641956780.010341522
meox20.1700084381.1853148532.4801242330.013133661ephb10.2921580771.3393147162.4297657940.015108582nog-0.3419371820.710392829-2.3328519780.019655916
77.以训练数据集风险评分的中位数0.3658584为截断点，将训练集中的患者分为高得分组和低得分组。
78.采用kaplan-meier法进行生存分析，log-rank法检验生存差异，时间依赖受试者工作特征曲线(time-dependent receiver operator characteristic curve，roc)评估风险评分模型。
79.根据风险评分的中位数将胶质瘤患者分为两组，首先对geo数据集的347位胶质瘤患者进行生存分析，结果表明风险评分高的患者总生存时间短于低评分患者(图9)。为了进一步评估模型在胶质瘤中的评估效能，以geo数据集中的中位数0.3658584为截断值(cut off值)，将cgga和tcga数据集中的胶质瘤患者进行分组，并绘制生存曲线，验证了高得分的胶质瘤患者预后更差(图10和图11)。此外，再利用tcga数据集中丰富的临床信息绘制了无进展生存(pfs)曲线，发现风险评分的高得分在胶质瘤的进展和复发中也预示不佳(图12)。
80.2、风险模型的评估
81.目前，已有多种胶质瘤的模型被报道可以评估胶质瘤患者的预后，如steap家族相关的模型、焦亡相关的风险评分、基于m6a调节因子的胶质瘤预后模型等。为了对比申请人构建的风险模型与已报道模型的评估效能，利用geo、cgga、tcga这3个数据集中的胶质瘤患者的数据信息，根据本发明风险模型和其余三种模型绘制时间依赖性受试者工作特征曲线(roc)，对比不同模型对于胶质瘤患者1、3、5年的预测情况的评估效能。根据曲线下面积，发现本发明构建的风险模型与这3种已报道的胶质瘤预后模型相比有更好的评估效果。
82.(图13)
83.3、风险评分是胶质瘤预后的独立预测因子
84.多种临床因素对胶质瘤的预后具有显著影响，例如年龄、who分级等。此外，许多分子特征也被证明影响胶质瘤的预后，如idh突变，1p/19q共缺失、mgmt启动子甲基化等。本发明将患者的年龄与胶质瘤的who分级和idh突变、1p/19q共缺失、mgmt启动子甲基化同时纳入多变量cox回归，分析结果如图14所示。
85.由图14可知，当与多变量分析中的所有这些预后因素结合时，模型得分仍然是影响胶质瘤预后的因素，并独立于患者的临床特征及分子特征。
86.实施例4、预测胶质瘤预后的试剂盒
87.一种预测胶质瘤预后的试剂盒，包含有实施例3所述标志物、sybr green试剂、ddh2o和风险模型中5种基因的引物和一个风险模型，所述风险模型包括风险评分计算公式，所述风险评分计算公式如下：风险评分＝(0.170008438280127
×
meox2的表达水平)+(0.196870811688214
×
ibsp的表达水平)+(-0.431404278334841
×
gfra1的表达水平)+(-0.34193718212311
×
nog的表达水平)+(0.292158077431546
×
ephb1的表达水平)。
88.该试剂盒通过实时荧光定量pcr检测标志物的表达水平，pcr反应体系为：ultra sybrgreen mixture 10μl、forward primer 0.4μl、reverse primer 0.4μl、ddh2o 7.2μl、cdna 2μl，总体系20μl。
89.pcr反应程序为：第一阶段：95℃10min；第二阶段：95℃15s
→
60℃60s，重复40个循
环；第三阶段：溶解曲线采集95℃10s，65℃60s，97℃1s。
90.所使用的引物如表2所示。
91.表2
[0092][0093][0094]
实施例5、列线图的构建与评价
[0095]
应用survival r软件包和rms r软件包构建根据风险评分、年龄和患者分期建立列线图和校准图，然后通过列线图来预测os。列线图的效能应用c-index来评估，c-index的范围为0.5～1.0，越接近1.0，则预测效能越精确；通过将列线图的预测概率与实际概率相比较，得到列线图1，3，5年的calibration校验曲线，一个理想的校验曲线是一个45
°
线。
[0096]
具体是：通过将胶质瘤患者的cdna使用实施例4所述的预测胶质瘤预后的试剂盒进行实时荧光定量pcr，检测胶质瘤患者样本中基因meox2、ibsp、gfra1、nog和ephb1的表达水平，然后将检测结果带入风险评分计算公式，计算风险评分，匹配构建的列线图的相应分数，配合患者临床及分子特征得到患者最终的预后得分，在列线图中患者对应的1年、3年和5年的生存率。以cgga队列数据集得到的校准曲线显示出此列线图具有较为准确的预测效能(图15)。
[0097]
综合所述，本发明提供的预测胶质瘤预后的标志物，以及利用该标志物制备的预测胶质瘤预后的试剂盒能够较为准确地预测胶质瘤患者的预后，具有很好的临床应用前景。

技术特征：
1.一种预测胶质瘤预后的标志物，其特征在于，所述标志物由基因meox2、ibsp、gfra1、nog和ephb1组成。2.权利要求1所述预测胶质瘤预后的标志物的应用，其特征在于，所述应用包括但不限于评价或预测预后情况、预测生存率、构建预测胶质瘤预后风险的模型、构建预测胶质瘤生存率的模型、制备用于预测胶质瘤预后风险的检测试剂或装置、制备预测胶质瘤生存率的检测试剂或装置中的任意一种或几种的组合。3.一种预测胶质瘤预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1所述的标志物的检测试剂和一个风险模型，所述风险模型包括风险评分计算公式，所述风险评分计算公式如下：风险评分＝(0.170008438280127
×
meox2的表达水平)+(0.196870811688214
×
ibsp的表达水平)+(-0.431404278334841
×
gfra1的表达水平)+(-0.34193718212311
×
nog的表达水平)+(0.292158077431546
×
ephb1的表达水平)。4.如权利要求3所述的预测胶质瘤预后的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括sybr green试剂、ddh2o和权利要求3所述风险模型中5种基因的引物。5.如权利要求4所述的预测胶质瘤预后的试剂盒，其特征在于，所述引物序列如下：meox2-f：5
’‑
gcgatacgagatagcagtgaatc-3’；meox2-r：5
’‑
gctgtccaccctttaccctc-3’；ibsp-f：5
’‑
ccccaccttttgggaaaacca-3’；ibsp-r：5
’‑
tccccgttctcactttcatagat-3’；gfra1-f：5
’‑
ccaagcacagctacggaatg-3’；gfra1-r：5
’‑
caggcacgatggtctgtcg-3’；nog-f：5
’‑
ccatgccgagcgagatcaaa-3’；nog-r：5
’‑
tcggaaatgatggggtactgg-3；ephb1-f：5
’‑
atgcgcttcactgtgagagac-3’；ephb1-r：5
’‑
attccgagtaagaggcccaaa-3’。6.一种使用权利要求5所述试剂盒预测胶质瘤预后的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：(1)检测胶质瘤患者样本中基因meox2、ibsp、gfra1、nog和ephb1的表达水平；(2)将步骤(1)所得的表达水平代入风险评分计算公式中，计算出风险评分；当风险评分高于cut-off值时，该胶质瘤患者属于高风险组，提示该胶质瘤患者预后不良，生存期短：当风险评分低于cut-off值时，该胶质瘤患者属于低风险组，提示该胶质瘤患者预后良好，生存期长。7.如权利要求6所述的预测胶质瘤预后的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样本为组织或体液。8.如权利要求6所述的预测胶质瘤预后的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述cut-off值是0.3658584。9.一种胶质瘤生存率预测模型，其特征在于，所述预测模型根据权利要求3所述风险模型得出的风险评分结合年龄和患者分期构建列线图得到。10.如权利要求9所述的预测模型，其特征在于，所述预测模型可以预测患有胶质瘤后1年、3年、5年的生存率。

技术总结
本发明涉及一种预测胶质瘤预后的标志物及其应用。所述标志物由基因MEOX2、IBSP、GFRA1、NOG和EPHB1组成。本发明还公开了预测胶质瘤预后的试剂盒，以及一种预测胶质瘤预后的方法。本发明通过生物信息学的技术找到与胶质瘤进展相关标志物MEOX2、IBSP、GFRA1、NOG和EPHB1，然后根据这5个基因构建的风险模型，进而获得风险评分，通过风险评分能预测胶质瘤的预后；并且进一步结合年龄、患者分期构建胶质瘤生存率预测模型，能够有效预测胶质瘤患者1年，3年，5年的生存率，为分析胶质瘤患者的预后评估提供了可靠的方法。评估提供了可靠的方法。


技术研发人员：林晓英 付悦 宋婧婧 徐泽昆 范清晨 孙衍飞
受保护的技术使用者：山东大学第二医院
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/20