一种植物源生根剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及生根剂技术领域，具体涉及一种植物源生根剂及其制备方法。


背景技术：

2.植物的生长发育进程通常受植物内源激素的调控，同时也受到各种不良环境条件的制约，往往导致生长速率和产量的下降，而植物各组织和部位的代谢功能下调是其中的主要诱因之一。植物生长调节剂是天然源的化学品，也称作植物激素(例如生长素、赤霉素、细胞激肽类、乙烯、油菜素内酯或脱落酸)、脂寡糖、肽、脂肪酸衍生物和寡聚糖素，或它们可以是合成制得的化合物(天然产生植物生长激素的衍生生物、乙烯利)。植物生长调节剂是调节植物生长发育的微量化学物质，植物生长发育需要水肥营养的供应，同时还受植物生长物质的调节与控制。在低浓下能产生明显示的生理效应，使植物发生强烈的生理生化与形态反应。植物在插条生根，促进抽苔开花，结实，防止脱落，蔬菜疏果，诱导和打破休眠，促进成熟和增强抗逆性等方面，已得到广泛地推广应用。从上个世纪90年代开始，自然源植物生长调节剂的研究开发成为国内研究的热点之一。利用天然植物作为提取植物生长调节剂的原料，实现农业的可持续发展具有重要意义。
3.生根剂作为调节植物生长发育所需要的物质，主要成分有萘乙酸、赤霉素、吲哚乙酸等。市场销售的生根剂有水剂、粉剂两种。栽树浇灌生根剂，可加快树木产生新根，促进树木生长。市面上的生根剂主要可以分为以下三大类：常见的生根壮苗剂(吲哚乙酸、萘乙酸钠等的单类化合物或者按照科学配比的上述几种化合物的混合)、生物菌与生根剂混配的复合型生根剂、营养元素与生长促进剂类物质复配的生根剂类(如根块膨等)。
4.中国专利cn110839651b公开了一种毛葡萄生根剂以及毛葡萄扦插育苗方法，该生根剂，包括下列原料组分：萘乙酸150-200mg/l、5-甲基-3-对氯苯基-2-硫代乙内酰脲5-10mg/l、脯氨酸35-50mg/l、竹醋液5-15mg/l和碳酸氢胺50-80mg/l。该葡萄生根剂可有效促进毛葡萄扦插枝条的根系生长，该专利的扦插育苗方法通过将通气通水装置和生根剂结合，进一步有效提升了毛葡萄扦插枝条的生根量以及成活率。
5.中国专利cn110432287b公开了一种微生物生根剂及其制备方法，该生根剂由以下重量份数的原料组分组成：高分子竹纤维1-10份、枯草芽胞杆菌0.1-5份、棕色固氮菌0.1-5份、胶质芽胞杆菌0.1-5份、竹纤维20-200份；该生根剂通过高分子竹纤维提供水分、竹纤维提供碳源、微生物菌提供氮源为植物根际周边的微生物提供了一个稳定的快速生长环境，微生物快速繁殖，其自身代谢产物产生吲哚乙酸、赤霉素、多肽等植物生长激素，促进植物根系生长。
6.但是，以上生根剂还是存在促进生根效果不够显著，成活率和生根率还需要进一步提高。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提出一种植物源生根剂及其制备方法，利于植物的成活和生
根，具有杀菌消毒、调节植物生长，能够达到较好的促生长和生根的效果，对于促进植物的生长和发育，提高抗性也有明显的促进作用，具有广阔的应用前景。
8.本发明的技术方案是这样实现的：
9.本发明提供一种植物源生根剂的制备方法，将柳树皮和柳树枝经过酶解后乙醇提取，过滤，滤渣留用，滤液干燥，得到柳树提取物，将葡萄皮、大豆经过复合酶酶解后，与滤渣混合得到培养基，接种活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液发酵，得到发酵液，加入可溶性银盐和可溶性锌盐，干燥，得到金属盐-发酵物，与柳树提取物和生长素混合均匀，得到植物源生根剂。
10.作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
11.s1.柳树提取物的制备：将柳树皮和柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，加入纤维素酶和果胶酶酶解，灭酶，加入乙醇提取，过滤，滤渣留用，滤液干燥，柳树提取物；
12.s2.酶解：将葡萄皮、大豆经干燥，粉碎，得到粉料，加入水中，加入复合酶酶解，灭酶，得到酶解体系；
13.s3.菌种的活化：将白参菌和枯草芽孢杆菌分别接种至高氏培养基中，活化培养，得到菌种种子液；
14.s4.培养基的制备：将步骤s1中的滤渣、步骤s2中的酶解体系混合均匀，灭菌，得到培养基；
15.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，发酵培养第一时间段，加入增抗因子，发酵培养第二时间段，过滤，得到发酵液；
16.s6.金属盐的络合：将步骤s5中的发酵液中加入可溶性银盐和可溶性锌盐，搅拌混合反应，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物；
17.s7.植物源生根剂的制备：将步骤s1中的柳树提取物、步骤s6中的金属盐-发酵物和生长素混合均匀，得到植物源生根剂。
18.作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述柳树皮和柳树枝的质量比为5-7:2，所述混合粉和水的固液比为1:5-7g/ml，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为3-5:1，所述酶解的条件为50-60℃，酶解2-3h，所述加入乙醇至体系乙醇含量为60-70wt％，所述提取的方法为加热至50-60℃，提取2-3h。
19.作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述葡萄皮、大豆的质量比为5-7：7-10，所述粉料、水和复合酶的质量比为10-12:100:0.5-1，所述酶解的条件为45-55℃，酶解1-2h，所述复合酶选自纤维素酶、果胶酶、
ɑ-淀粉酶、β-淀粉酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶中的至少一种；步骤s3中所述活化培养的条件为37-40℃，50-70r/min，活化培养18-24h，所述菌种种子液的含菌量为10
8-109cfu/ml。
20.作为本发明的进一步改进，所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为3-5:7。
21.作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述滤渣和酶解体系的质量比为5-7:30-50；步骤s5中所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3％和1-2％，所述发酵培养的条件为37-40℃，50-70r/min，所述第一时间段为36-48h，所述第二时间段为
24-36h，所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为3-5:2。
22.作为本发明的进一步改进，步骤s6中所述可溶性银盐选自硝酸银、偏硝酸银中的至少一种，所述可溶性锌盐选自氯化锌、硫酸锌、硝酸锌中的至少一种，所述发酵液、可溶性银盐和可溶性锌盐的质量比为100:5-7:3-5，所述搅拌混合反应的时间为20-30min；步骤s7中所述柳树提取物、金属盐-发酵物和生长素的质量比为10-12:17-22:0.05-0.1，所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为5-7:2-3。
23.作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
24.s1.柳树提取物的制备：将5-7重量份柳树皮和2重量份柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:5-7g/ml，加入纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为3-5:1，所述纤维素酶的加入量为体系总质量的3-5wt％，50-60℃酶解2-3h，紫外线灭酶，加入乙醇至体系乙醇含量为60-70wt％，50-60℃提取2-3h，过滤，滤渣留用，滤液干燥，柳树提取物；
25.s2.酶解：将5-7重量份葡萄皮、7-10重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将10-12重量份粉料加入100重量份水中，加入0.5-1复合酶，45-55℃酶解1-2h，紫外线灭酶，得到酶解体系；
26.所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为3-5:7；
27.s3.菌种的活化：将白参菌和枯草芽孢杆菌分别接种至高氏培养基中，37-40℃，50-70r/min，活化培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为10
8-109cfu/ml；
28.s4.培养基的制备：将5-7重量份步骤s1中的滤渣、30-50重量份步骤s2中的酶解体系混合均匀，紫外线灭菌，得到培养基；
29.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3％和1-2％，37-40℃，50-70r/min，发酵培养36-48h，加入体系总质量的2-3wt％的增抗因子，继续发酵培养24-36h，过滤，得到发酵液；
30.所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为3-5:2；
31.s6.金属盐的络合：将100重量份步骤s5中的发酵液中加入5-7重量份可溶性银盐和3-5重量份可溶性锌盐，搅拌混合反应20-30min，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物；
32.s7.植物源生根剂的制备：将10-12重量份步骤s1中的柳树提取物、17-22重量份步骤s6中的金属盐-发酵物和0.05-0.1重量份生长素混合均匀，得到植物源生根剂；
33.所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为5-7:2-3。
34.本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的植物源生根剂。
35.本发明进一步保护一种上述植物源生根剂在促进木本植物、草本植物、愈伤组织、扦插条生根中的应用。
36.本发明具有如下有益效果：柳树提取物中含有一种名为rhizocaline的生根素，可以大大促进植物的生根能力，使得本来很难生根的山毛榉、樱桃、松树、橡树等树木很容易长出根，而容易发根的花木插条则更容易生根。生根素能通过激活植物生长素的合成和运输、促进细胞分裂和伸长，从而促进了根系的生长；促进植物发生根毛，增加根系吸收水分和养分的能力，提高植物的生长效率；促进植物细胞壁的松弛，使细胞更容易伸长分裂，并且有利于根系的生长。
37.另外，柳树提取物中还含有丰富的多酚物质，如邻苯二酚、邻苯三酚等，酚类化合物是芳烃的含羟基衍生物，邻苯二酚和邻苯三酚能促进生长素在根诱导方面的作用增强。与本发明添加的生长素具有协同增效的作用。生长素能够促进生根，其主要的原因在于它能刺激细胞的分裂，可以使特定的静止细胞重新进入分裂的状态。生长素的刺激可使插条内某些酶的活性提高，淀粉和蛋白质的水解产物增加，原生质的粘性降低，原生质膜的透性增加，细胞壁松弛，细胞渗透吸水能力增强，组织的再生能力增强。此外，生长素可能解除基因的抑制，它能提高的合成，从而促进多种酶的合成，诱导根原始体的发端。
38.本发明生长素包括吲哚乙酸(iaa)和萘乙酸(naa)，其中iaa不易被酶系统氧化，传导扩散性能差，容易保留在被处理的部位，有效地促使形成层细胞分裂，naa能够刺激形成层细胞活动并促进细胞脱分化，产生新根。
39.进一步，大豆和葡萄皮经过白参菌和枯草芽孢杆菌发酵后，白参菌能产生多种酶，枯草芽孢杆菌发酵后产生大量的生物酶、抗氧化物质如多酚，蛋白质以及生长因子。
40.本发明添加的大豆中，富含蛋白质和氨基酸等含氮类物质，经过酶解发酵后，能够产生大量的多胺类物质。多胺能够与蛋白结合到细胞壁上，控制着膜上的离子通道。又因为多胺呈碱性，因此它对细胞的内环境也有影响。多胺还能影响植物体内环核苷酸的含量，降低蛋白激酶活性，促使非组蛋白的核蛋白磷酸化。
41.本发明添加的大豆和葡萄皮经过发酵后，产生大量的多种生物酶类，包括过氧化物酶(pod)、多酚氧化酶(ppo)，这些均有很好的促进生根的效果。过氧化物酶是一种活性较高的酶，参与植物体内的各种生理过程以及木质素的形成，与不定根的诱导和伸长生长密切相关，并在植物扦插生根过程中参与生长素的代谢，起着与吲哚乙酸(iaa)相同的作用，氧化消除体内过多的iaa，同时还能促使插穗木质化程度提高，抑制生根；多酚氧化酶广泛存在于植物体内，能够催化iaa与酚类物质形成“iaa-酚酸复合物”，是不定根形成的辅助因子，对植物生根具有重要作用。
42.发酵过程中，添加了增抗因子包括柠檬酸和维生素c，其中，柠檬酸可以增加细胞通透性和代谢活性，提高菌体的抗性，维生素c可以保护细胞膜免受氧化损伤，增加菌体的抗性，从而提高发酵菌的抗性，使得其维持在稳定期，大大提高了发酵效率，促进活性酶、活性多胺、活性多酚、活性有机酸、氨基酸、短肽等的生成，提高了产物的丰富性。
43.同时，经过发酵后，发酵液中富含的氨基酸能够很好的固定金属离子，包括ag离子和zn离子，这两种金属离子对根系也有很好的促进作用。其中，银离子能够促进植物生长素的合成和运输，从而增强植物生长素的作用，促进细胞分裂和伸长，并且增强了植物根系的生长能力；银离子能够提高植物根尖细胞的代谢活力，使其更加活跃，从而促进细胞生长、分裂和增殖；银离子具有强烈的杀菌作用，能够抑制某些细菌和真菌的生长，保护植物根系不受病菌的侵害并促进其生长；锌离子是许多生长素合成和活性化酶的结构元素之一，锌离子的存在可以促进植物生长素的合成和运输，进而促进细胞分裂和伸长，使植物根系生长更为快速、健康；锌离子可以提高植物的抗病性，增强植物对病原菌的防御能力，有利于保护植物根系不受病菌的损害；锌离子可以促进植物的呼吸代谢，增加细胞膜通透性和叶绿体创新能力，产生更多的能量供给细胞分裂生长，从而促进植物根系的生长；同时，银离子和锌离子均能够调节植物的矿质吸收和利用，提高植物根系对养分的吸收能力，促进植物的生长和发育，两者的添加还具有协同增效的作用。
44.本发明制得的植物源生根剂利于植物的成活和生根，具有杀菌消毒、调节植物生长，能够达到较好的促生长和生根的效果，对于促进植物的生长和发育，提高抗性也有明显的促进作用，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
45.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.木瓜蛋白酶，fdg-2203，10万u/g，纤维素酶，sdg-2425，1万u/g，果胶酶，sdg-2408，2.5万u/g，购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司。
47.白参菌购于圣远食品(云南)有限公司；枯草芽孢杆菌，1000亿cfu/g，购于山东益昊生物科技有限公司。
48.实施例1
49.本实施例提供一种植物源生根剂的制备方法，具体包括以下步骤：
50.s1.柳树提取物的制备：将5重量份柳树皮和2重量份柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:5g/ml，加入纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为3:1，所述纤维素酶的加入量为体系总质量的3wt％，50℃酶解2h，紫外线灭酶，加入乙醇至体系乙醇含量为60wt％，50℃提取2h，过滤，滤渣经干燥留用，滤液干燥，柳树提取物；
51.s2.酶解：将5重量份葡萄皮、7重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将10重量份粉料加入100重量份水中，加入0.5复合酶，45℃酶解1h，紫外线灭酶，得到酶解体系；
52.所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为3:7；
53.s3.菌种的活化：将白参菌和枯草芽孢杆菌分别接种至高氏培养基中，37℃，50r/min，活化培养18h，得到菌种种子液，含菌量为108cfu/ml；
54.s4.培养基的制备：将5重量份步骤s1中的滤渣、30重量份步骤s2中的酶解体系混合均匀，紫外线灭菌，得到培养基；
55.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2％和1％，37℃，50r/min，发酵培养36h，加入体系总质量的2wt％的增抗因子，继续发酵培养24h，过滤，得到发酵液；
56.所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为3:2；
57.s6.金属盐的络合：将100重量份步骤s5中的发酵液中加入5重量份硝酸银和3重量份氯化锌，搅拌混合反应20min，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物；
58.s7.植物源生根剂的制备：将10重量份步骤s1中的柳树提取物、17重量份步骤s6中的金属盐-发酵物和0.05重量份生长素，搅拌混合20min，得到植物源生根剂；
59.所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为5:2。
60.实施例2
61.本实施例提供一种植物源生根剂的制备方法，具体包括以下步骤：
62.s1.柳树提取物的制备：将7重量份柳树皮和2重量份柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:7g/ml，加入纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为5:1，所述纤维素酶的加入量为体系总质量的5wt％，60℃酶解3h，紫外线灭酶，加入乙醇至体系乙醇含量为70wt％，60℃提取3h，过滤，滤渣经干燥留用，滤液干燥，柳树提取物；
63.s2.酶解：将7重量份葡萄皮、10重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将12重量份粉料加入100重量份水中，加入1复合酶，55℃酶解2h，紫外线灭酶，得到酶解体系；
64.所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为5:7；
65.s3.菌种的活化：将白参菌和枯草芽孢杆菌分别接种至高氏培养基中，40℃，70r/min，活化培养24h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/ml；
66.s4.培养基的制备：将7重量份步骤s1中的滤渣、50重量份步骤s2中的酶解体系混合均匀，紫外线灭菌，得到培养基；
67.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为3％和2％，40℃，70r/min，发酵培养48h，加入体系总质量的3wt％的增抗因子，继续发酵培养36h，过滤，得到发酵液；
68.所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为5:2；
69.s6.金属盐的络合：将100重量份步骤s5中的发酵液中加入7重量份硝酸银和5重量份氯化锌，搅拌混合反应30min，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物；
70.s7.植物源生根剂的制备：将12重量份步骤s1中的柳树提取物、22重量份步骤s6中的金属盐-发酵物和0.1重量份生长素，搅拌混合20min，得到植物源生根剂；
71.所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为7:3。
72.实施例3
73.本实施例提供一种植物源生根剂的制备方法，具体包括以下步骤：
74.s1.柳树提取物的制备：将6重量份柳树皮和2重量份柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:6g/ml，加入纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为4:1，所述纤维素酶的加入量为体系总质量的4wt％，55℃酶解2.5h，紫外线灭酶，加入乙醇至体系乙醇含量为65wt％，55℃提取2.5h，过滤，滤渣经干燥留用，滤液干燥，柳树提取物；
75.s2.酶解：将6重量份葡萄皮、8.5重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将11重量份粉料加入100重量份水中，加入0.7复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，得到酶解体系；
76.所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为4:7；
77.s3.菌种的活化：将白参菌和枯草芽孢杆菌分别接种至高氏培养基中，39℃，60r/min，活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/ml；
78.s4.培养基的制备：将6重量份步骤s1中的滤渣、40重量份步骤s2中的酶解体系混合均匀，紫外线灭菌，得到培养基；
79.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2.5％和1.5％，39℃，60r/min，发酵培养42h，加入体系总质量的2.5wt％的增抗因子，继续发酵培养
30h，过滤，得到发酵液；
80.所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为4:2；
81.s6.金属盐的络合：将100重量份步骤s5中的发酵液中加入6重量份硝酸银和4重量份硝酸锌，搅拌混合反应25min，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物；
82.s7.植物源生根剂的制备：将11重量份步骤s1中的柳树提取物、20重量份步骤s6中的金属盐-发酵物和0.07重量份生长素，搅拌混合20min，得到植物源生根剂；
83.所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为6:2.5。
84.实施例4
85.与实施例3相比，不同之处在于，增抗因子为单一的柠檬酸。
86.实施例5
87.与实施例3相比，不同之处在于，增抗因子为单一的维生素c。
88.实施例6
89.与实施例3相比，不同之处在于，生长素为单一的吲哚乙酸。
90.实施例7
91.与实施例3相比，不同之处在于，生长素为单一的萘乙酸。
92.对比例1
93.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s2中未添加大豆。
94.具体如下：
95.s2.酶解：将14.5重量份葡萄皮经干燥，粉碎，得到粉料，将11重量份粉料加入100重量份水中，加入0.7复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，得到酶解体系；
96.所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为4:7。
97.对比例2
98.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s2中未添加葡萄皮。
99.具体如下：
100.s2.酶解：将14.5重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将11重量份粉料加入100重量份水中，加入0.7复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，得到酶解体系；
101.所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为4:7。
102.对比例3
103.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s2中未进行酶解。
104.具体如下：
105.s2.混合：将6重量份葡萄皮、8.5重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将11重量份粉料加入100重量份水中，得到混合体系。
106.对比例4
107.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s4中未添加滤渣。
108.具体如下：
109.s4.培养基的制备：将46重量份步骤s2中的酶解体系混合均匀，紫外线灭菌，得到培养基。
110.对比例5
111.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s4中未添加酶解体系。
112.具体如下：
113.s4.培养基的制备：将6重量份步骤s1中的滤渣、40重量份无菌水混合均匀，紫外线灭菌，得到培养基。
114.对比例6
115.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s5中未接种活化的白参菌菌种种子液。
116.具体如下：
117.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量为4％，39℃，60r/min，发酵培养42h，加入体系总质量的2.5wt％的增抗因子，继续发酵培养30h，过滤，得到发酵液；
118.所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为4:2。
119.对比例7
120.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s5中未接种活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液。
121.具体如下：
122.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌菌种种子液，所述活化的白参菌菌种种子液的接种量为4％，39℃，60r/min，发酵培养42h，加入体系总质量的2.5wt％的增抗因子，继续发酵培养30h，过滤，得到发酵液；
123.所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为4:2。
124.对比例8
125.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s5中未添加增抗因子。
126.具体如下：
127.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2.5％和1.5％，39℃，60r/min，发酵培养72h，过滤，得到发酵液。
128.对比例9
129.与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤s3至s5。
130.具体如下：
131.s1.柳树提取物的制备：将6重量份柳树皮和2重量份柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:6g/ml，加入纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为4:1，所述纤维素酶的加入量为体系总质量的4wt％，55℃酶解2.5h，紫外线灭酶，加入乙醇至体系乙醇含量为65wt％，55℃提取2.5h，过滤，滤渣经干燥留用，滤液干燥，柳树提取物；
132.s2.酶解：将6重量份葡萄皮、8.5重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将11重量份粉料加入100重量份水中，加入0.7复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，得到酶解体系；
133.所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为4:7；
134.s3.金属盐的络合：将100重量份步骤s2中的酶解体系中加入6重量份硝酸银和4重量份硝酸锌，搅拌混合反应25min，冷冻干燥，得到金属盐-酶解物；
135.s4.植物源生根剂的制备：将11重量份步骤s1中的柳树提取物、20重量份步骤s3中的金属盐-酶解物和0.07重量份生长素，搅拌混合20min，得到植物源生根剂；
136.所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为6:2.5。
137.对比例10
138.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s6中未添加硝酸银。
139.具体如下：
140.s6.金属盐的络合：将100重量份步骤s5中的发酵液中加入10重量份硝酸锌，搅拌混合反应25min，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物。
141.对比例11
142.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s6中未添加硝酸锌。
143.具体如下：
144.s6.金属盐的络合：将100重量份步骤s5中的发酵液中加入10重量份硝酸银，搅拌混合反应25min，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物。
145.对比例12
146.与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤s6。
147.具体如下：
148.s1.柳树提取物的制备：将6重量份柳树皮和2重量份柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:6g/ml，加入纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为4:1，所述纤维素酶的加入量为体系总质量的4wt％，55℃酶解2.5h，紫外线灭酶，加入乙醇至体系乙醇含量为65wt％，55℃提取2.5h，过滤，滤渣经干燥留用，滤液干燥，柳树提取物；
149.s2.酶解：将6重量份葡萄皮、8.5重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将11重量份粉料加入100重量份水中，加入0.7复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，得到酶解体系；
150.所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为4:7；
151.s3.菌种的活化：将白参菌和枯草芽孢杆菌分别接种至高氏培养基中，39℃，60r/min，活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/ml；
152.s4.培养基的制备：将6重量份步骤s1中的滤渣、40重量份步骤s2中的酶解体系混合均匀，紫外线灭菌，得到培养基；
153.s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2.5％和1.5％，39℃，60r/min，发酵培养42h，加入体系总质量的2.5wt％的增抗因子，继续发酵培养30h，过滤，冷冻干燥，得到发酵物；
154.所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为4:2；
155.s6.植物源生根剂的制备：将11重量份步骤s1中的柳树提取物、20重量份步骤s5中的发酵物和0.07重量份生长素，搅拌混合20min，得到植物源生根剂；
156.所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为6:2.5。
157.对比例13
158.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s7中未添加柳树提取物。
159.具体如下：
160.s7.植物源生根剂的制备：将20重量份步骤s6中的金属盐-发酵物和0.07重量份生长素，搅拌混合20min，得到植物源生根剂。
161.对比例14
162.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s7中未添加金属盐-发酵物。
163.具体如下：
164.s7.植物源生根剂的制备：将11重量份步骤s1中的柳树提取物和0.07重量份生长素，搅拌混合20min，得到植物源生根剂。
165.对比例15
166.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s7中未添加生长素。
167.具体如下：
168.s7.植物源生根剂的制备：将11重量份步骤s1中的柳树提取物、20重量份步骤s6中的金属盐-发酵物，搅拌混合20min，得到植物源生根剂。
169.测试例1
170.选自组培繁殖的芳樟醇型黄樟优良无性系。选取生长健壮、无病虫害，具有顶芽的半木质化嫩枝，将枝条剪成长6-8cm的小插穗，每穗带1-2个芽，保留上端1-2片叶，上端切口离腋芽0.5cm处平剪，下切口平剪，切口平整光滑，穗条剪好，选择ⅱ级穗条为插穗。扦插前将穗条扎捆，基部浸泡植物本发明实施例1-9和对比例1-15制得的植物源生根剂溶液(取1g植物源生根剂加入100g水中，1000w超声15min制得)1h后立即扦插入黄心土中，以清水浸泡为对照，每组3个重复，每个重复20根插穗。观察插后90d记录生根情况，计算生根率、根系指数和根系效果指数。其中。
171.根系指数＝(平均根长+3
×
平均根数)/4
172.根系效果指数＝(生根率
×
根系指数)/100。
173.结果见表1。
174.表1
[0175][0176][0177]
由上表可知，本发明实施例1-3制得的植物源生根剂对芳樟醇型黄樟有很好的促进生根的效果。
[0178]
测试例2
[0179]
选取准备好的百香果插穗(供试插条为健壮、当年生半木质化(中段)、含2个节、10-15cm长的百香果插穗)，于每个锥形瓶中放置插条5根，每组3个重复，每个重复20根插穗，锥形瓶中加入植物源生根剂溶液100ml(取1g植物源生根剂加入100g水中，1000w超声15min制得)将锥形瓶放置于温室大棚中，再于锥形瓶上搭建遮阴网棚。每10d更换1次提取物溶液，于第40天记录生根根长、生根数，计算生根率，并观察百香果插穗的成活情况。结果见表2。
[0180]
表2
[0181]
[0182][0183]
由上表可知，本发明实施例1-3制得的植物源生根剂对百香果插穗有很好的促进生根的效果。
[0184]
实施例4、5与实施例3相比，增抗因子为单一的柠檬酸或维生素c。对比例8与实施例3相比，步骤s5中未添加增抗因子。百香果插穗和芳樟醇型黄樟的生根率下降。本发明发酵过程中，添加了增抗因子包括柠檬酸和维生素c，其中，柠檬酸可以增加细胞通透性和代谢活性，提高菌体的抗性，维生素c可以保护细胞膜免受氧化损伤，增加菌体的抗性，从而提
高发酵菌的抗性，使得其维持在稳定期，大大提高了发酵效率，促进活性酶、活性多胺、活性多酚、活性有机酸、氨基酸、短肽等的生成，提高了产物的丰富性。
[0185]
实施例6、7与实施例3相比，生长素为单一的吲哚乙酸或萘乙酸。对比例15与实施例3相比，步骤s7中未添加生长素。百香果插穗和芳樟醇型黄樟的生根数量和根长下降，百香果成活情况下降。本发明生长素包括吲哚乙酸(iaa)和萘乙酸(naa)，其中iaa不易被酶系统氧化，传导扩散性能差，容易保留在被处理的部位，有效地促使形成层细胞分裂，naa能够刺激形成层细胞活动并促进细胞脱分化，产生新根。
[0186]
对比例1、2与实施例3相比，步骤s2中未添加大豆或葡萄皮。对比例5与实施例3相比，步骤s4中未添加酶解体系。对比例3与实施例3相比，步骤s2中未进行酶解。百香果插穗和芳樟醇型黄樟的生根率、生根数量和根长下降。本发明添加的大豆中，富含蛋白质和氨基酸等含氮类物质，经过酶解发酵后，能够产生大量的多胺类物质。多胺能够与蛋白结合到细胞壁上，控制着膜上的离子通道。又因为多胺呈碱性，因此它对细胞的内环境也有影响。多胺还能影响植物体内环核苷酸的含量，降低蛋白激酶活性，促使非组蛋白的核蛋白磷酸化。
[0187]
对比例6、7与实施例3相比，步骤s5中未接种活化的白参菌菌种种子液或活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液。对比例9与实施例3相比，未进行步骤s3至s5。百香果插穗和芳樟醇型黄樟的生根率、生根数量和根长下降。本发明大豆和葡萄皮经过白参菌和枯草芽孢杆菌发酵后，白参菌能产生多种酶，枯草芽孢杆菌发酵后产生大量的生物酶、抗氧化物质如多酚，蛋白质以及生长因子。本发明添加的大豆和葡萄皮经过发酵后，产生大量的多种生物酶类，包括过氧化物酶(pod)、多酚氧化酶(ppo)，这些均有很好的促进生根的效果。过氧化物酶是一种活性较高的酶，参与植物体内的各种生理过程以及木质素的形成，与不定根的诱导和伸长生长密切相关，并在植物扦插生根过程中参与生长素的代谢，起着与吲哚乙酸(iaa)相同的作用，氧化消除体内过多的iaa，同时还能促使插穗木质化程度提高，抑制生根；多酚氧化酶广泛存在于植物体内，能够催化iaa与酚类物质形成“iaa-酚酸复合物”，是不定根形成的辅助因子，对植物生根具有重要作用。
[0188]
对比例10、11与实施例3相比，步骤s6中未添加硝酸银或硝酸锌。对比例12与实施例3相比，未进行步骤s6。对比例14与实施例3相比，步骤s7中未添加金属盐-发酵物。百香果插穗和芳樟醇型黄樟的生根率、生根数量和根长下降，百香果成活情况下降。本发明经过发酵后，发酵液中富含的氨基酸能够很好的固定金属离子，包括ag离子和zn离子，这两种金属离子对根系也有很好的促进作用。其中，银离子能够促进植物生长素的合成和运输，从而增强植物生长素的作用，促进细胞分裂和伸长，并且增强了植物根系的生长能力；银离子能够提高植物根尖细胞的代谢活力，使其更加活跃，从而促进细胞生长、分裂和增殖；银离子具有强烈的杀菌作用，能够抑制某些细菌和真菌的生长，保护植物根系不受病菌的侵害并促进其生长；锌离子是许多生长素合成和活性化酶的结构元素之一，锌离子的存在可以促进植物生长素的合成和运输，进而促进细胞分裂和伸长，使植物根系生长更为快速、健康；锌离子可以提高植物的抗病性，增强植物对病原菌的防御能力，有利于保护植物根系不受病菌的损害；锌离子可以促进植物的呼吸代谢，增加细胞膜通透性和叶绿体创新能力，产生更多的能量供给细胞分裂生长，从而促进植物根系的生长；同时，银离子和锌离子均能够调节植物的矿质吸收和利用，提高植物根系对养分的吸收能力，促进植物的生长和发育，两者的添加还具有协同增效的作用。
[0189]
对比例13与实施例3相比，步骤s7中未添加柳树提取物。对比例4与实施例3相比，步骤s4中未添加滤渣。百香果插穗和芳樟醇型黄樟的生根率、生根数量和根长下降。柳树提取物中含有一种名为rhizocaline的生根素，可以大大促进植物的生根能力，使得本来很难生根的山毛榉、樱桃、松树、橡树等树木很容易长出根，而容易发根的花木插条则更容易生根。生根素能通过激活植物生长素的合成和运输、促进细胞分裂和伸长，从而促进了根系的生长；促进植物发生根毛，增加根系吸收水分和养分的能力，提高植物的生长效率；促进植物细胞壁的松弛，使细胞更容易伸长分裂，并且有利于根系的生长。另外，柳树提取物中还含有丰富的多酚物质，如邻苯二酚、邻苯三酚等，酚类化合物是芳烃的含羟基衍生物，邻苯二酚和邻苯三酚能促进生长素在根诱导方面的作用增强。与本发明添加的生长素具有协同增效的作用。生长素能够促进生根，其主要的原因在于它能刺激细胞的分裂，可以使特定的静止细胞重新进入分裂的状态。生长素的刺激可使插条内某些酶的活性提高，淀粉和蛋白质的水解产物增加，原生质的粘性降低，原生质膜的透性增加，细胞壁松弛，细胞渗透吸水能力增强，组织的再生能力增强。此外，生长素可能解除基因的抑制，它能提高的合成，从而促进多种酶的合成，诱导根原始体的发端。
[0190]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种植物源生根剂的制备方法，其特征在于，将柳树皮和柳树枝经过酶解后乙醇提取，过滤，滤渣留用，滤液干燥，得到柳树提取物，将葡萄皮、大豆经过复合酶酶解后，与滤渣混合得到培养基，接种活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液发酵，得到发酵液，加入可溶性银盐和可溶性锌盐，干燥，得到金属盐-发酵物，与柳树提取物和生长素混合均匀，得到植物源生根剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.柳树提取物的制备：将柳树皮和柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，加入纤维素酶和果胶酶酶解，灭酶，加入乙醇提取，过滤，滤渣留用，滤液干燥，柳树提取物；s2.酶解：将葡萄皮、大豆经干燥，粉碎，得到粉料，加入水中，加入复合酶酶解，灭酶，得到酶解体系；s3.菌种的活化：将白参菌和枯草芽孢杆菌分别接种至高氏培养基中，活化培养，得到菌种种子液；s4.培养基的制备：将步骤s1中的滤渣、步骤s2中的酶解体系混合均匀，灭菌，得到培养基；s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，发酵培养第一时间段，加入增抗因子，发酵培养第二时间段，过滤，得到发酵液；s6.金属盐的络合：将步骤s5中的发酵液中加入可溶性银盐和可溶性锌盐，搅拌混合反应，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物；s7.植物源生根剂的制备：将步骤s1中的柳树提取物、步骤s6中的金属盐-发酵物和生长素混合均匀，得到植物源生根剂。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述柳树皮和柳树枝的质量比为5-7:2，所述混合粉和水的固液比为1:5-7g/ml，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为3-5:1，所述酶解的条件为50-60℃，酶解2-3h，所述加入乙醇至体系乙醇含量为60-70wt％，所述提取的方法为加热至50-60℃，提取2-3h。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述葡萄皮、大豆的质量比为5-7：7-10，所述粉料、水和复合酶的质量比为10-12:100:0.5-1，所述酶解的条件为45-55℃，酶解1-2h，所述复合酶选自纤维素酶、果胶酶、
ɑ-淀粉酶、β-淀粉酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶中的至少一种；步骤s3中所述活化培养的条件为37-40℃，50-70r/min，活化培养18-24h，所述菌种种子液的含菌量为10
8-109cfu/ml。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为3-5:7。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s4中所述滤渣和酶解体系的质量比为5-7:30-50；步骤s5中所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3％和1-2％，所述发酵培养的条件为37-40℃，50-70r/min，所述第一时间段为36-48h，所述第二时间段为24-36h，所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为3-5:2。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s6中所述可溶性银盐选自硝酸银、偏硝酸银中的至少一种，所述可溶性锌盐选自氯化锌、硫酸锌、硝酸锌中的至少一种，所述发酵液、可溶性银盐和可溶性锌盐的质量比为100:5-7:3-5，所述搅拌混合反应的时间为
20-30min；步骤s7中所述柳树提取物、金属盐-发酵物和生长素的质量比为10-12:17-22:0.05-0.1，所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为5-7:2-3。8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：s1.柳树提取物的制备：将5-7重量份柳树皮和2重量份柳树枝干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:5-7g/ml，加入纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为3-5:1，所述纤维素酶的加入量为体系总质量的3-5wt％，50-60℃酶解2-3h，紫外线灭酶，加入乙醇至体系乙醇含量为60-70wt％，50-60℃提取2-3h，过滤，滤渣留用，滤液干燥，柳树提取物；s2.酶解：将5-7重量份葡萄皮、7-10重量份大豆经干燥，粉碎，得到粉料，将10-12重量份粉料加入100重量份水中，加入0.5-1复合酶，45-55℃酶解1-2h，紫外线灭酶，得到酶解体系；所述复合酶为木瓜蛋白酶和纤维素酶的混合物，质量比为3-5:7；s3.菌种的活化：将白参菌和枯草芽孢杆菌分别接种至高氏培养基中，37-40℃，50-70r/min，活化培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为10
8-109cfu/ml；s4.培养基的制备：将5-7重量份步骤s1中的滤渣、30-50重量份步骤s2中的酶解体系混合均匀，紫外线灭菌，得到培养基；s5.发酵：向步骤s4中的培养基中接种步骤s3中的活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3％和1-2％，37-40℃，50-70r/min，发酵培养36-48h，加入体系总质量的2-3wt％的增抗因子，继续发酵培养24-36h，过滤，得到发酵液；所述增抗因子包括柠檬酸和维生素c，质量比为3-5:2；s6.金属盐的络合：将100重量份步骤s5中的发酵液中加入5-7重量份可溶性银盐和3-5重量份可溶性锌盐，搅拌混合反应20-30min，冷冻干燥，得到金属盐-发酵物；s7.植物源生根剂的制备：将10-12重量份步骤s1中的柳树提取物、17-22重量份步骤s6中的金属盐-发酵物和0.05-0.1重量份生长素混合均匀，得到植物源生根剂；所述生长素包括吲哚乙酸和萘乙酸，质量比为5-7:2-3。9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的植物源生根剂。10.一种如权利要求9所述植物源生根剂在促进木本植物、草本植物、愈伤组织、扦插条生根中的应用。

技术总结
本发明提出了一种植物源生根剂及其制备方法，属于生根剂技术领域。将柳树皮和柳树枝经过酶解后乙醇提取，过滤，滤渣留用，滤液干燥，得到柳树提取物，将葡萄皮、大豆经过复合酶酶解后，与滤渣混合得到培养基，接种活化的白参菌和枯草芽孢杆菌菌种种子液发酵，得到发酵液，加入可溶性银盐和可溶性锌盐，干燥，得到金属盐-发酵物，与柳树提取物和生长素混合均匀，得到植物源生根剂。本发明制得的植物源生根剂利于植物的成活和生根，具有杀菌消毒、调节植物生长，能够达到较好的促生长和生根的效果，对于促进植物的生长和发育，提高抗性也有明显的促进作用，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。


技术研发人员：张桂强
受保护的技术使用者：青岛有为生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/20