Calpain及其抑制剂在主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用

calpain及其抑制剂在主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药标志物技术领域，具体涉及calpain及其抑制剂在主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用。


背景技术：

2.主动脉疾病（taad）正在呈现年轻化趋势，且男性发病率明显高于女性。taad发病率的快速增长，与缺乏早期诊断指标密不可分。目前临床上对于主动脉疾病的早期诊断主要是通过提高个人健康意识，结合心脏超声和大血管cta等检查以评估疾病风险，但有研究发现仍有多达60%的主动脉夹层患者在死亡前未能及时诊断，且未经及时治疗的患者发病2周内死亡率可达80%。主动脉疾病产生与遗传因素、血管组织结构变异有密切关系，仅凭主动脉直径、血流动力学等参数很难评估，因此这种策略难以应用于高危人群的筛查、预警及预后判断。
3.目前临床缺乏应用于主动脉疾病早期预警、治疗及预后评估的有效药物靶点。既往应用于临床鉴别诊断中的指标，如d-二聚体、超敏 crp、hstnt，可辅助疾病诊断，但无法作为后续的药物治疗靶点进行开发应用。因此，需要从蛋白组学、代谢组学等不同分子水平、多个维度进行研究，开发更有效、更具特异性的生物标志物以及药物靶点，用于临床不同类型主动脉疾病的早期诊断及干预靶点开发。


技术实现要素：

4.解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供了一种calpain及其抑制剂的应用，包括calpain在筛选主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用，以及calpain抑制剂在制备主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用。
5.技术方案：calpain在筛选主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用。
6.calpain在筛选主动脉疾病引起的早期器官功能损伤的预测药物中的应用。
7.优选的，所述器官功能损伤包括心肌、肝脏和肾脏功能损伤。
8.calpain在筛选主动脉疾病引起的炎症的预测和评估药物中的应用。
9.calpain抑制剂在制备主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用。
10.优选的，所述calpain抑制剂包括钙蛋白酶抑制剂及药学上可接受的载体。
11.优选的，所述calpain包括calpain-1和calpain-2。
12.优选的，所述主动脉疾病包括主动脉瘤和主动脉夹层。
13.进一步的，所述主动脉瘤为胸主动脉瘤，所述主动脉夹层为胸主动脉夹层。
14.更进一步的，所述胸主动脉瘤为急性胸主动脉瘤，所述胸主动脉夹层为急性胸主动脉夹层。
15.有益效果：本发明提供的calpain可以作为主动脉疾病的生物标志物及药物治疗靶点，具有良好的特异性和灵敏性，由此筛选和制备的相关预测、治疗和预后评估药物，可
以有效降低动物模型中calpain的活性，进而改善主动脉疾病的治疗效果，有望成为改善主动脉瘤/夹层发生发展的治疗手段。
附图说明
16.图1是差异蛋白火山图，其中，横坐标表示差异蛋白的差异倍数（log2值），纵轴表示pvalue（-log
10
值），黑色圆点代表非显著差异蛋白，红色圆点代表上调的显著差异蛋白 ，绿色圆点代表下调的显著差异蛋白；图2是go注释结果柱状图，其中，横坐标表示蛋白数目，纵坐标表示注释到的go条目；图3是胸主动脉夹层患者与健康人外周血sbdp145浓度比较图，其中，control表示正常人，aortic dissection表示胸主动脉夹层患者，** p =0.0032；图4是血清sbdp145与il-6、il-8、il-10、ifn-γ、il-1β的相关性，其中，a.血清sbdp145与il-6相关系数0.6896，p = 0.0001；b.血清sbdp145与il-8相关系数0.8187，p ＜ 0.0001；c.血清sbdp145与il-10相关系数0.8444，p《0.0001；d.血清sbdp145与inf-γ相关系数0.3992，p《0.05；e.血清sbdp145与il-1β相关系数0.4319，p《0.05；图5是calpain预测胸主动脉夹层患者心脏、肾脏、肝脏功能损伤的roc曲线，其中，kidney injury：肾功能损伤；liver injury：肝功能损伤；myocardial injury：心肌损伤；图6是各组小鼠kaplan-meier生存曲线，其中，control：对照组；calpeptin：抑制剂组；bapn：β-氨基丙腈组；bapn+calpeptin：β-氨基丙腈组联合抑制剂组；图7是各组小鼠主动脉夹层发生与破裂情况；图8是实验i各组c57bl/6小鼠体内calpain-1和calpain-2的表达。
实施方式
17.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
18.实施例1 calpain的筛选随机选取5例急性胸主动脉夹层患者作为实验组，同期5例健康人群作为对照组，进行外周血清的蛋白组学检测分析。采用tmt技术进行蛋白质定量分析。通过比较急性胸主动脉夹层组和健康对照组血浆样本中蛋白样品对，将每个蛋白在比较样品对中的所有生物重复定量值的均值的比值作为差异倍数（fold change，fc）。通过t检验判断每个蛋白在两个样品中的差异，计算p值，该项目选择当fc ≥ 1.2，同时p值≤ 0.05时，筛选上调表达蛋白，当fc ≤ 0.83，同时p值 ≤ 0.05时，筛选下调表达蛋白，共计筛选出1845个差异蛋白，根据条件筛选出36个上调差异蛋白，16个下调差异蛋白（图1）。
19.差异蛋白go功能富集分析，重点关注富集到钙结合通路和免疫反应两个条目的蛋白，结合差异蛋白筛选结果，共同富集到capns1（图2）。
20.利用蛋白组学发现与钙通道相关的免疫调节蛋白capns1，capns1是钙蛋白酶calpain-1和calpain-2调节亚基。calpain蛋白在外周血中不易检测蛋白含量，但calpain活性可通过检测血影蛋白spectrin切割分解产物sbdp145来反应。本发明中采用酶联免疫吸附法测定人外周血sbdp145的含量，sbdp145蛋白片段的浓度即可间接反应患者或者健康人群体内的钙蛋白酶calpain的活性。发明中检测急性胸主动脉夹层患者和健康对照人群
的血清样本，结果急性胸主动脉夹层患者血清sbdp145浓度为1584.06
ꢀ±ꢀ
216.39 pg/ml，健康人群为818.32
ꢀ±ꢀ
118.78 pg/ml，p = 0.0032，急性胸主动脉夹层患者血清sbdp145显著增加（表1，图3）。
21.表1 两组人群calpain活性的比较
22.实施例2 calpain及其抑制剂的应用calpain对主动脉疾病患者炎症程度的评估应用：对同一病人外周血sbdp145浓度与所检测的细胞因子浓度进行相关性分析，发现血清sbdp145与il-6、il-1β、ifn-γ、il-8、il-10相关系数均大于0，p值均小于0.05。其中，calpain活性与il-6、il-8以及il-10的相关系数比较高，大于0.5以上。结果提示急性胸主动脉夹层患者血清calpain活性增加，与il-6、il-8、il-10、ifn-γ、il-1β炎症指标均呈正相关，calpain可作为急性胸主动脉夹层患者疾病炎症程度评估的重要的生物标志物（图4）。
23.calpain活性对主动脉疾病患者早期器官功能损伤的预测应用：急性胸主动脉夹层患者由于器官灌注不足以及全身炎症反应可导致不同程度的器官功能损伤，本发明中将超敏肌钙蛋白大于52 pg/ml定义为心肌损伤，急性肾损伤诊断标准按照kidgo指南将符合如下标准之一的患者定义为存在急性肾损伤：
①
在 48 h 内血清肌酐（scr）上升身 0.3 mg/dl（≥ 26.5μmol/l）；
②
已知或假定肾功能损害发生在 7d 之内，scr 上升至基础值的 1.5 倍以上；
③
尿量《0.5 ml/（kg
·
h），持续 6 h。将谷丙转氨酶大于正常上限的5倍或者谷丙转氨酶大于正常值上限的3倍且胆红素大于正常值上限的2倍定义为急性肝损伤。
24.将calpain活性按照中位数（1207.10 pg/ml）分为高活性组和低活性组，大于等于1207.10 pg/ml的纳入高活性组共15例，小于1207.10 pg/ml的纳入低活性组共10例，高活性组和低活性组发生肾功能损伤的比例分别占26.67%、0.00%，肝功能损伤的比例分别占20.00%、10.00%，心肌损伤的比例分别占20.00%、0.00%（表2）。
25.表2 急性胸主动脉夹层患者器官功能损伤情况
26.calpain活性对心肌、肝脏、肾脏功能损伤预测的曲线下面积分别为0.7567（95% ci: 0.502
ꢀ‑ꢀ
1.011, p = 0.0542）、0.8214（95% ci: 0.556
ꢀ‑ꢀ
1.087, p = 0.0454）、0.9405（95%ci: 0.844
ꢀ‑ꢀ
1.037, p = 0.0061）。结果表明calpain活性增强与急性胸主动脉夹层患者器官功能损伤相关，尤其是在肝脏和肾脏中更加明显（图5）。
27.calpain抑制剂对主动脉疾病的治疗效果：为了探讨calpain作为药物靶点，在主动脉疾病中的治疗效果，应用钙蛋白酶抑制剂calpeptin，构建小鼠主动脉瘤/夹层模型，观测小鼠生存、成瘤/夹层率。实验i选取c57bl/6小鼠，共分为4个大组（control组、calpeptin组、bapn组、bapn + calpeptin组）。处理措施如下：control组，予双蒸水喂养四周，同时每周3次腹腔注射生理盐水，剂量为0.2ml/10g；calpeptin组，予双蒸水喂养四周，同时每周3次腹腔注射calpeptin稀释液，剂量为0.02 mg/0.2ml/10g；bapn组，予1g/kg/day的bapn喂养小鼠，同时每周3次腹腔注射生理盐水，剂量为0.2ml/10g；bapn + calpeptin组，予1g/kg/day的bapn喂养小鼠，同时每周3次腹腔注射calpeptin稀释液，剂量为0.02 mg/0.2ml/10g。
28.结果显示control组、calpeptin组、bapn组和bapn + calpeptin组生存的平均天数分别为28.00
ꢀ±ꢀ
0.00天、28.00
ꢀ±ꢀ
0.00天、20.40
ꢀ±ꢀ
1.43天、24.50
ꢀ±ꢀ
2.21天。进一步绘制各组小鼠kaplan-meier生存曲线，与control组和calpeptin组小鼠相比，bapn组小鼠生存显著降低，log rank p＜0.0001，当接受bapn喂养小鼠腹腔注射calpeptin后，其生存情况得到改善。结果见表3 和图6。
29.表3 各组小鼠急性胸主动脉夹层形成及28天生存情况
30.注：数值资料以平均值
±
标准差表示，发生率用百分比表示。
31.通过大体解剖以明确小鼠是否发生主动脉夹层，对发生情况与破裂情况进行记录。control组、calpeptin组、bapn组和bapn + calpeptin组小鼠急性胸主动脉夹层发生率分别为0%、0%、100%、67%，夹层破裂率分别为0%、0%、87%、13%，对小鼠主动脉夹层形成及破裂情况绘制柱状图，如图7所示。结果显示，应用钙蛋白酶抑制剂，可以改善主动脉夹层形成和
夹层破裂的发生情况。
32.急性主动脉夹层的病变主要在主动脉，calpain家族在动脉组中主要为calpain-1和calpain-2，提取主动脉组织总蛋白，利用western blot 检测组织内calpain-1和calpain-2的表达。结果发现，腹腔注射calpeptin的小鼠calpain-1和calpain-2的表达显著下降；而喂养bapn小鼠体内calpain-2的表达明显增加，calpain-1的表达增加不明显；应用钙蛋白酶抑制剂calpeptin后，主动脉组织内calpain-1和calpain-2的表达均下调。结果提示在小鼠模型中主动脉夹层发生后，主动脉组织的calpain-2表达较正常显著升高，而无论是calpain-1还是calpain-2均可被calpeptin显著抑制（图8）。

技术特征：
1.calpain在筛选主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用。2.calpain在筛选主动脉疾病引起的早期器官功能损伤的预测药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述器官功能损伤包括心肌、肝脏和肾脏功能损伤。4.calpain在筛选主动脉疾病引起的炎症的预测和评估药物中的应用。5.calpain抑制剂在制备主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述calpain抑制剂包括钙蛋白酶抑制剂及药学上可接受的载体。7.根据权利要求1~6任一项所述的应用，其特征在于，所述calpain包括calpain-1和calpain-2。8.根据权利要求1~6任一项所述的应用，其特征在于，所述主动脉疾病包括主动脉瘤和主动脉夹层。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述主动脉瘤为胸主动脉瘤，所述主动脉夹层为胸主动脉夹层。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述胸主动脉瘤为急性胸主动脉瘤，所述胸主动脉夹层为急性胸主动脉夹层。

技术总结
本发明提供了一种Calpain及其抑制剂在主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用，包括Calpain在筛选主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用，以及Calpain抑制剂在制备主动脉疾病预测、治疗和预后评估药物中的应用。本发明提供的Calpain可以作为主动脉疾病的生物标志物及药物治疗靶点，具有良好的特异性和灵敏性，由此筛选和制备的相关预测、治疗和预后评估药物，可以有效降低动物模型中Calpain的活性，进而改善主动脉疾病的治疗效果，有望成为改善主动脉瘤/夹层发生发展的治疗手段。疗手段。疗手段。


技术研发人员：滕小梅 沈振亚 熊一帆 黄浩岳 沈晗 丁英龙
受保护的技术使用者：苏州大学附属第一医院
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/20