一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法。


背景技术：

2.蛋白质组学是研究某种生物体所表达的全部蛋白质或系统中所有蛋白质的科学，蛋白质作为生命活动的执行者，在维持机体正常运行方面发挥着重要作用，其种类和含量的变化与生物体的生长、应激以及疾病等密切相关。因此，蛋白质组学研究对揭示生命活动的本质、寻找疾病相关的生物标志物具有重要意义。
3.代谢组是细胞或机体某个时期全部代谢物质的总和，如脂质、糖类和氨基酸等，这些物质在代谢过程中充当反应的底物或产物，是研究机体代谢网络的关键物质。代谢组学就是专门研究这些代谢物质的科学，作为后基因组时代下驱生的新生技术，其主要目的是通过定性和定量表征小分子代谢物的变化来探索细胞代谢的分子机理，了解细胞代谢的相互作用网络。代谢物质不仅能反映机体的表型状态，还可以作为功能调控物质参与调节蛋白质-蛋白质相互作用、影响蛋白酶活性以及蛋白质的稳定性等，进而通过反馈机制调控机体的代谢状态。蛋白质组学和代谢组学整合分析，将蛋白组学的数据和代谢组学的数据批量整合起来，进行系统归一化处理以及统计学分析，再结合其他生物信息学分析手段如富集分析、相关性分析等，以挖掘单一组学分析不能获取的重要数据，构建代谢物变化与蛋白酶调控机制的分子模型，为后续深入分析提供数据基础，是系统性研究机体代谢调控网络的有效途径。
4.内源性代谢物小分子是胞内分子化合物的主要成分，并且各种代谢物分子在胞内浓度分布上具有较大差异。其所涉及的与多种多样的蛋白质的相互作用(无论是通过以产物/底物的形式参与酶促反应过程，或是以变构辅因子/配体的形式变构调控蛋白质)，已被证明可以控制生化反应中的物质能量代谢并且能通过信号传导来调节整个生理过程。因此，解析阐述生理条件下的代谢物-蛋白质相互作用能够揭示隐藏在疾病/健康状态下的分子理论基础，对于人类健康与医药发展至关重要。此外，疾病相关蛋白质的代谢调节剂还可能为潜在的治疗干预措施提供新的策略。
5.代谢物通过与靶向蛋白质相互作用在生物体中发挥重要作用，参与调控许多细胞过程，如信号传导、酶反应、蛋白别构调节等。然而，缺乏有效的研究手段。尽管研究者们已经发现了数量可观的代谢物-蛋白质相互作用，但基于代谢体系的复杂性以及缺乏有效的表征手段，只有其中的一小部分所涉及的相互作用网络被研究透彻。常见的表征代谢物-蛋白质相互作用的研究手段包括荧光光谱法、表面等离子体共振、等温滴定量热法、核磁共振法等，但大多数这些研究手段均需要在分析之前对蛋白质/配体进行标记、蛋白质固载或者其他额外的操作，故而可能产生假阳性的代谢物-蛋白质互作研究结果。随着质谱技术的发展，高分辨质谱逐渐成为了代谢物-蛋白质相互作用的新型研究平台。saghatelian等在体外异源表达了靶标蛋白，利用代谢组学的手段筛选了与该蛋白可能具有相互作用的代谢
物，但存在材料吸附过程中产生非特异性吸附从而引入假阳性结果的可能。klassen等利用结构质谱技术能够直接表征小分子-蛋白质之间的相互作用，并且能够获得相关的热力学及动力学参数，但这种方法不能够大批量的筛选与靶标蛋白具有相互作用的代谢物，仅仅适用较为简单的研究体系。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法，不仅具有鉴定快速的特点而且还能够实现大批量代谢物的鉴定。
7.本发明提供了一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法，包括以下步骤：
8.将待测样品和抗蛋白质的抗体混合进行免疫共沉淀反应，采用有机溶剂萃取方法分离共沉淀物中小分子代谢物，采用高分辨质谱靶向定量检测所述蛋白质结合的小分子代谢物，当检测到小分子代谢物时，说明小分子代谢物与蛋白质存在相互作用。
9.优选的，所述蛋白质包括内源性蛋白、外源性蛋白或纯化的蛋白质。
10.优选的，所述蛋白质为内源性蛋白质时，所述待测样品为细胞裂解液。
11.优选的，在所述高分辨质谱靶向定量检测时，还包括检测细胞裂解液和阴性对照组代谢物；
12.所述阴性对照组代谢物为在免疫共沉淀反应时与igg抗体混合进行免疫共沉淀反应后，采用有机物萃取的方法分离的共沉淀物的代谢物。
13.优选的，所述蛋白质为外源性蛋白质时，所述待测样品为过表达蛋白质的细胞的细胞裂解液。
14.优选的，所述蛋白质为纯化的蛋白质时，所述待测样品为纯化后的蛋白质和目标小分子代谢物的混合物。
15.优选的，所述有机溶剂萃取方法为将所述共沉淀物经过稀释后与有机溶剂混合，收集有机溶剂相；
16.所述共沉淀物的稀释倍数为100倍；
17.稀释后的共沉淀物和有机溶剂的体积比为10:3。
18.优选的，所述有机溶剂的种类根据小分子代谢物的溶解性来确定：
19.当小分子代谢物为脂溶性，有机溶剂包括甲醇；
20.当小分子代谢物为水溶性，有机溶剂包括乙腈。
21.优选的，所述小分子代谢物为花生四烯酸。
22.优选的，所述高分辨质谱靶向定量检测的条件参数根据蛋白质的种类确定：
23.当所述蛋白质为menin蛋白时，述高分辨质谱靶向定量检测采用thermoscientific超高效液相色谱仪连接sciex 5600质谱仪进行检测，
24.1)液相色谱条件
25.1)色谱柱：acquity uplc beh c18 column，规格为色谱柱内径2.1mm
×
色谱柱长度100mm，粒径1.7μm；
26.2)流动相：a体积浓度0.1％甲酸-水；b乙腈
27.3)流速：0.3ml/min；
28.质谱检测采用电喷雾电离(esi)负离子模式进行检测；esi源条件如下：离子源气体1:50，离子源气体2:50，curtain gas：25，源温度：400℃(负离子)，离子saparyvoltage floating4500v，tof ms扫描范围：100-1200da，产物离子扫描范围：50-1000da，tof质谱扫描累积时间0.2s，乘积离子扫描累积时间0.01s二级质谱采用依赖信息的获取获得，并采用高灵敏度模式，去簇电位(dp)：
±
60v，碰撞能量：35
±
15ev。
29.本发明提供了一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法，包括以下步骤：将待测样品和抗蛋白质的抗体混合进行免疫共沉淀反应，采用有机溶剂萃取方法分离共沉淀物中代谢物，采用高分辨质谱靶向定量检测所述蛋白质结合的代谢物。本发明通过免疫共沉淀技术结合靶向代谢质谱检测，能够快速准确地鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体，具有鉴定快速准确的特点，并且可实现高通量的检测，能够满足大批量筛选与靶标蛋白具有相互作用的代谢物，为验证小分子代谢物与蛋白质的相互作用提供了有效手段，并且小分子代谢物作为别构剂调控蛋白的结构，从而为蛋白的别构调控提供新手段。
附图说明
30.图1为分子对接模拟aa与menin蛋白的相互作用区域并预测潜在结合位点结果；
31.图2为收集并裂解293t细胞，向细胞裂解物中分别加入compass复合物不同亚基抗体(包括甲基转移酶亚基：set1a、set1b、mll1及mll2；功能调控亚基：rbbp5、wdr82、cfp1、menin、wdr5及ash2l)进行免疫共沉淀(ip)，甲醇萃取共沉淀物中的代谢物，高分辨靶向定量质谱检测aa的水平结果；
32.图3为分别构建compass复合物功能调控亚基过表达载体(含flag标签)，转染293t细胞，48小时收集并裂解细胞，使用flag beads进行免疫共沉淀(通过灰度值调整ip实验使每个抗体沉淀的蛋白量保持一致)，甲醇萃取共沉淀物中的代谢物，定量检测aa的水平(flag ip，左)；使用flag beads进行免疫共沉淀之前取少量细胞裂解液作为input，定量检测aa的水平(input，右)结果；
33.图4为分别向纯化的menin蛋白中加入10μm、50μm或100μm花生四烯酸(aa)，37℃孵育6小时，随后向反应体系中分别加入igg或menin抗体，进行体外蛋白ip实验，甲醇萃取共沉淀物中的代谢物，高分辨质谱靶向定量检测menin蛋白所结合的aa的水平结果；
34.图5为微量热泳动实验(mst)检测aa与menin蛋白的相互作用结果。
具体实施方式
35.本发明提供了一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法，包括以下步骤：
36.将待测样品和抗蛋白质的抗体混合进行免疫共沉淀反应，采用有机溶剂萃取方法分离共沉淀物中小分子代谢物，采用高分辨质谱靶向定量检测所述蛋白质结合的小分子代谢物，当检测到小分子代谢物时，说明小分子代谢物与蛋白质存在相互作用。
37.在本发明中，前期实验数据已表明蛋白和小分子代谢物之间可能存在相互作用，采用本发明的方法进行验证。在本发明实施例中，基于现有技术中提示花生四烯酸(aa)与compass复合物中menin亚基可能存在直接相互作用，本发明以花生四烯酸(aa)与compass复合物中menin亚基为代表说明本发明的鉴定方法。
38.在本发明中，所述蛋白质优选包括内源性蛋白、外源性蛋白或纯化的蛋白质。
39.在本发明中，所述蛋白质优选为内源性蛋白质时，小分子代谢物为内源性小分子代谢物，所述待测样品优选为细胞裂解液。所述细胞裂解液中包含内源性小分子代谢物和内源性蛋白质。本发明对所述细胞裂解液的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞裂解液。在所述高分辨质谱靶向定量检测时，优选还包括检测细胞裂解液和阴性对照组代谢物；所述阴性对照组代谢物为在免疫共沉淀反应时与igg抗体混合进行免疫共沉淀反应后，采用有机物萃取的方法分离的共沉淀物的代谢物。在本发明实施例中，所述细胞为293t细胞。当抗menin的单克隆抗体检测组检测到花生四烯酸时，同时细胞裂解液和阴性对照组代谢物未检测到花生四烯酸，说明细胞中内源性花生四烯酸和内源性menin蛋白存在直接的相互作用。
40.在本发明中，所述蛋白质为外源性蛋白质时，所述待测样品优选为过表达蛋白质的细胞的细胞裂解液。在所述高分辨质谱靶向定量检测时，优选还包括检测过表达蛋白质的细胞的细胞裂解液和阴性对照组代谢物；所述阴性对照组代谢物为在免疫共沉淀反应时与igg抗体混合进行免疫共沉淀反应后，采用有机物萃取的方法分离的共沉淀物的代谢物。外源性蛋白质检测结果的判断方法与内源性蛋白质检测的判断方法一致。
41.在本发明实施例中，过表达menin蛋白的细胞的构建方法，优选为构建含menin基因片段的重组过表达载体；将所述含menin基因片段的重组过表达载体转染细胞，经培养收集细胞。所述构建含menin基因片段的重组过表达载体的方法优选为以preceiver质粒为模板，采用两端带有user特异序列的引物进行pcr扩增，得到两端带有user的pcr扩增产物；将两端带有user的pcr扩增产物通过同源重组方式克隆至pcmv-3tag-1a载体上，经验证得到重组表达载体。所述两端带有user特异序列的引物优选包括核苷酸序列如seq id no:1(taaccaaccctccatttggggctttgcctgacc)所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:2(gtaagtgagttcctctcctcggtagatcttac)所示的反向引物。本发明对所述转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可。本发明对细胞裂解的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞裂解方法即可。在本发明实施例中，通过构建了分别compass复合物的6个亚基的重组表达载体，通过调整质粒转染量后，保证细胞中表达的重组蛋白水平一致或相近。检测结果表明aa特异性地与调控亚基menin蛋白结合，二者的结合水平高出aa与compass其他亚基20余倍，再次证明menin蛋白与aa存在相互作用。
42.在本发明中，所述蛋白质为纯化的蛋白质时，所述待测样品优选为纯化后的蛋白质和目标小分子代谢物的混合物。所述纯化的蛋白质的制备方法优选为将含目标蛋白质基因序列的重组原核表达载体转化原核表达系统中进行重组表达，裂解菌体后，分离纯化重组蛋白。在本发明实施例中，构建含目标蛋白质基因序列的重组原核表达载体的方法优选为利用pet-28a-6
×
his-c原核表达体系构建menin蛋白过表达载体，构建方法同上，得到pet-28a-6
×
his-c-menin重组载体。在本发明中，为了验证花生四烯酸与menin蛋白直接相互作用，而不与其他蛋白相互作用，还构建一种menin蛋白的突变体。所述menin蛋白的突变体的制备方法优选为在pet-28a-6
×
his-c-menin重组载体的基础上，利用quikchange ii xl点突变试剂(quikchange ii xl site-directed mutagenesis kit，agilent)构建含有y323a突变的menin重组质粒。其中meniny323a突变质粒引物优选包括核苷酸序列如seq id no:3(ctgaaagattctcacatttggaatggacccagcgatcacac)所示的正向引物和核苷酸序列如
seq id no:4(gtgtgatcgctgggtccattccaaatgtgagaatctttcag)所示的反向引物。所述培养的方法优选为16℃/180rpm振荡培养后再0.5mm iptg的诱导培养。本发明对所述裂解菌体的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的裂解菌体的方法即可，例如超声处理。本发明对所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的纯化方法即可。在本发明实施例中，使用his-tagged protein purification kit纯化menin蛋白进行纯化。
43.在本发明中，在纯化蛋白和花生四烯酸的混合物中，分别设置了不同浓度(10μm、50μm和100μm)的花生四烯酸混合方案。
44.在本发明中，在所述高分辨质谱靶向定量检测共沉淀物中纯化蛋白作用的小分子代谢物配体时，优选还包括检测纯化蛋白、纯化蛋白的突变体和阴性对照组代谢物；所述阴性对照组代谢物为在免疫共沉淀反应时与igg抗体混合进行免疫共沉淀反应后，采用有机物萃取的方法分离的共沉淀物的代谢物。纯化蛋白质检测结果的判断方法与内源性蛋白质检测的判断方法一致。
45.在本发明中，所述有机溶剂萃取方法优选为将所述共沉淀物经过稀释后与有机溶剂混合，收集有机溶剂相；所述共沉淀物的稀释倍数优选为100倍；稀释后的共沉淀物和有机溶剂的体积比优选为10:3。所述有机溶剂的种类优选根据小分子代谢物的溶解性来确定：当小分子代谢物为脂溶性，有机溶剂优选包括甲醇；当小分子代谢物为水溶性，有机溶剂优选包括乙腈。所述小分子代谢物为花生四烯酸时，选择甲醇进行萃取。
46.在本发明中，所述高分辨质谱靶向定量检测的条件参数优选根据蛋白质的种类确定：当所述蛋白质为menin蛋白时，述高分辨质谱靶向定量检测采用thermoscientific超高效液相色谱仪连接sciex 5600质谱仪进行检测，
47.1)液相色谱条件
48.1)色谱柱：acquity uplc beh c18 column，规格为色谱柱内径2.1mm
×
色谱柱长度100mm，粒径1.7μm；
49.2)流动相：a体积浓度0.1％甲酸-水；b乙腈；
50.3)流速：0.3ml/min；
51.质谱检测采用电喷雾电离(esi)负离子模式进行检测质谱检测；esi源条件如下：离子源气体1:50，离子源气体2:50，curtain gas：25，源温度：400℃(负离子)，离子saparyvoltage floating(isvf)4500v，tof ms扫描范围：100-1200da，产物离子扫描范围：50-1000da，tof质谱扫描累积时间0.2s，乘积离子扫描累积时间0.01s二级质谱采用依赖信息的获取获得，并采用高灵敏度模式，去簇电位(dp)：
±
60v，碰撞能量：35
±
15ev。
52.在本发明中，采用免疫共沉淀技术结合高分辨质谱靶向定量检测技术结合能够快速准确鉴定蛋白质与小分子代谢物配体的直接作用情况，为医药机理研究和蛋白别构调整的研究提供了有效手段。
53.下面结合实施例对本发明提供的一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
54.实施例1
55.利用分子对接(molecular docking)预测aa与menin蛋白的相互作用
56.分子对接主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。首先从pdb数据库中下载menin蛋白三维结构(pdb id:3u84)，从
pubchem数据库下载花生四烯酸(aa)信息及2d结构(pubchem cid:444899)，启动autodock tools软件，将arachidonicacid(aa)加载到坐标窗口，选择结构中的非极性氢原子、芳香碳原子个数、可旋转键等信息，选择menin作为autodock对接的受体分子，选择结构中包含的非键原子、电荷等信息，设置对接的盒子大小、坐标、格点数、格点距离，等待运行完成。
57.分析结果显示，aa与menin结合为正向结合力，提示两者可能存在相互作用，并且tyr232位氨基酸残基为相互作用的关键结合位点(图1)。
58.实施例2
59.细胞内内源性蛋白与内源性代谢物结合的鉴定方法
60.1.培养293t细胞，收集并裂解获得细胞裂解物，具体方法为：去除培养液，用pbs、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100～200μl裂解液的比例加入裂解液(1％np-40、150mm nacl、10mmph 5.9的tris、1mm egta、1mm edta、1.5mm mgcl2、10mm kcl、0.5mm dtt、0.5mm原钒酸钠)。用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1～2秒后，细胞自然裂解。
61.2.取总体积的5％的细胞裂解物作为总蛋白对照(input)，继续向剩余细胞裂解物中按照体积比100：1(即1ml裂解物中加入10μl单克隆抗体)分别加入compass复合物各亚基单克隆抗体(ab)及阴性对照igg抗体，进行内源性蛋白免疫共沉淀(ip)。
62.其中compass复合物包括4个催化亚基分别是：set1a、set1b、mll1及mll2和6个调节亚基，分别是rbbp5、wdr82、cfp1、menin、wdr5及ash2l。抗mll1(cat#14197，1：1000比例稀释使用)，mll2(cat#63735，1：1000比例稀释使用)，wdr5(cat#13105，1：1000比例稀释使用)，ash2l(cat#5019，1：1000比例稀释使用)，rbbp5(cat#13171，1：1000比例稀释使用)，cfp1(cat#40672，1：1000比例稀释使用)，wdr82(cat#99715，1：1000比例稀释使用)，menin(cat#19893，1：1000比例稀释使用)，set1a(cat#61702，1：1000比例稀释使用)，set1b(cat#44922，1：1000比例稀释使用)的抗体均购买至cell signaling technology。
63.3.甲醇萃取共沉淀物中的代谢物，具体为取10μl免疫共沉样品，加入水稀释100倍，于12000rpm离心10min取上清备用；加入300μl甲醇，超声破碎，震提2min，于12000rpm离心10min取上清备用。
64.4.高分辨靶向定量质谱分别检测input溶液、igg共沉淀物(igg阴性对照)及特异抗体共沉淀物(ab ip)中aa的水平。高分辨靶向定量质谱检测的参数条件如下：
65.4.1液相色谱条件
66.本实验所用的仪器为thermoscientific超高效液相色谱仪(u3000)连接sciex 5600质谱仪。具体参数如下：
67.1)色谱柱：acquityuplc beh c18 column(2.1mm(色谱柱内径)
×
100mm(色谱柱长度)，粒径1.7μm)；
68.2)流动相：a 0.1％甲酸-水；b乙腈；
69.3)流速：0.3ml/min；
70.4.2质谱检测条件
71.采用电喷雾电离(esi)负离子模式进行检测。esi源条件如下：离子源气体1(气体1):50，离子源气体2(气体2):50、幕气(cur):25，源温度：400℃(负离子)，离子saparyvoltage floating(isvf)4500v，tof ms扫描范围：100～1200da，产物离子扫描范
围：50～1000da，tof质谱扫描累积时间0.2s，乘积离子扫描累积时间0.01s二级质谱采用依赖信息的获取获得，并采用高灵敏度模式，去簇电位(dp)：
±
60v，碰撞能量：35
±
15ev。
72.实验结果显示，menin蛋白特异性地与aa结合，而compass复合物其他亚基与aa不存在结合(图2)。
73.实施例3
74.细胞内外源性蛋白与代谢物结合的鉴定方法
75.1.利用pcmv-3
×
flag-c载体分别构建compass复合物6个功能调控亚基的过表达载体，具体步骤如下：
76.从genecopoeia公司购买包含基因全长编码序列(coding sequence，cds)的过表达载体preceiver质粒，由于本实施例中所涉及的过表达实验均由课题组自行构建至pcmv-3tag-1a质粒上，故首先以genecopoeia公司购买的preceiver质粒为dna模板进行扩增。
77.设计在两端带有user特异序列的引物，利用高保真酶将pik3ca编码区扩增并在两端带有user特异序列。配制扩增体系如下：模板preceiver：2μl，turbo cx：1μl，10
×
pfu turbo cxbuffer：5μl，dmso：3μl，dntp(10μm)：1μl，正反向引物：0.5μl，ddh2o 40：μl，pcr反应条件：95℃2min；95℃3min，54℃30s，68℃6min(每kb延伸时间为2min)，35个循环；72℃10min；4℃10min。
78.其中涉及的引物序列如下：
79.menin(5
’‑3’
):
80.f:taaccaaccctccatttggggctttgcctgacc(seq id no:1)；r:gtaagtgagttcctctcctcggtagatcttac(seq id no:2)；
81.rbbp5(5
’‑3’
):
82.f:accaaaacaaacaaaaagttgcaagtttccagagt(seq id
83.no:5)；
84.r:gtaaaaacagaggggctgtgcgagaggtggtggg(seq id no:6)；
85.wdr82(5
’‑3’
):
86.f:gtttttgccttctttccctcttgtagggaaacct(seq id no:7)；r:gacccatcagtgcattaatcatttcagtaacaa(seq id no:8)；cfp1(5
’‑3’
):
87.f:gcttcaataggggaaggaggggagtggcccaatg(seq id no:9)；
88.r:ttacatttataaaaccttaaatagtaaactgtaa(seq id no:10)；wdr5(5
’‑3’
):
89.f:ttgtccctgtgttttaactctgcttacagaatggcagtta(seq id no:11)；
90.r:tgttgccatgaccttgctctactgaaccacaag(seq id no:12)；ash2l(5
’‑3’
):
91.f:gcccaacatgtcgtgcacgggcactgcgacg(seq id no:13)；
92.r:tcatctggagaggagtttgctgattgggtagaa(seq id no:14)。
93.pcr反应结束后利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(北京天根生化科技，dp208)进行胶回收，20μl ddh2o洗脱溶解pik3ca(或pik3r2)cds片段。利用xbai和nt.bbvci限制性内切酶对pcmv-3tag-1a质粒进行酶切，胶回收，40μl ddh2o洗脱，获得带有user粘性末端线性载体。将pik3ca(或pik3r2)cds片段与pcmv-3tag-1a线性载体进行连接，连接体系如下：cds片段：6μl，pcmv-3tag-1a线性载体：2μl，cutsmartbuffer：1μl，user酶：1μl。37℃30min，25℃1h。将连接产物转化、涂板、挑取单克隆菌株、测序鉴定，获得重组质粒。
94.2.过表达载体转染293t细胞，48小时收集并裂解细胞，使用anti-flag agarose beads进行免疫共沉淀，具体步骤如下：
95.首先，实验室自配免疫共沉淀缓冲液(ip buffer)：1.25ml 50mm tris-hcl(ph＝7.5)、50μl1mm edta(ph＝8.0)、750μl 150mm nacl、2.5ml glycerol、25μlnp-40、250μl 100mm pmsf、500μl 50mm pic、1.25ml 1m naf、20μl100 mmβ-glycerophosphate、17.5ml ddh2o，配制25ml ip buffer。
96.质粒转染48h后的细胞，pbs清洗2遍，使用细胞刮刀将细胞刮落，3500rpm离心10min，弃上清，加入1ml ip buffer将细胞吹打混匀，冰上裂解15min，70％功率比超声30s，12,000rpm，4℃离心10min，将上清转移至新ep管中，弃沉淀；吸取100μl至一新ep管中，即为input lysate；后续若进行特异性抗体免疫共沉淀，则向lysis buffer中加入适量特异性一抗，4℃旋转过夜；将proteina/g magnetic beads以5:1比例混匀，使用ip buffer洗涤3次，每次3,000rpm离心2min；向lysis buffer中加入适量proteina/gmagnetic beads，继续在4℃旋转4h；若进行标签蛋白(tag)免疫共沉淀，则向lysis buffer中加入适量已洗涤好的免疫琼脂糖珠，4℃旋转至少4h；3,500rpm，4℃离心3min，弃上清，使用ip buffer洗涤3次，操作类似洗涤beads，加入适量2
×
loading buffer，混匀，95℃煮8min，12,000rpm，4℃离心10min，取上清加样进行蛋白印迹分析。
97.由于每个质粒大小不一致，会出现转染效率和表达效率的差异，通常来说，质料长度越短，转染效率和表达效率则越高，反之则越低。每个过表达载体在细胞内的表达效率不同，首先通过wb条带灰度值调整质粒转染量，具体为rbbp5：2.00μg/107细胞、wdr82：1.28μg/107细胞、cfp1：1.78μg/107细胞、menin：2.23μg/107细胞、wdr5：1.44μg/107细胞、ash2l：2.88μg/107细胞。
98.最终使ip实验中flag beads所沉淀的每个亚基蛋白量保持一致，这样就可以在相同亚基蛋白量的基础上比较其所结合的aa水平差异。之后利用甲醇萃取共沉淀物中的代谢物，质谱检测aa的水平。过表达蛋白共沉淀实验结果显示，aa特异性地与调控亚基menin蛋白结合，二者的结合水平高出aa与compass其他亚基20余倍，再次证明menin蛋白与aa存在相互作用(图3)。
99.实施例4
100.细胞外纯化的蛋白与代谢物结合的鉴定方法
101.利用pet-28a-6
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his-c原核表达体系构建menin蛋白过表达载体，构建方法与实施例3中的真核细胞过表达载体方法相同，引物序列也相同，得到pet-28a-6
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his-c-menin重组载体。
102.突变蛋白的制备方法：在pet-28a-6
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his-c-menin重组载体基础上，利用quikchange ii xl点突变试剂(quikchange ii xl site-directedmutagenesis kit，agilent)构建含有y323a突变的menin重组质粒。
103.quikchange点突变体系如下：模板质粒：1μl，turbo：1μl，10
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pfu turbo cxbuffer：5μl，dmso：3μl，dntp(10μm)：1μl，meniny323a突变用正反向引物：0.5μl，ddh2o：39μl。pcr反应条件：94℃2min；94℃3min，60℃1min，68℃14min，18个循环；60℃7min；4℃10min。其中meniny323a突变用引物：
104.f:ctgaaagattctcacatttggaatggacccagcgatcacac(seq id no:3)；
105.r:gtgtgatcgctgggtccattccaaatgtgagaatctttcag(seq id no:4)。
106.pcr反应结束后向体系中加入1μl限制性核酸内切酶dpnⅰ，37℃反应1h，取10μl加入至100μl dh5α感受态细胞中，转化、涂板、挑取单克隆菌株、测序鉴定。
107.将上述构建重组表达载体分别转化dh10bac大肠杆菌，0.5mm iptg/16℃/180rpm摇床过夜诱导menin蛋白表达，超声裂解菌体，使用his-tagged protein purification kit纯化menin蛋白，将纯化后的蛋白上样sds-page胶，将特异性条带送质谱鉴定明确为menin蛋白。
108.向menin纯化蛋白中加入外源aa，37℃孵育6小时，随后向反应体系中分别加入igg或menin抗体，进行体外蛋白ip实验，甲醇萃取共沉淀物中的代谢物，高分辨质谱靶向定量检测menin蛋白所结合的aa。实验结果显示，纯化menin蛋白与aa存在相互作用(图4)。
109.实施例5
110.利用微量热泳动技术(mst)验证aa与menin的相互作用
111.menin蛋白作为target，按照monolith protein labeling kit red-nhs 2nd generation kit的标记试剂盒说明书要求的流程标记menin蛋白。10μl梯度稀释的非标记分子(ligand/aa)和10μl固定浓度的标记分子(target/menin)混合后静置反应5min，混合的样品装载到玻璃毛细管中，然后通过monolithnt.115设备进行检测分析。mst一般认为，软件可自动拟合曲线且信噪比》5的情况下数据可信。kd值表示ligand分子结合50％target分子时，ligand分子的浓度。kd值越小，说明亲和力越大。mst实验结果显示，aa与menin蛋白结合kd＝28
±
16μmlo/l，提示aa与menin的结合力较强(图5)。
112.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测样品和抗蛋白质的抗体混合进行免疫共沉淀反应，采用有机溶剂萃取方法分离共沉淀物中小分子代谢物，采用高分辨质谱靶向定量检测所述蛋白质结合的小分子代谢物，当检测到小分子代谢物时，说明小分子代谢物与蛋白质存在相互作用。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述蛋白质包括内源性蛋白、外源性蛋白或纯化的蛋白质。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述蛋白质为内源性蛋白质时，所述待测样品为细胞裂解液。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，在所述高分辨质谱靶向定量检测时，还包括检测细胞裂解液和阴性对照组代谢物；所述阴性对照组代谢物为在免疫共沉淀反应时与igg抗体混合进行免疫共沉淀反应后，采用有机物萃取的方法分离的共沉淀物的代谢物。5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述蛋白质为外源性蛋白质时，所述待测样品为过表达蛋白质的细胞的细胞裂解液。6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述蛋白质为纯化的蛋白质时，所述待测样品为纯化后的蛋白质和目标小分子代谢物的混合物。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述有机溶剂萃取方法为将所述共沉淀物经过稀释后与有机溶剂混合，收集有机溶剂相；所述共沉淀物的稀释倍数为100倍；稀释后的共沉淀物和有机溶剂的体积比为10:3。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述有机溶剂的种类根据小分子代谢物的溶解性来确定：当小分子代谢物为脂溶性，有机溶剂包括甲醇；当小分子代谢物为水溶性，有机溶剂包括乙腈。9.根据权利要求1或8所述方法，其特征在于，所述小分子代谢物为花生四烯酸。10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述高分辨质谱靶向定量检测的条件参数根据蛋白质的种类确定：当所述蛋白质为menin蛋白时，述高分辨质谱靶向定量检测采用thermoscientific超高效液相色谱仪连接sciex 5600质谱仪进行检测，1)液相色谱条件1)色谱柱：acquity uplc beh c18 column，规格为色谱柱内径2.1mm
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色谱柱长度100mm，粒径1.7μm；2)流动相：a体积浓度0.1％甲酸-水；b乙腈3)流速：0.3ml/min；质谱检测采用电喷雾电离(esi)负离子模式进行检测；esi源条件如下：离子源气体1:50，离子源气体2:50，curtain gas：25，源温度：400℃(负离子)，离子saparyvoltage floating4500v，tof ms扫描范围：100-1200da，产物离子扫描范围：50-1000da，tof质谱扫描累积时间0.2s，乘积离子扫描累积时间0.01s二级质谱采用依赖信息的获取获得，并采用
高灵敏度模式，去簇电位(dp)：
±
60v，碰撞能量：35
±
15ev。

技术总结
本发明提供了一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法，属于生物医药技术领域。一种快速鉴定与蛋白相互作用的小分子代谢物配体的方法，将待测样品和抗蛋白质的抗体混合进行免疫共沉淀反应，采用有机溶剂萃取方法分离共沉淀物中小分子代谢物，采用高分辨质谱靶向定量检测所述蛋白质结合的小分子代谢物，当检测到小分子代谢物时，说明小分子代谢物与蛋白质存在相互作用。本发明的方法具有快速准确的特点，并且可实现高通量的检测，能够满足大批量筛选与靶标蛋白具有相互作用的代谢物，为验证小分子代谢物与蛋白质的相互作用提供了有效手段，并且小分子代谢物作为别构剂调控蛋白的结构，从而为蛋白的别构调控提供新手段。新手段。新手段。


技术研发人员：张斌 何宝玉 闫玉刚 别庆丽 赵柔 王森 田东兴
受保护的技术使用者：济宁医学院附属医院
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/20