用于乳腺癌诊断或预后评估的标志检测物及其用途、试剂盒及靶向抑制剂

1.本公开涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种用于乳腺癌诊断或预后评估的标志检测物及其用途、试剂盒及靶向抑制剂。


背景技术：

2.乳腺癌死亡率和发病率高，严重危害女性生命健康，给家庭和社会带来沉重负担，且每年新发病例高达230万例，占所有新增恶性肿瘤的11.7％，已成为全球发病率最高的恶性肿瘤。自九十年代以来，我国乳腺癌发病率的增长速度高达全球2倍，远超欧美国家，并呈现发病年龄早、确诊时间晚、并发症多、预后生存差的问题。
3.其中，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，本公开中简称为tnbc)是er、pr和her2表达均为阴性的乳腺癌，约占乳腺癌病例的15％至20％，tnbc是最具挑战性的乳腺癌亚型，具有发病年龄小、恶性程度高、复发转移迅速等特点，患者起病时肿瘤负荷较重，较早出现淋巴结累及。在治疗过程中，tnbc的肿瘤生物学行为和药物敏感性不同，且对内分泌治疗和抗her2靶向治疗均不敏感，患者化疗疗效不一，患者对化疗耐药和预后不理想。因此，tnbc发生发展和耐药的分子机制尚不清楚，诊断与治疗难题亟待解决。
4.另一方面，以蒽环类和紫杉类药物为基础的化疗仍然tnbc标准治疗手段，但有效性性差影响预后，且患者经常出现化疗耐药。顺铂是第一代的铂类化疗药的代表性药物，是第一款合成铂类抗癌药物，也是目前临床上应用最多的化疗药物之一。目前，含铂治疗方案是tnbc治疗中常用的一种方案，在tnbc新辅助治疗及晚期治疗中均显示出较好的疗效。但临床治疗过程中出现的铂类药物耐药问题及其不良反应，严重影响了铂类药物的疗效，并限制其临床应用。
5.综上所述，目前缺少对于三阴性乳腺癌预后诊断和评估的方法，而且从治疗方面，铂类药物耐药问题及其不良反应，也需要得到解决。


技术实现要素：

6.本公开的目的在于解决现有技术中存在的问题至少之一，更确切地，本公开旨在提供一种用于乳腺癌诊断或预后评估的标志检测物，及这种标志检测物的具体应用方式，以及一种用于乳腺癌诊断或预后评估的试剂盒。同时，基于与上述标志检测物相同的研究思路，本公开提供了一种靶向抑制剂，以期解决铂类药物的耐药问题。
7.具体的，本公开第一方面提供了一种用于乳腺癌诊断或预后评估的标志检测物，这种标志检测物包括用于检测klhl29基因或其编码蛋白的表达水平的引物。
8.可选的，这种标志检测物包括一对特异性扩增引物：
9.上游引物(f)：5
’‑
gcagagcgaaagcgtttacag-3’10.下游引物(r)：5
’‑
gcaggttcgacaggacgag-3’。
11.kelch家族蛋白成员klhl29在乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌中发挥抑癌基因作用，
可以抑制三阴性乳腺癌增殖、迁移及侵袭，同时klhl29低表达提示不良预后，可以作为三阴性乳腺癌的新的治疗靶点及预后标志物；鉴于上述，本公开第一方面提供一种标志检测物，能够有效地检测预后标志物——klhl29。可以基于其检测结果获得对于三阴性乳腺癌诊断以及预后评估的重要参考。
12.本公开第二方面提供了上述标志检测物用于制备检测试剂的用途，其中，这种检测试剂用于选自如下一种或多种用途：
13.用于预测抗乳腺肿瘤药物化疗耐药和预后，
14.用于改善抑制剂与抗乳腺肿瘤药物的联合用药。
15.可选的，通过检测试剂检测klhl29基因或其蛋白的表达水平，根据所述表达水平预测抗乳腺肿瘤药物的化疗耐药和预后，其中，较低的所述表达水平提示不良预后。
16.可选的，通过检测试剂检测klhl29基因或其蛋白的表达水平，根据表达水平调控抑制剂用量，以改善抑制剂与抗乳腺肿瘤药物的联合用药。
17.在上述用途中，乳腺肿瘤具体包括乳腺癌及其亚型，尤其是三阴性乳腺癌；抗乳腺肿瘤药物包括铂类药物，尤其是顺铂。
18.本公开第三方面提供一种用于乳腺癌诊断或预后评估的试剂盒，包括盒体，以及如前述第一方面或其可选方案中所描述的标志检测物。
19.可选的，试剂盒中还包括如下试剂中的一种或多种：
20.胃蛋白酶、组织固定液、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、sabc-pod、生物素化过氧化物酶、depc、3％柠檬酸、2
×
ssc、0.5
×
ssc、0.2
×
ssc、原位杂交用pbs。
21.鉴于前述klhl29在三阴性乳腺癌中发挥抑癌基因作用的特征，进一步的，klhl29可以通过促进cul3介导的ddx3x的泛素化，进而导致细胞周期阻滞影响三阴性乳腺癌功能，由此，本公开第四方面提供一种靶向klhl29介导的信号通路的抑制剂，该抑制剂能够与抗乳腺肿瘤药物联合用药，用以改善三阴性乳腺癌治疗过程中抗乳腺肿瘤药物的耐药问题。
22.其中，上述抑制剂包括klhl29的相互作用蛋白ddx3x的抑制剂rk33。适用的抗乳腺肿瘤药物为顺铂。铂类药物与ddx3x的特异性小分子抑制剂rk33具有药物协同作用，可以显著抑制三阴性乳腺癌的肿瘤生长，为三阴性乳腺癌患者提供新的治疗选择。
23.通过上述各方面的方案，本公开至少具有如下优点有益效果：
24.首先，本公开明确了klhl29及其相互作用蛋白ddx3x在三阴性乳腺癌发生发展中的作用及分子机制，同时聚焦其临床转化价值，发现三阴性乳腺癌的潜在药物治疗靶点，并靶向目的基因参与的机制应用抑制剂进行临床转化，为乳腺癌治疗靶点的选择提供理论依据并为三阴性乳腺癌患者提供新的治疗选择。
25.具体而言，利用klhl29基因作为乳腺癌诊断或预后评估的标志物，并提供了对应的一种标志检测物，这是一种分子标志检测物，能够有效地检测klhl29基因的表达水平，可以基于其检测结果获得对于三阴性乳腺癌诊断以及预后评估的重要参考。
26.其次，对于上述标志检测物的应用，基于上述标志检测物形成检测试剂或者试剂盒，作为诊断和治疗乳腺癌，及其预后评估提供了辅助工具。具体而言，能够在治疗过程中预测抗乳腺肿瘤药物化疗耐药和预后，能够调控联合用药中抑制剂的用量，改善对于抗乳腺肿瘤药物的耐药性。
27.此外，以klhl29基因作为靶点，提供的靶向药物、靶向klhl29介导的信号通路的抑制剂，改善了抗肿瘤药物有效性差、化疗耐药和预后差的问题，有效解决了乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌，缺少治疗药物靶点、缺少有效治疗药物问题。
附图说明
28.结合附图并参考以下详细说明，本公开各实施例的上述和其他特征、优点及方面将变得更加明显。在附图中，相同或相似的附图标记表示相同或相似的元素，其中：
29.图1为本公开中涉及的在tnbc癌组织中klhl29基因表达情况图；
30.其中，a为klhl29在fuscc-tnbc rna-seq队列中360例癌组织和88例癌旁组织的差异表达情况；b为klhl29在fuscc-tnbc rna-seq队列中88例配对癌与癌旁组织的差异表达情况；c为klhl29在tcga-tnbc rna-seq队列中169例癌组织和113例癌旁组织的差异表达情况；d为klhl29在tcga-tnbc rna-seq队列中13例配对癌与癌旁组织的差异表达情况。
31.图2为本公开中涉及的tnbc组织样本的免疫组织化学染色及生存分析图；
32.其中，a为根据pam50分型，klhl29表达与基底样亚型乳腺癌中总生存的关系；b为根据pam50分型，klhl29表达与基底样亚型乳腺癌无复发生存的关系；c为根据st gallen分型，klhl29表达与基底样亚型乳腺癌中无复发生存的关系；d为根据st gallen分型，klhl29表达与基底样亚型乳腺癌无复发生存的关系；e为收集91例tnbc样本石蜡切片进行klhl29免疫组化染色分析，图示不同免疫组化评分的代表性图片；f为根据klhl29免疫组化评分对样本进行高低表达分组，评估klhl29表达在tnbc中与总生存的关系；g为根据klhl29免疫组化评分对样本进行高低表达分组，评估klhl29表达在tnbc中与无复发生存的关系。
33.图3为本公开中涉及的klhl29对tnbc增殖能力、克隆能力和凋亡能力影响；
34.其中，a为cck-8实验检测过表达klhl29对bt549细胞增殖能力的影响；b为cck-8实验检测过表达klhl29对cal51细胞增殖能力的影响；c为平板克隆实验检测klhl29过表达对bt549和cal51细胞克隆形成能力的影响；d为平板克隆实验数据统计图；e为流式细胞实验检测过表达klhl29对bt549和cal51细胞凋亡能力的影响；f为细胞凋亡实验数据统计图。
35.图4为本公开中涉及的裸鼠原位移植瘤模型评估klhl29对tnbc体内生长影响分析图；
36.其中，a为利用稳定过表达klhl29的mda-mb-231细胞构建裸鼠原位移植瘤模型，瘤体展示图；b为过表达实验组(klhl29)与对照组(pcdh)的瘤体体积变化曲线；c为过表达实验组(klhl29)与对照组(pcdh)的瘤体质量统计图；d为利用稳定敲低klhl29的mda-mb-231细胞构建裸鼠原位移植瘤模型，瘤体展示图；e为敲低实验组(sh-klhl29)与对照组(shnc)的瘤体体积变化曲线；f为敲低实验组(sh-klhl29)与对照组(shnc)的瘤体质量统计图。
37.图5为本公开中涉及的蛋白免疫共沉淀实验结合质谱分析鉴定klhl29相互作用蛋白；
38.其中，a为鉴定klhl29的相互作用蛋白的流程；b为韦恩图呈现bt549及cal51细胞质谱分析结果；c为在bt549和cal51中均与klhl29存在相互作用关系的候选蛋白。
39.图6为本公开中涉及的ddx3x在tnbc中的表达和预后情况图；
40.其中，a为ddx3x在fuscc-tnbc蛋白质组学队列中84例癌组织和69例癌旁组织的差异表达情况；b为ddx3x在cptac队列中28例tnbc亚型与91例非tnbc亚型乳腺癌的差异表达
情况；c为ddx3x在cptac队列中29例基底样亚型与93例非基底样亚型乳腺癌的差异表达情况；d为收集91例tnbc石蜡切片，进行ddx3x的免疫组化染色分析，图示不同免疫组化评分的代表性图片；e为根据ddx3x免疫组化评分对样本进行高低表达分组，分析ddx3x表达在tnbc中与总生存的关系；f为根据ddx3x免疫组化评分对样本进行高低表达分组，分析ddx3x表达在tnbc中与无复发生存的关系。pt：癌旁组织，t：癌组织。
41.图7为本公开中涉及的在蛋白免疫沉淀中klhl29与ddx3x相互作用关系图；
42.其中，a为在hek293t细胞中外源性瞬转flag-klhl29和myc-ddx3x质粒，使用flag标签抗体进行外源性蛋白免疫共沉淀实验，检测myc-ddx3x和flag-klhl29蛋白的表达；b为在hek293t细胞中外源性瞬转myc-ddx3x和flag-klhl29质粒，使用myc标签抗体进行外源性蛋白免疫共沉淀实验，检测flag-klhl29和myc-ddx3x蛋白的表达；c为klhl29截断体结构示意图；d为在hek293t细胞中外源性过表达myc-ddx3x和flag-klhl29截断体(aa 1
–
328，aa 1-401，aa 329-584和aa 585-875)，使用flag标签抗体进行外源性蛋白免疫共沉淀实验，检测flag-klhl29截断体和myc-ddx3x蛋白的表达，确定klhl29与ddx3x结合的结构域。e为在bt549和cal51细胞中外源性过表达myc-ddx3x和flag-klhl29质粒，应用flag标签抗体和myc标签抗体进行免疫荧光实验。
43.图8为本公开中涉及的在蛋白免疫印迹实验中ddx3x的小分子抑制剂rk33对ddx3x表达的作用图(a和b),本公开中涉及的在流式细胞实验中ddx3x的小分子抑制剂rk33对细胞周期的作用图(c和d)；
44.图9为本公开中涉及的klhl29和ddx3x表达水平与tnbc对小分子抑制剂rk33的药物敏感性的关系图；
45.图10为本公开中涉及的在cck-8增殖实验中rk33抑制剂与顺铂在tnbc中的联药效果图。
46.其中，a、b、c、d分别为mda-mb-231人乳腺癌细胞系、sum159pt人乳腺癌细胞、bt459人乳腺癌细胞、cal51人乳腺癌细胞系，单独或联合使用ddx3x的小分子抑制剂rk33与顺铂的生长曲线图。
47.图11为本公开中涉及的在裸鼠体内荷瘤实验中rk33与顺铂对tnbc体内生长的作用图；
48.其中，a为瘤体大小比对图，b为瘤体重量柱形图，c为移植后24天中瘤体体积变化折线图，d为移植后24天中体重变化折线图。
具体实施方式
49.为使本公开实施例的目的、实施例和优点更加清楚，下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开中的实施例进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的全部其他实施例，都属于本公开保护的范围。
50.本公开基于多例三阴性乳腺癌患者的转录组数据及癌症基因组图谱(tcga)公共数据库，筛选出在三阴性乳腺癌中显著低表达且与预后相关的基因klhl29。随后通过定量聚合酶链反应(qpcr)、蛋白免疫印迹(western blot)、免疫组织化学、cck8细胞增殖实验、transwell迁移侵袭实验、流式细胞实验、免疫共沉淀实验(co-ip)、裸鼠脂肪垫成瘤实验等
体内、外实验，探究该蛋白在三阴性乳腺癌发生发展中的生物学功能及潜在机制；本公开的发明人首次发现了kelch家族蛋白成员klhl29在三阴性乳腺癌中发挥抑癌基因作用，可以抑制三阴性乳腺癌增殖、迁移及侵袭，同时klhl29低表达提示不良预后，可以作为三阴性乳腺癌的新的治疗靶点及预后标志物；由此，针对性的开发出一种针对上述标志物——klhl29的标志检测物。
51.此外，本公开的发明人经过研究获悉，klhl29可以通过促进cul3介导的ddx3x的泛素化，进而导致细胞周期阻滞影响三阴性乳腺癌功能；进一步地，鉴于铂类药物与ddx3x的特异性小分子抑制剂rk33具有药物协同作用，可以显著抑制三阴性乳腺癌的肿瘤生长，为三阴性乳腺癌患者提供新的治疗选择，klhl29与ddx3x的表达情况可以作为患者疗效的预测标志物，有助于患者化疗方案的选择和化疗效果的评估。
52.有鉴于此，本公开旨在提供一种klhl29基因或其编码蛋白的表达水平的分子标志检测物、以及检测试剂，以及有关于klhl29基因在制备用于辅助诊断乳腺肿瘤产品中的应用，同时，提供了一种靶向klhl29介导的信号通路的抑制剂，为开发三阴性乳腺癌的新型用药方案奠定了理论基础。此外，提供一种新型的三阴性乳腺癌的联合用药方案，可以改善顺铂耐药问题，为三阴性乳腺癌患者提供新的治疗选择。
53.如图1所示，利用某癌症中心前期建立的大规模tnbc多组学队列(fuscc-tnbc)进行生物信息学挖掘，对tnbc原发灶和癌旁组织的转录组数据分析，并结合肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas program，tcga)乳腺癌队列中的tnbc数据，筛选出在tnbc癌组织中低表达的基因klhl29；证明了klhl29基因是tnbc癌组织中的低表达基因，证实了可作为治疗靶点。
54.如图2所示，使用kaplan-meier plotter在线数据库进行生存分析，并进一步收集tnbc组织样本进行免疫组织化学染色及生存分析，以明确klhl29的预后价值。
55.为了验证klhl29对tnbc细胞生物学表型的影响，如图3所示，通过cck-8增殖实验和平板克隆实验检测klhl29对tnbc增殖能力和克隆形成能力的影响，通过流式细胞实验检测klhl29对tnbc凋亡能力的影响；从图3的a，b图中可知在bt549、cal51的癌细胞系中，klhl29基因介导的细胞活性更强。
56.图4则示出了通过裸鼠原位移植瘤模型评估klhl29对tnbc体内生长的影响。
57.为了验证klhl29与ddx3x的相互作用关系，应用蛋白质免疫共沉淀实验结合质谱分析鉴定klhl29的相互作用蛋白，其结果如图5所示。进一步地，如图6所示，利用fuscc-tnbc队列中tnbc原发灶和癌旁组织的蛋白质组学数据进行差异表达分析，应用临床蛋白质组肿瘤分析协作组(clinical proteomic tumor analysis consortium，cptac)蛋白质组学数据分析ddx3x在不同乳腺癌亚型间的表达情况，明确ddx3x在tnbc中的表达情况。
58.通过蛋白质免疫共沉淀实验验证klhl29与ddx3x的相互作用关系，结果如图7所示。
59.为了探索klhl29与ddx3x的临床转化价值，通过western blotting实验检测ddx3x的小分子抑制剂rk33抑制ddx3x表达的作用，结果如图8所示；通过药敏实验检测klhl29和ddx3x表达水平与tnbc对小分子抑制剂rk33的药物敏感性的关系，结果如图9所示。
60.进一步地，通过cck-8增殖实验检测rk33与顺铂在tnbc中的联药效果，其实验结果如图10所示。通过裸鼠体内荷瘤实验探索rk33与顺铂对tnbc体内生长的作用，其结果如图
11所示。
61.基于上述研究成果和实验结果，如下提供一种分子标志检测物的实施例。
62.本例中的分子标志检测物包括用于检测klhl29基因或其编码蛋白的表达水平的引物，在一个典型的实施例中，包括一对特异性扩增引物：
63.上游引物(f)：5
’‑
gcagagcgaaagcgtttacag-3’64.下游引物(r)：5
’‑
gcaggttcgacaggacgag-3’。
65.本公开同时提供klhl29的相互作用蛋白，ddx3x的标志检测物。
66.本公开同时提供多种上述用于检测klhl29基因或其编码蛋白的表达水平的标志检测物的多种应用方法。
67.在一个实施例中，上述用于检测klhl29基因或其编码蛋白的表达水平的标志检测物用于制备一种检测试剂，该检测试剂用于选自如下一种或多种用途：
68.用于预测抗乳腺肿瘤药物化疗耐药和预后，
69.用于改善抑制剂与抗乳腺肿瘤药物的联合用药。
70.根据本公开的实施方式，在上述实施例中，检测试剂检测klhl29基因或其蛋白的表达水平，根据表达水平预测抗乳腺肿瘤药物的化疗耐药和预后，其中，较低的表达水平提示不良预后。
71.根据本公开的实施方式，在上述实施例中，通过检测试剂检测人乳腺肿瘤组织样本的klhl29基因或其蛋白的表达水平，根据表达水平调控抑制剂用量，以改善抑制剂与抗乳腺肿瘤药物的联合用药。
72.上述检测试剂用途的实施方式中，乳腺肿瘤具体包括乳腺癌及其亚型，尤其是三阴性乳腺癌；抗乳腺肿瘤药物包括铂类药物，尤其是顺铂。
73.本公开提供一种用于乳腺癌诊断或预后评估的试剂盒的实施例，包括盒体，以及如前述实施例中所描述的的标志检测物。
74.可选的，试剂盒中还包括如下试剂中的一种或多种：
75.胃蛋白酶、组织固定液、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、sabc-pod、生物素化过氧化物酶、depc、3％柠檬酸、2
×
ssc、0.5
×
ssc、0.2
×
ssc、原位杂交用pbs。
76.在优选的实施方式中，上述试剂盒除了各种引物外，还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、孔板或板条的限定空间，该容器例如是试剂盒、药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本公开中用于检测klhl29基因或其编码蛋白表达程度的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频app下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如cd、u盘、网盘等。
77.根据本公开的实施方式，上述试剂盒以人乳腺肿瘤组织样本作为测试样本。
78.在本公开的一个实施例中，提供一种有关klhl29基因或其编码蛋白的用途：用于构建一种三阴性乳腺癌的预后评估模型，预后评估模型通过编程、并以数学软件包形式被输入至计算机或基因检测仪。
79.在优选实施例中，预后评估模型能够输出三阴性乳腺癌的预后评估参考值，当klhl29基因或其蛋白的表达水平较低时，预后评估模型输出表示不良预后的参考值。
80.应理解，上述预后评估模型的建模、训练、编程及各步骤中应用的参数、权重值等，均可由技术人员基于本公开实施例的技术思想，依托现有技术完成，其中具体的建模、训练、编程方式及细节并非本技术的发明重点，受限于篇幅不再赘述。
81.在本公开的一个实施例中，提供配置有上述预后评估模型的计算机或基因检测仪。
82.在一个典型实施例中，上述计算机或基因检测仪具有：
83.数据获取模块，配置为采集样本中klhl29基因或其蛋白的表达水平，并且以数字化的形式将上述表达程度记录或输出至其他模块。上述采集样本选用人乳腺肿瘤组织样本。
84.运算模块，能够执行预后评估模型，并基于klhl29基因或其蛋白的表达水平，评估受检测者的三阴性乳腺癌预后，并且评估与铂类药物联合用药。
85.存储模块，用于保存上述表达程度的数据和运算模块产生的预后评估参考值等数据。
86.上述计算机或基因检测仪还可以具有手动输入装置，如键盘、摄像头等，以及显示装置，用于显示评估结果，如显示屏等。还可以包括必要的总线、收发器、存储器等。
87.在本公开的一个实施例中，提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时能够运行上述预后评估模型。
88.本公开还包括一种靶向klhl29介导的信号通路的抑制剂的实施例，该抑制剂能够与抗乳腺肿瘤药物联合用药，用以改善所述抗乳腺肿瘤药物的耐药问题。
89.在优选实施方式中，抑制剂包括klhl29的相互作用蛋白ddx3x的抑制剂rk33，其适用的乳腺肿瘤为三阴性乳腺癌，所述抗乳腺肿瘤药物为顺铂。
90.本公开还包括一种以klhl29为靶点的靶向药物。
91.前文中涉及的各实验的具体实验方法：
92.如下涉及的各种试剂、仪器或设备均可由市场购得和获得。
93.试剂、软件与设备：
94.95.96.[0097][0098]
一、细胞培养实验
[0099]
细胞系在含有10％胎牛血清、5％双抗的dmem或rpmi1640培养基中培养，胰岛素按需添加。细胞在37℃、5％ co2的细胞培养箱中培养。
[0100]
1、细胞复苏
[0101]
预热37℃水浴锅，将需要复苏的细胞从-80℃冰箱或液氮罐中取出来，放置在飘板上并置于37℃水浴锅中快速融化，融化后将冻存管800rpm，4min离心，弃掉上清，应用完全培养基(含fbs)重悬细胞，并将细胞悬液加入到添加8ml完全培养基的10cm细胞培养皿中。
[0102]
2、细胞传代
[0103]
细胞在密度为80％-90％时需要进行传代处理，首先吸弃全部培养基，加入1-2ml灭菌后的pbs润洗，弃掉pbs，加入适量胰酶，待细胞变圆脱落后，应用完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至5ml离心管中800rpm，4min离心，弃掉上清，应用1ml完全培养基重悬细胞，并将细胞悬液加入到添加8ml完全培养基的10cm细胞培养皿中完成传代或进行铺板做细胞功能实验。
[0104]
3、细胞冻存
[0105]
将细胞消化离心后弃掉上清，应用适量冻存液重悬细胞并转移至冻存管中，做好标记后，置于-80℃冰箱或液氮罐中长期保存。
[0106]
二、细胞功能实验
[0107]
1、cck-8增殖实验
[0108]
将待处理细胞胰酶消化、完全培养基终止消化、离心、1ml培养基重悬后计数。计数过程中，准备96孔板，向96孔板周围的孔中滴加200μl pbs。计数完成后，根据计数情况，配置细胞悬液，使每100μl悬液中包含1500-2500个细胞，应用排枪向96孔板的每个孔中加入100μl细胞悬液，设置6个副孔。铺板后的第一天至第五天，在每天的固定时间向96孔板中加入10μl cck-8试剂，37℃孵育1-4小时，测定450nm处的吸光度评估细胞的增殖能力。
[0109]
2、平板克隆实验
[0110]
应用胰酶消化待处理细胞、使用完全培养基终止消化、离心、1ml培养基重悬后计数。计数过程中，准备六孔板，向六孔板周围滴加pbs，向六孔板每个孔中加入2ml完全培养基。计数完成后，根据计数情况，配置细胞悬液，使每100μl悬液中包含800-1000个细胞，向六孔板的每个孔中加入100μl细胞悬液，设置3个副孔。定期观察克隆形成情况，每三天补充一次完全培养基，在六孔板培养1-3周。克隆形成后，吸弃全部培养基，加入pbs清洗，弃掉pbs，加入2ml甲醇结晶紫进行染色，染色完成后，清洗、晾干、拍照、计数。
[0111]
3、细胞凋亡实验
[0112]
准备5ml离心管，收集六孔板全部上清，应用1ml pbs清洗，收集pbs，后应用200μl胰酶消化，完全培养基终止消化，移至5ml离心管，室温1000rpm离心5min。弃去上清，加入冰上预冷的3ml pbs，注意对离心管壁加，不要吹到细胞，轻柔吹10次重悬后，再次室温1000rpm离心5min。离心时，准备1.5ml离心管，做好标记。离心后，应用1
×
binding buffer重悬细胞，并转移至1.5ml离心管。向每个离心管中加入7.5μl annexin-v-pe试剂，混匀后，室温避光孵育15min。向每个离心管中加入7.5μl 7-aad staining试剂，混匀后，室温避光孵育10min。随后，每个样品加入300μl binding buffer稀释，放置冰上，进行流式细胞术检测及数据分析。
[0113]
三、动物实验
[0114]
1.裸鼠体内荷瘤实验
[0115]
本实验所采用的nod/scid裸小鼠为4-6周龄雌鼠，将mda-mb-231乳腺癌细胞进行胰酶消化、完全培养基终止消化、离心，应用灭菌pbs清洗后再次离心，1ml pbs重悬后计数。根据计数情况，配置细胞悬液，细胞悬液应用空培养基进行配置(培养基：基质胶＝1:1)，最终使每100μl悬液中包含1
×
107个细胞。应用1ml无菌注射器在生物安全柜中将100μl细胞悬液注射至裸鼠的脂肪垫中，完成裸鼠体内荷瘤实验。待成瘤后定期测量小鼠体重及瘤体大小，瘤体的体积计算公式为：长
×
宽
×
宽
×
0.52，待瘤体体积到合适大小时进行裸鼠处死及瘤体剥离、称重、拍照。部分瘤体应用多聚甲醛固定后石蜡包埋，其余瘤体液氮中保存，可用于rna及蛋白的提取。
[0116]
2.药物实验
[0117]
本实验所采用的balb/c裸小鼠为4-6周龄雌鼠，将mda-mb-231乳腺癌细胞进行胰酶消化、完全培养基终止消化、离心，应用灭菌pbs清洗后再次离心，1mlpbs重悬后计数。根据计数情况，配置细胞悬液，细胞悬液应用空培养基进行配置(培养基：基质胶＝1:1)，最终使每100μl悬液中包含1x107个细胞。应用1ml无菌注射器在生物安全柜中将100μl细胞悬液注射至裸鼠的脂肪垫中，完成裸鼠体内荷瘤实验。待成瘤后定期测量小鼠体重及瘤体大小，待瘤体达到一定体积后，进行给药处理。药物处理分为四组，对照组、单药rk33组、单药顺铂化疗组和联药组。药物均为腹腔注射，其中rk33的给药浓度为20mg/kg，顺铂的给药浓度为3mg/kg，每周给药三次。定期测量小鼠体重及瘤体大小，待瘤体体积到合适大小时进行裸鼠处死及瘤体剥离、称重、拍照。部分瘤体应用多聚甲醛固定后石蜡包埋，其余瘤体液氮中保存，可用于rna及蛋白的提取。
[0118]
四、rna提取、翻转录及qpcr实验
[0119]
1、细胞rna的提取(trizol法)：涉及rna的实验操作均使用无rna酶的枪头和离心管，并冰上操作。
[0120]
(1)细胞rna提取：弃去提取rna的细胞培养基，应用pbs洗两次后弃净，在培养皿中加入1ml rnaiso plus，充分吹打混匀并转移至1.5ml离心管中。
[0121]
(2)加入200μl氯仿，充分颠倒混匀，冰上静置5min，14,500rpm，4℃离心15min，吸取400μl上层水相层至新的1.5ml离心管。
[0122]
(3)加入500μl预冷异丙醇，充分颠倒混匀，冰上静置20min，14,500rpm，4℃离心15min，可见底部白色沉淀，弃上清。
[0123]
(4)加入1ml 75％预冷无水乙醇(使用depc水配置)，上下颠倒漂洗至沉淀悬浮起(勿吹散沉淀)，14,500rpm，4℃离心10min，弃上清，重复本步骤一次。
[0124]
(5)大枪头套小枪头吸净上清，室温干燥10min，待乙醇完全挥发，至rna呈半透明状，加入适量depc水进行rna溶解，使用nanodrop测rna浓度，进行下一步实验或-80℃保存。
[0125]
2、反转录
[0126]
使用南京诺唯赞hiscript iii rt supermix for qpcr(+gdna wiper)转录试剂盒进行反转录步骤。
[0127]
(1)去基因组dna
[0128][0129]
配好反应体系后，放入pcr仪，反应条件为42℃，2h。
[0130]
(2)逆转录反应
[0131][0132]
配好反应体系后，放入pcr仪，反应条件为37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保持。
[0133]
3、qpcr反应
[0134]
使用南京诺唯赞chamq sybr qpcr mater mixs试剂盒进行qpcr反应。
[0135]
(1)在20μl反转录后的cdna中加入180μl depc水进行10倍稀释；
[0136]
(2)qpcr引物设计，根据primerbank进行qpcr引物设计，本部分所应用的引物由苏州金唯智生物公司合成，具体序列如下：
[0137]
primer sequences(5
’‑3’
)
[0138]
gapdh-f ggagcgagatccctccaaaat
[0139]
gapdh-r ggctgttgtcatacttctcatgg
[0140]
actb-f catgtacgttgctatccaggc
[0141]
actb-r ctccttaatgtcacgcacgat
[0142]
klhl29-f gcagagcgaaagcgtttacag
[0143]
klhl29-r gcaggttcgacaggacgag
[0144]
(3)配置qpcr反应体系，根据试剂盒说明书配置反应体系如下：
[0145][0146]
配置好反应体系后，点样，按照实验需求将样本上进384孔板中，贴好封口膜后，2,000rpm室温离心1min，上机进行qpcr反应，反应条件如下：
[0147]
100μg)直接上样至凝胶孔中。
[0160]
(3)电泳
[0161]
上好样品及蛋白marker后，开始凝胶电泳，起始按照以60v的电压开始电泳，待跑到分离胶后将电压调整至125v继续电泳，待溴酚蓝跑至底部时结束电泳。
[0162]
(4)转膜
[0163]
转膜液需要提前预冷，将裁好的pvdf膜放在甲醇中激活，准备好转膜槽和冰板，开始转膜，转膜的“三明治体系”按照“海绵-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵”顺序摆放并放置在转膜槽中，注意摆放顺序，同时凝胶和pvdf膜中注意不要有气泡。转膜条件为：恒流300ma转膜100min。
[0164]
(5)封闭
[0165]
转膜完成后，应用1
×
tbst润洗pvdf膜一次，应用5％的脱脂牛奶进行封闭1h。
[0166]
(6)一抗敷育
[0167]
转膜完成后，应用1
×
tbst润洗pvdf膜一次，洗去残余牛奶，按照对应条带位置裁膜，并敷育对应一抗，4℃水平摇床过夜。
[0168]
(7)洗膜
[0169]
一抗敷育完成后，应用1
×
tbst洗pvdf膜四次，每次10min。
[0170]
(8)二抗敷育
[0171]
敷育对应二抗，室温水平摇床1h。
[0172]
(9)洗膜
[0173]
一抗敷育完成后，应用1
×
tbst洗pvdf膜四次，每次10min。
[0174]
(10)曝光
[0175]
配制ecl化学发光液，在机器上将条带曝光，并分析结果。
[0176]
六、免疫组化实验(ihc，immunohistochemistry)
[0177]
1、烤片
[0178]
将石蜡切片置于65℃烤箱烤片2h。
[0179]
2、脱蜡与水化
[0180]
按照二甲苯-无水乙醇-95％乙醇-90％乙醇-80％乙醇-75％乙醇-蒸馏水的顺序，将载玻片放入每个试剂中10min。
[0181]
3、漂洗
[0182]
将切片在流水中冲洗15min，注意不要将切片正面接触水流。
[0183]
4、抗原修复
[0184]
将切片放置在柠檬酸钠缓冲液/edta中加热至沸腾，后应用最小火15min，等待自然冷却至室温。随后应用1
×
pbs洗三次，每次5min。
[0185]
5、一抗孵育
[0186]
应用纸巾吸干pbs及多余水分，免疫组化笔勾画组织区域，根据组织区域的大小滴加适量的一抗工作液，4℃孵育过夜。
[0187]
6、二抗孵育
[0188]
一抗孵育结束后，弃去一抗，1
×
pbs清洗三次，每次5min，弃掉pbs，加入二抗，37℃温箱中孵育30min。
[0189]
7、显色
[0190]
二抗孵育结束后，弃去二抗，1
×
pbs清洗三次，每次5min，弃掉pbs，加入显色剂dab，室温孵育5min，在1
×
pbs中终止显色反应，并应用1
×
pbs清洗三次，每次5min。
[0191]
8、复染
[0192]
pbs清洗后，应用苏木精染液进行复染。
[0193]
9、脱水
[0194]
按照75％乙醇-85％乙醇-90％乙醇-95％乙醇-无水乙醇-二甲苯的顺序，将载玻片放入每个试剂中5-10min。
[0195]
10、封片
[0196]
滴加封片剂，加上盖玻片后，将封好的片子置于通风橱中晾干，显微镜观察染色情况。
[0197]
11、评估
[0198]
免疫组化评分为细胞染色强度评分和阳性细胞百分比评分的乘积。其中细胞染色强度评分分为4级，阴性记为0分，浅黄色(弱阳性)记为1分，棕黄色(阳性)记为2分，棕褐色(强阳性)记为3分。阳性细胞百分比评分分为4级，无阳性细胞记为0分，《10％记为1分，10-50％记为2分，＞50％记为3分。
[0199]
综上所述，本公开实施例首次公开了klhl29基因及其编码的蛋白与乳腺癌诊断和治疗相关的特异性标志物，klhl29基因有望成为诊断乳腺癌和乳腺癌化疗耐药的分子标志物，并为研究乳腺癌发生发展和耐药的分子机理提供新思路。
[0200]
在大样本转录组测序的基础上，结合生物信息学分析筛选出三阴性乳腺癌的有效治疗靶点，探究klhl29在三阴性乳腺癌癌与癌旁非癌组织中差异性表达，通过检测klhl29基因及其编码蛋白的表达水平，可以诊断乳腺癌，由此本公开提供了制备含有klhl29基因或含有klhl29编码的蛋白的乳腺癌辅助诊断试剂盒，利用检测基因表达水平的方式诊断乳腺癌的方法更加灵敏更加特异，有利于疾病早期的诊断。同时，明确了klhl29及ddx3x在三阴性乳腺癌发生发展中的作用及分子机制，同时聚焦其临床转化价值，发现三阴性乳腺癌的潜在药物治疗靶点，并靶向目的基因参与的机制应用抑制剂进行临床转化，为乳腺癌治疗靶点的选择提供理论依据并为三阴性乳腺癌患者提供新的治疗选择。
[0201]
基于以上内容，本领域技术人员可以理解，本公开要求保护的技术方案以及其等同技术方案将是显而易见的。此外，本领域技术人员还可以根据需要对所公开的技术方案进行适当的修改和改变，这些修改和改进的技术方案也在本公开权利要求书的保护范围内。

技术特征：
1.一种用于乳腺癌诊断或预后评估的标志检测物，其特征在于，所述标志检测物包括用于检测klhl29基因或其编码蛋白的表达水平的引物。2.根据权利要求1所述的标志检测物，其特征在于，所述标志检测物包括一对特异性扩增引物：上游引物(f)：5
’‑
gcagagcgaaagcgtttacag-3’下游引物(r)：5
’‑
gcaggttcgacaggacgag-3’。3.一种如权利要求1所述的标志检测物的用途，其特征在于，用于制备一种检测试剂，所述检测试剂用于选自如下一种或多种用途：用于预测抗乳腺肿瘤药物化疗耐药和预后，用于改善抑制剂与抗乳腺肿瘤药物的联合用药。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，通过所述检测试剂检测klhl29基因或其蛋白的表达水平，根据所述表达水平预测抗乳腺肿瘤药物的化疗耐药和预后，其中，较低的所述表达水平提示不良预后。5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，通过所述检测试剂检测klhl29基因或其蛋白的表达水平，根据所述表达水平调控抑制剂用量，以改善抑制剂与抗乳腺肿瘤药物的联合用药。6.根据权利要求3至5任一项所述的用途，其特征在于，所述乳腺肿瘤包括乳腺癌及其亚型，以及三阴性乳腺癌；所述抗乳腺肿瘤药物包括铂类药物。7.一种用于乳腺癌诊断或预后评估的试剂盒，其特征在于，包括盒体以及如权利要求1或2所述的标志检测物。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括如下试剂中的一种或多种：胃蛋白酶、组织固定液、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、sabc-pod、生物素化过氧化物酶、depc、3％柠檬酸、2
×
ssc、0.5
×
ssc、0.2
×
ssc、原位杂交用pbs。9.一种靶向klhl29介导的信号通路的抑制剂，所述抑制剂能够与抗乳腺肿瘤药物联合用药，用以改善所述抗乳腺肿瘤药物的耐药问题。10.根据权利要求9所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括klhl29的相互作用蛋白ddx3x的抑制剂rk33，所述乳腺肿瘤为三阴性乳腺癌，所述抗乳腺肿瘤药物为顺铂。

技术总结
本公开涉及一种用于乳腺癌诊断或预后评估的标志检测物及其用途、试剂盒及靶向抑制剂。其中的标志检测物包括用于检测KLHL29基因或其编码蛋白的表达水平的引物。其用途包括用于制备一种检测试剂，用于预测抗乳腺肿瘤药物化疗耐药和预后，或者用于改善抑制剂与抗乳腺肿瘤药物的联合用药。本公开还包括一种靶向KLHL29介导的信号通路的抑制剂。本公开中的技术方案有效解决抗乳腺肿瘤药物的化疗耐药和预后预测问题。还提供了一种抗乳腺肿瘤的靶向药物、靶向抑制剂以及一种联合用药方案，为乳腺肿瘤患者提供新的治疗选择。腺肿瘤患者提供新的治疗选择。腺肿瘤患者提供新的治疗选择。


技术研发人员：徐莹莹 姚礼彤 王墨之 张强 余科达 王泓皓
受保护的技术使用者：中国医科大学附属第一医院
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/20