一种多聚HRP的制备方法与流程

一种多聚hrp的制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种多聚hrp的制备方法，属于生物化学与分子生物学技术领域。


背景技术：

2.在分子生物学检测技术领域中，常常需要对分子间相互结合的信号进行放大和转化，以实现对分析目标可视化和高敏感感应。其中hrp（中文：辣根过氧化物酶；英文：horseradish peroxidase，hrp）是一种常用报告酶分子，分子量约40kda，被广泛应用于western blot、elisa、免疫组织化学、化学发光等多种技术中。在以上技术中，hrp通常作为标记物被直接或间接标记在抗体上。当抗体通过特异结合关系与目标分子结合后，hrp可通过催化底物如：3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）、3,3'-二氨基联苯胺（dab）、3-氨基-苯二甲酰肼（鲁米诺）、愈创木酚、氨乙基咔唑等形成发色或发光产物而报告目标。
3.为提高检测敏感性，通常会采用将hrp多聚物作为标记分子与特异性试剂结合，现有技术中将hrp多聚化的方法有三种，分别是：一．基于生物素-链霉亲和素特异性结合的非共价结合方法；该方法的实现涉及生物素标记以及需要引入链霉亲和素（66kda），其结合为非共价性结合；该方法缺点是：需要较复杂生物素标记，链霉亲和素（66kda）的分子量较大，骨架分子成本高，结合关系为非共价性。
4.二．通过氧化hrp糖链中羟基形成醛基与其自身分子中氨基结合形式的聚合；该聚合方法的缺点是在hrp经氧化形成的醛基与其氨基发生结合反应的效率很低，造成的原因可能与氨基数量及其暴露情况相关。
5.三、在部分应用领域有通过新型分支分子骨架（超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯、pamam）实现hrp聚合的方法，该方法骨架分子成本高。
6.由此可见，寻找更佳紧凑、高效率以及低成本的hrp聚合方法仍然是本领域需要解决的问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于，提供一种多聚hrp的制备方法，该制备方法是基于ε-多聚赖氨酸分子骨架的hrp聚合方法，它能更好改进hrp聚合效率以及降低聚合试剂成本，从而克服现有技术的不足。
8.本发明的技术方案是这样实现的：本发明的一种多聚hrp的制备方法，该方法利用hrp被氧化衍生出醛基后，再与ε-多聚赖氨酸发生shiff反应得到hrp聚合产物；ε-多聚赖氨酸是一种由微生物合成的具有广泛防腐作用的多肽，由25～30赖氨酸残基聚合而成（平均分子量约4kda），该分子在食品、化妆品、医药等领域均有广泛使用，是一种价格低廉的分子原料。
9.ε-多聚赖氨酸分子中富含-nh2基团，因此是一个理想的基于shiff反应原理的聚合反应分子骨架，本方案中先采用高碘酸钠氧化hrp使其衍生出醛基；而后将氧化后hrp与
ε-多聚赖氨酸直接进行反应便可实现hrp的聚合，最后经还原剂稳定聚合产物进行收集。
10.所述多聚hrp的制备方法，具体包括以下步骤：步骤一、hrp的氧化；建立氧化反应体系，将hrp与高碘酸钠混合反应后得到生出醛基的hrp；步骤二、氧化终止；向hrp与高碘酸钠混合溶液中加入乙二醇以终止高碘酸钠氧化作用；步骤三、氧化产物收集；氧化后hrp经冷乙醇沉淀离心的方式回收，其中冷乙醇的温度在0-10℃范围内；步骤四、聚合反应；建立聚合反应体系，将氧化后的hrp经ε-多聚赖氨酸发生shiff反应得到hrp聚合产物；步骤五、稳定hrp聚合产物；聚合反应完成后，通过加入还原剂使得hrp聚合产物稳定；步骤六、hrp聚合产物收集；将稳定后的hrp聚合产物经纯化后，得到对应的高分子量聚合物。
11.优选的，所述步骤一中氧化反应体系是以醋酸钠缓冲液建立氧化反应体系，将hrp与高碘酸钠混合进行氧化反应。
12.优选的，所述醋酸钠缓冲液的ph值为5.0~6.0；所述hrp在醋酸钠缓冲液中浓度为0.5-20mg/ml；所述高碘酸钠在醋酸钠缓冲液中浓度为5-100mm。
13.优选的，所述氧化反应是置于冰上进行，冰浴温度为0-10℃，冰浴氧化反应时间为30-60分钟。
14.优选的，所述步骤四中聚合反应体系是以碳酸缓冲液建立聚合反应体系，将步骤三收集的氧化后hrp经ε-多聚赖氨酸发生shiff反应并得到hrp聚合产物。
15.优选的，所述碳酸缓冲液的ph值为8.0-9.5，氧化后hrp与ε-多聚赖氨酸的质量比范围为0.5~5:1，反应条件为室温24-48小时，其中室温温度为15-30℃。
16.优选的，所述步骤五中的还原剂采用硼氢化钠溶液，室温反应后使hrp聚合产物稳定，其中室温温度为15-30℃。
17.优选的，所述硼氢化钠溶液溶度为20mg/ml，室温反应时间为2小时。
18.优选的，所述步骤六中纯化采用将反应液经分子筛分离高分子量产物的方法，收集高分子量产物。
19.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，其优点包括：1、本发明所采用的ε-多聚赖氨酸25～30赖氨酸残基聚合而成（平均分子量约4kda），且ε-多聚赖氨酸分子中富含-nh2基团；是一种价格低廉的分子原料，也是一个理想的基于shiff反应原理的聚合反应分子骨架。
20.2、本发明采用以醋酸钠缓冲液建立氧化反应体系、以碳酸缓冲液建立聚合反应体系，对应反应物质的浓度等相关参数以及相关工艺反应条件，使得聚合反应更加高效。
21.2.1、过碘酸钠氧化hrp的结果受ph影响，过碘酸钠的氧化一般在偏酸条件下为宜，由于酶系为带弱酸性的物质，其水溶液的ph在5左右，但在ph数值过低时（ph值低于5），效果即受影响，并随ph的降低而降低；由于ph较低能损害酶的活性中心，即酸性过低会影响酶分子中的铁卟啉，且不能产生足够的醛基。
22.2.2、加乙二醇是必要的（最好过量），因过碘酸钠氧化乙二醇极为迅速，这样就相对的终止了对酶的继续氧化，一般认为乙二醇在数分钟内即能被氧化乙二醛，而产生的乙二醛也系双功能的醛基，在偏酸的情况下，酶蛋白上的氨基与醛基的结合效果较差，不易使酶聚合，若乙二醛分子远多于酶分子上已产生的醛基，则有部分的乙二醛的醛基与酶分子上的氨基结合，使酶醛化，即可能使hrp中无糖或含糖量极低的同工酶标记。
23.3、本发明通过加入还原剂使得hrp聚合产物更加稳定。
附图说明
24.图1是hrp聚合产物4-20%凝胶电泳。
25.图中标记为：1. 蛋白分子量marker；2. hrp自发聚合反应；3. hrp经ε-多聚赖氨酸聚合。
实施方式
26.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
实施例
27.以下通过具体实例1进一步阐明多聚hrp的制备方法：1）采用50mm醋酸钠缓冲液（ph5.0~6.0）将hrp配制成1-40mg/ml溶液，将高碘酸钠配制成10-200mm溶液，将二者等体积混合，置于冰上进行氧化反应；2）冰浴反应30-60分钟后，加入等体积含22%nacl的0.4m乙二醇溶液，室温反应30分钟（乙二醇需过量，目的是终止高碘酸钠氧化作用）；3）加入4倍于反应体系体积的冰冷无水乙醇并混匀，其中冰浴温度为0-10℃，然后经10000-15000转/分钟离心10分钟；4）离心后弃去上清，沉淀自然风干后用50mm碳酸缓冲液（ph8.0-9.5）溶解，控制hrp浓度为1-10mg/ml；5）ε-多聚赖氨酸用相同碳酸缓冲液溶解成0.2mg/ml溶液；6）建立氧化后hrp与ε-多聚赖氨酸聚合反应体系，将二者按照物质量0.5~5:1比例范围混合，室温反应24-48小时；7）加入1/10体积硼氢化钠溶液（20mg/ml），室温反应2小时；8）聚合反应效果经4-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（图1），然后将反应液经superdex 200柱纯化，收集高分子量产物。
实施例
28.实施例2是基于实施例1基础更加优化的参数配比和工艺流程：1）称量5mg hrp，用0.5ml 50mm醋酸钠缓冲液（ph5.6）溶解；2）称量10.69mg高碘酸钠溶于0.5ml 50mm醋酸钠缓冲液（ph5.6）；3）将上述1）和2）中两种溶液混合并置于冰上反应30分钟，冰浴温度为0-10℃；4）向反应液中加0.5ml含 0.4m乙二醇与22%nacl的溶液，室温继续反应30分钟；
5）加入冰冷的无水乙醇6ml混匀，然后经15000转/分离心10分钟，其中冰冷的无水乙醇的温度在0-10℃范围内；6）留取沉淀物并风干，用2.5ml 50mm碳酸钠缓冲液（ph9.0）溶解沉淀并尽快用于后续反应中；7）用50mm碳酸钠缓冲液（ph9.0）配制浓度为0.2mg/ml的ε-多聚赖氨酸溶液；8）将6）和7）中溶液按照等体积混合建立反应体系，室温条件下反应48小时；9）反应结束后向反应体系中加入1/10体积20mg/ml硼氢化钠水溶液，室温反应2小时;10）将反应终产物采用superdex 200分离获得高度聚合分子。
29.尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本发明公开了一种多聚hrp的制备方法，hrp是分子生物学以及临床检测中经常用到的生物酶，可通过催化底物发光或发色报告目标存在。将hrp进行多聚有利于在相应检测中提高检测信号。本发明通过将hrp经高碘酸钠氧化生成醛基，再经与ε-多聚赖氨酸按一定比例发生shiff反应、硼氢化钠还原稳定等步骤得到hrp聚合产物。本发明具有原料廉价、反应效率高等特点。

技术特征：
1.一种多聚hrp的制备方法，其特征在于：该方法利用hrp被氧化衍生出醛基后，再与ε-多聚赖氨酸发生shiff反应得到hrp聚合产物。2.根据权利要求1所述多聚hrp的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、hrp的氧化；建立氧化反应体系，将hrp与高碘酸钠混合反应后得到醛基化hrp；步骤二、氧化终止；向hrp与高碘酸钠混合溶液中加入乙二醇以终止高碘酸钠氧化作用；步骤三、氧化产物收集；氧化后hrp经冷乙醇沉淀离心的方式回收；步骤四、聚合反应；建立聚合反应体系，将氧化后的hrp经ε-多聚赖氨酸发生shiff反应得到hrp聚合产物；步骤五、稳定hrp聚合产物；聚合反应完成后，通过加入还原剂使得hrp聚合产物稳定；步骤六、hrp聚合产物收集；将稳定后的hrp聚合产物经纯化后，得到对应的高分子量聚合物。3.根据权利要求2所述多聚hrp的制备方法，其特征在于：所述步骤一中氧化反应体系是以醋酸钠缓冲液建立氧化反应体系，将hrp与高碘酸钠混合进行氧化反应。4.根据权利要求3所述多聚hrp的制备方法，其特征在于：所述醋酸钠缓冲液的ph值为5.0~6.0；所述hrp在醋酸钠缓冲液中浓度为0.5-20mg/ml；所述高碘酸钠在醋酸钠缓冲液中浓度为5-100mm。5.根据权利要求3所述多聚hrp的制备方法，其特征在于：所述氧化反应是置于冰上进行，冰浴氧化反应时间为30-60分钟。6.根据权利要求2所述多聚hrp的制备方法，其特征在于：所述步骤四中聚合反应体系是以碳酸缓冲液建立聚合反应体系，将步骤三收集的氧化后hrp经ε-多聚赖氨酸发生shiff反应并得到hrp聚合产物。7.根据权利要求6所述多聚hrp的制备方法，其特征在于：所述碳酸缓冲液的ph值为8.0-9.5，氧化后hrp与ε-多聚赖氨酸的质量比范围为0.5~5:1，反应条件为室温24-48小时。8.根据权利要求2所述多聚hrp的制备方法，其特征在于：所述步骤五中的还原剂采用硼氢化钠溶液，室温反应后使hrp聚合产物稳定。9.根据权利要求8所述多聚hrp的制备方法，其特征在于：所述硼氢化钠溶液溶度为20mg/ml，室温反应时间为2小时。10.根据权利要求1所述多聚hrp的制备方法，其特征在于：所述步骤六中纯化采用将反应液经分子筛分离高分子量产物的方法，收集高分子量产物。

技术总结
本发明公开了一种多聚HRP的制备方法，HRP是分子生物学以及临床检测中经常用到的生物酶，可通过催化底物发光或发色报告目标存在。将HRP进行多聚有利于在相应检测中提高检测信号。本发明通过将HRP经高碘酸钠氧化生成醛基，再经与ε-多聚赖氨酸按一定比例发生Shiff反应、硼氢化钠还原稳定等步骤得到HRP聚合产物。本发明具有原料廉价、反应效率高等特点。反应效率高等特点。反应效率高等特点。


技术研发人员：梁旺 程娟 顾文然 苏新 李传胜
受保护的技术使用者：中汉（江苏）医学科技有限公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/9/20