一种藏茴香的鉴别方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种藏茴香的鉴别方法及其应用，尤其设计一种基于薄层图谱的藏茴香的鉴别方法，属于医药技术领域。


背景技术：

2.藏茴香又名葛缕子、郭扭，为伞形科植物藏茴香carumcarvil.的果实，属于藏药常用药材。其主要有效成分为挥发油类，如葛缕酮、二氢葛缕酮和d-柠椽烯等，临床药理作用表现为抗菌、抗癫痫、血脂调节及肝脏保护、镇咳平喘、保护胃肠道、抗氧化等作用。
3.目前藏茴香药材执行标准编号为ws3-bc-0129-95-2022(简称部颁标准)，其中的鉴别方法为采用石油醚(60-90℃)-乙醚(1∶1)处理样品和藏茴香对照药材粉末后，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17∶2.5)为展开剂，喷以二硝基苯腓显色，在日光下检视。但重复该方法发现，该方法前处理略为繁琐，展开斑点仅有1个，颜色较浅且需要显色后立即观察，放置半小时后斑点消失。此外，现有技术也提供了其它藏茴香的薄层鉴别方法，如《藏药十五味萝蒂明目丸薄层色谱鉴别方法研究》(中国民族民间医药；2011年15期，文献1)中，藏茴香鉴别中以乙醚提取和浓缩处理样品，以石油醚∶乙酸乙酯(5∶2)为展开剂(重复发现，需要更贵更细致的默克板)，365nm灯下检视。《藏药十五味萝蒂明目片质量标准的研究》(青海医药杂志，2010年第40卷7期，文献2)、《青海省炮制规范(2010)》中，藏茴香的薄层鉴别为，加甲醇回流处理样品和藏茴香对照药材后，展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(15∶5∶1∶1)，紫外365nm下检视展开斑点。《留兰香油主要成分香芹酮和柠檬烯的gc含量测定及薄层鉴别》(中华中医药学刊，2014年32卷第3期，文献3)，则以正己烷处理样品，以正己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，喷以5％香草醛-浓硫酸并加热显色。但无论文献报道，还是我们重复试验所得，展开斑点均不甚理想，大都呈现模糊长带状分离，颜色淡，边界模糊或重叠，有1个较为明显的斑点，但仔细观察另有一个斑点始终无法有效分离(若是采用更细致的、贵6-7倍的m板展开，能分辨出紧靠或重叠在一起的2个颜色不同的斑点)，鉴别图谱不便于判定。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的存在的缺陷和不足，本发明提供了一种操作更为简便，分离度良好的藏茴香的鉴别方法，稳定性强，专属性强，重现性好，可有效对藏茴香药材及其制剂进行鉴别。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种藏茴香的鉴别方法，包括如下步骤：
7.a、供试品溶液制备：取藏茴香药材细粉1重量份或其制剂细粉2重量份，加体积重量比为6-18的甲醇，回流30min或者超声10-20分钟，冷却至室温，滤过，取藏茴香药材续滤液作为供试品溶液，或将藏茴香制剂细粉的续滤液进一步浓缩至一半体积的浓缩液作为供试品溶液；
8.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25重量份，加体积重量比为16-24
的甲醇，超声处理10-20分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
9.c、薄层色谱展开：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各5μl或10μl，分别点于同一硅胶板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比8-15∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
10.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
11.本发明优选的，供试品溶液制备过程中，加体积重量比为10-15的甲醇；
12.本发明优选的，供试品溶液制备过程中，加体积重量比为15的甲醇；
13.本发明还优选的，对照药材溶液制备过程中，加体积重量比为20的甲醇；
14.本发明还优选的，对照药材溶液制备过程中，采用超声处理，时间为10分钟；
15.本发明进一步优选的，展开剂为体积比10-12∶1的环己烷-乙酸乙酯；
16.本发明进一步优选的，展开剂为体积比10∶1的环己烷-乙酸乙酯；
17.本发明还优选的，展开硅胶板为g板或m板；
18.本发明还提供了一种所述的藏茴香的鉴别方法在对藏茴香药材或含藏茴香药材制剂进行鉴别中的应用。
19.本发明的有益效果
20.1、本发明展开后可以得到两个明显的特征斑点，且分离度较好；
21.2、本发明展开后所得特征斑点稳定，边界清晰，可长时间放置后观察；
22.3、本发明方法处理操作简便，处理过程无需加热、无需使用易燃易爆和易制毒的乙醚，直接超声后过滤便可进行薄层鉴别，操作简便，大大缩短试验时间。
附图说明
23.图1为重复文献1方法所得图谱，展开剂为石油醚：乙酸乙酯(5∶2)，其中1、3、5为六味明目丸样品，2为藏茴香药材，4为阴性对照；
24.图2为重复部颁标准方法所得图谱，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯(17∶2.5)，其中1-3分别为葛缕酮、柠檬烯、茴香醛对照品，4、9为藏茴香同批对照药材，5-6为不同批次藏茴香样品，7为六味明目丸，8为阴性对照；
25.图3为重复文献2方法所得图谱，展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(15∶5∶1∶1)的薄层色谱图谱，其中1-2为藏茴香同批对照药材，3-4为不同批次藏茴香样品；
26.图4为重复文献3方法所得图谱，展开剂为正己烷∶乙酸乙酯(12∶1)，g板，其中1-2为藏茴香同批对照药材，3-4为不同批次藏茴香样品；
27.图5为重复文献3方法所得图谱，展开剂为正己烷∶乙酸乙酯(12∶1)，m板，其中1为藏茴香对照，2为葛缕酮对照，3和4为不同批次藏茴香离心处理样品，5和6为不同批次藏茴香滤过样品；
28.图6为改进文献3方法所得图谱，展开剂改为环己烷∶乙酸乙酯(12∶1)，其中1为藏茴香对照(以乙酸乙酯处理)，2为藏茴香药材(以乙酸乙酯处理)，3和4为含不同批次藏茴香的六味明目丸(以乙酸乙酯处理)，5和6为含不同批次藏茴香的六味明目丸制剂(以甲醇处理)，7和8为藏茴香药材(以甲醇处理)，9为藏茴香对照(以甲醇处理)；
29.图7为本发明鉴别方法所得图谱，展开剂为环己烷∶乙酸乙酯(10∶1)，其中两端的“dz”为藏茴香对照药材，s1-s9为藏茴香样品；
30.图8为本发明鉴别方法所得图谱，展开剂为环己烷∶乙酸乙酯(10∶1)，其中1为葛缕酮对照，2为藏茴香对照药材，3和4为藏茴香药材样品，5和6为含藏茴香的六味明目丸，7为阴性对照。
具体实施方式
31.下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
32.实施例1、一种藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
33.a、供试品溶液制备：取藏茴香药材细粉1g，加15ml甲醇，超声10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
34.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加5ml甲醇，超声处理10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
35.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶g板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比10∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
36.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值
37.实施例2、一种藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
38.a、供试品溶液制备：取藏茴香药材细粉1g，加6ml的甲醇，超声10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
39.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加4ml甲醇，超声处理10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
40.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶g板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比8∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
41.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
42.实施例3、一种藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
43.a、供试品溶液制备：取藏茴香药材细粉1g，加18ml的甲醇，超声15分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
44.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加5ml的甲醇，超声处理15分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
45.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比15∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
46.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
47.实施例4、一种藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
48.a、供试品溶液制备：取藏茴香药材细粉1g，加10ml的甲醇，回流30min，冷却至室
温，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
49.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加6ml甲醇，超声处理10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
50.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶m板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比12∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
51.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
52.实施例5、一种藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
53.a、供试品溶液制备：取藏茴香药材细粉1g，加15ml甲醇，回流30min，冷却至室温，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
54.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加5ml甲醇，超声处理15分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
55.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶g板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比14∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
56.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
57.实施例6、一种藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
58.a、供试品溶液制备：取藏茴香药材细粉1g，加15ml甲醇，超声10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
59.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加5ml甲醇，超声处理10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
60.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶m板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比12∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
61.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
62.实施例7、一种六味明目丸中藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
63.a、供试品溶液制备：取含藏茴香药材的六味明目丸细粉2g，加10ml甲醇，超声10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，浓缩至一半体积，作为供试品溶液；
64.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加4ml甲醇，超声处理15分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
65.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶g板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比10∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
66.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值’。
67.实施例8、一种六味明目丸中藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
68.a、供试品溶液制备：取含藏茴香药材的六味明目丸细粉1g，加15ml甲醇，超声15分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
69.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加5ml甲醇，超声处理10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
70.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶m板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比12∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
71.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
72.实施例9、一种六味明目丸中藏茴香的鉴别方法，步骤如下：
73.a、供试品溶液制备：取含藏茴香药材的六味明目丸细粉2g，加18ml甲醇，回流30分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，浓缩至一半体积作为供试品溶液；
74.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加5ml甲醇，超声处理10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
75.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶g板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比8∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
76.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
77.实施例10、一种藏茴香制剂的鉴别方法，步骤如下：
78.a、供试品溶液制备：取含藏茴香药材的制剂细粉2g，加18ml甲醇，超声10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，浓缩至一半体积作为供试品溶液；
79.b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25g，加5ml甲醇，超声处理10分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；
80.c、薄层鉴别：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶g板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比10∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
81.d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。
82.以下实验例用于对本发明的进一步说明。
83.实验例1、藏茴香薄层鉴别展开剂摸索
84.1实验仪器、试剂及对照品
85.1.1仪器：电子天平：yp20002(2kg、0.01g)；二列四孔水浴锅，hh-zk4。
86.1.2试剂(均为色谱级)：
87.甲醇(禹王试剂)、甲酸(国药集团)、乙酸乙酯(天津富宇)、石油醚(60-90℃，国药集团)、正己烷(国药集团)、环己烷(国药集团)、无水乙醇(禹王试剂)
88.1.3对照药材：藏茴香对照药材(北京谱析)，批号:ch03099；1g/瓶。
89.1.4对照品：葛缕酮(l16j12z138140、98.0％)来自北京谱析标准技术有限公司，柠檬烯对照品(100470-201503、96.0％)和茴香醛(110838-2021080.2ml/支)对照品来自于中
检院。
90.1.5样品：藏茴香药材9种，分别来自亳州、广西和青海；六味明目丸为金诃藏药股份公司提供，阴性对照为实验室根据六味明目丸配方，剔除藏茴香药材后自制。
91.2对照品溶剂的制备
92.取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，加热回流30min，冷却，滤过，制成对照药材溶液；
93.取葛缕酮66.34mg，以甲醇定溶于50ml，得1.30264mg/ml的葛缕酮对照溶液；
94.取柠檬烯117.4mg，以甲醇定溶于100ml，得1.703mg/ml的柠檬烯对照溶液；
95.取茴香醛0.2ml,以95％乙醇定容至10ml，其中取0.5ml，继续以95％乙醇定容至5ml，得2μg/ml的茴香醛对照溶液。
96.3鉴别方法和结果
97.3.1方法1：重复文献1，展开剂为石油醚:乙酸乙酯(5:2)，展距8cm
98.3.1.1样品处理：取藏茴香药材样品(青海202210)粉末10g，加乙醚25ml冷浸4h，过滤，滤液浓缩至1ml为供试品溶液；取六味明目丸样品粉末20g和阴性对照粉末20g，同法制得六味明目样品溶液和阴性对照溶液。
99.3.1.2展开：石油醚∶乙酸乙酯(5∶2)为展开剂，展板时温度23.1℃，湿度67％，点样量5ul，
100.薄层板为硅胶g板，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干。展开后晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
101.3.1.3结果：见图1。图谱有淡蓝色和橙红色两个展开斑点，但该两个斑点距离非常接近，且与附近展开带距离很近，其rf分别为0.62和0.65，分离度不太理想，实验操作要求较高。
102.3.2方法2：重复部颁标准，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯(17∶2.5)，展距8cm
103.3.2.1样品处理：取藏茴香药材样品(青海202210)粉末2g，加石油醚-乙醚(1：1)混合溶液25ml密封震荡15min，滤过，滤液低温蒸干，残渣立即加无水乙醇2ml使溶解，做为供试品溶液；取六味明目丸样品粉末20g和阴性对照粉末20g，同法制得六味明目样品溶液和阴性对照溶液。
104.3.2.2展开：石油醚∶乙酸乙酯(17∶2.5)为展开剂，展板时温度23.6℃，湿度64％，点样量5ul，薄层板为硅胶g板，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干。展开后晾干，喷以二硝基苯肼试液后，日光下检视。
105.3.2.3结果：见图2。仅显现一个橙黄色斑点，颜色很淡，该斑点不是香芹酮、柠檬烯或茴香醛。此外，该方法展开显色后需要立即观察，大约半小时后斑点几乎淡不可见，超过50min完全消失。仔细观察，该斑点实际为两个斑点重叠，但没分离开。
106.3.3方法3：重复文献2，展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(15∶5∶1∶1)，展距8cm
107.3.3.1样品处理：取藏茴香药材样品(青海202210)粉末1g研细，加甲醇15ml，加热回流30min，冷却，滤过，作为供试品溶液。
108.3.3.2展开：乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(15∶5∶1∶1)为展开剂，展板时温度24.1℃，湿度69％，点样量5ul(1、3)和10ul(2、4)，薄层板为硅胶g板，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干。展开后晾干，置紫外光
灯(365nm)下检视。
109.3.3.3结果：见图3。显现两个展开斑点，其中rf为0.75左右的斑点颜色很淡，且与附近斑点距离很近。此外，该方法总体rf偏大，一个斑点rf接近或超过0.9。即使调整展开剂比例，或更换成默克板，所得图谱也不尽理想。
110.3.4方法4：重复文献3，展开剂为正己烷-乙酸乙酯(12∶1)，展距8cm
111.3.4.1样品处理：取藏茴香药材样品(青海202210)粉末1g研细，加正己烷15ml，超声15min，滤过，作为供试品溶液。
112.3.4.2展开：正己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展板时温度23.5℃，湿度67％，点样量5ul(1、3)和10ul(2、4)，薄层板为硅胶g板，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干。展开后晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下观察。
113.3.4.3结果：见图4。显现1个淡棕红色展开斑点，点样量10ul斑点较明显。但仔细观察，该斑点实际为两个斑点重叠，但没分离开。
114.3.5方法5：更换为m板，展开剂为正己烷-乙酸乙酯(12∶1)
115.3.5.1样品处理：分别取青海和亳州的藏茴香药材样品(青海202210、亳州20210824)粉末2g研细，各加正己烷30ml，超声处理10min，以5000转速离心20min，分别取离心上清液作为样品溶液3和4备用；该两份上清液一份继续以普通抽滤、一份以微孔滤膜过滤，各取续滤液作为样品溶液5和6备用；样品溶液1为藏茴香对照，样品溶液2为葛缕酮对照。
116.3.5.2展开：正己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展板时温度24.2℃，湿度75％，点样量10ul，薄层板为硅胶m(默克)板，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干。展开后晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下观察。
117.3.5.3结果：见图5。m板斑点显示更为细致，rf0.4左右显现2个重叠的棕色展开斑点，紫外或显色观察均能分辨出2个重叠斑点(颜色不一致)，还需继续改进。另外，过滤和离心处理所得展开斑点几乎无差别。
118.3.6方法6：改进，展开剂改为环己烷-乙酸乙酯(12∶1)，样品分别以乙酸乙酯和甲醇处理对比
119.3.6.1样品处理：分别取藏茴香对照药材、藏茴香药材样品(青海202210)和两种含不同产地批次(青海、亳州)藏茴香六味明目丸粉末各1g研细，分别加乙酸乙酯15ml，超声20min，滤过，取续滤液分别作为样品溶液1-4；另分别两种含不同产地批次(青海、亳州)藏茴香六味明目丸粉末、藏茴香药材(青海202210)、藏茴香药材(亳州20210824)和藏茴香对照药材各1g研细，分别加甲醇15ml，超声20min，滤过，取续滤液分别作为样品溶液5-9。
120.3.6.2展开：正己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展板时温度24.7℃，湿度68％，点样量10ul，薄层板为硅胶g板，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干。展开后晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下观察。
121.3.6.3结果：见图6。两个斑点rf分别为0.62和0.78，分离度较好。本次实验发现，乙酸乙酯处理样品，rf0.75左右的斑点(疑为柠檬烯)较为分散(如图6中的1-4)，而甲醇处理
的两个斑点相对聚焦不分散(如图6中的5-9)。故以甲醇超声处理样品图谱表现更优异。
122.3.7方法7：展开剂为正己烷-乙酸乙酯(10∶1)，对不同产地9个藏茴香样品检测试验
123.3.7.1样品处理：分别取不同产地批次的藏茴香药材样品(青海、广西、亳州)各1g研细加甲醇15ml，超声处理10min，滤过，取续滤液分别作为样品溶液s1-s9；取藏茴香对照药材1g研细，加甲醇15ml，超声10min，滤过，取续滤液作为对照药材溶液dz。
124.3.7.2展开：正己烷-乙酸乙酯(10∶1)为展开剂，展板时温度23.2℃，湿度57％，点样量10ul，薄层板为硅胶g板，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干。展开后晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下观察。
125.3.7.3结果：见图7。样品及对照药材均显现2个明显棕色展开而不分散斑点，rf分别为0.5和0.7左右，分离度较好，方法稳定且操作简便。
126.3.8方法8：展开剂为正己烷-乙酸乙酯(10∶1)，对含藏茴香的六味明目丸检测试验
127.3.8.1样品处理：分别取青海和亳州产的藏茴香药材样品及含不同产地藏茴香制成的六味明目丸粉末各1g研细，加甲醇15ml，超声处理10min，滤过，取续滤液分别作为样品溶液3-6，同法制得不含藏茴香药材的阴性对照溶液，1为葛缕酮对照溶液，2为3.7制备的藏茴香对照药材溶液，7为不含藏茴香的六味明目丸溶液。
128.3.8.2展开：环己烷-乙酸乙酯(10∶1)为展开剂，展板时温度23.2℃，湿度57％，点样量10ul，薄层板为硅胶g板，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干。展开后晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下观察。
129.3.8.3结果：见图8。藏茴香对照药材(2)、药材样品(3和4)及六味明目丸(5和7)均显现2个明显棕色展开斑点，rf分别为0.5(1，葛缕酮)和0.7左右，分离度较好，方法稳定且操作简便，而阴性对照(7则没有该两个展开斑点)。
130.4、实验小结
131.4.1重复部颁标准或文献方法所得图谱均为1个斑点，仔细观察有重叠且边界模糊，或者斑点不稳定；或者分离度rf不恰当，不便于鉴别。
132.4.2实验研究发现，对于藏茴香药材细粉，采用甲醇或正己烷或乙酸乙酯处理样品时，回流与普通超声相比，无论hplc图谱还是薄层鉴别图谱并无差别，但超声操作更快捷简单，且普通超声10min即可；另外，离心或过滤处理样品溶液，对结果几乎无影响。
133.4.3展开剂改进为环己烷和乙酸乙酯混合溶液即能得到两个展开斑点，鉴别效果更好；但以乙酸乙酯处理样品时，其中一个斑点较为分散；以甲醇处理样品时，两个斑点大小类似，不分散，且分离度较好。
134.4.4实验还发现，环己烷和乙酸乙酯比例以8-15∶1均可以得到两个分离度较好的斑点，环己烷比例越大，两个斑点距离越近，但以10-12∶1为最佳。
135.4.5样品溶液适当浓缩更佳，或者可加量点样。
136.实验例2、藏茴香薄层色谱鉴别方法学验证
137.参考文献《藏药十五味萝蒂名目片质量标准研究(黄忠全)》；《留兰香油主要成分香芹酮和柠檬烯的gc含量测定及鉴别(康艳蕾)》；对藏茴香薄层色谱鉴别方法进行了研究，
包括供试品溶液制备方法的研究、展开剂的研究等，确定了藏茴香薄层色谱鉴别方法。结果表明方法简便可行，具有较好的耐用性，可有效地控制其质量。
138.一.方法学验证总结
139.方法学验证总结表
[0140][0141]
二.实验仪器、试剂、对照药材及对照品
[0142]
2.1仪器：电子天平：yp20002(2kg、0.01g)；二列四孔水浴锅，hh-zk4；超声波清洗器，sk5200hp；电热鼓风干燥箱：101-2ab型。
[0143]
2.2试剂：
[0144]
本实验所用试剂甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，实验用水为纯化水。
[0145]
2.2.1：甲醇(ch3oh)：20210805316、禹王试剂
[0146]
2.2.2：硫酸(h2s04)：20200902、天津富宇
[0147]
2.2.3：乙酸乙酯(c4h8o2)：20191125、天津富宇
[0148]
2.2.4：环己烷(c6h
12
)：20210211、天津富宇
[0149]
2.2.5：香草醛(c8h8o3)：20190819、天津光复
[0150]
2.2.6：5％香草醛硫酸溶液：取香草醛0.5g，加硫酸10ml使溶解。
[0151]
对照药材：藏茴香对照药材(北京谱析)，批号:ch03099；1g/瓶。
[0152]
三.供试品溶液对照药材溶液及对照品溶液的制备
[0153]
3.1供试品溶液的制备：取本品(藏茴香药材，下同)1g，研细(过五号筛)，加甲醇15ml，超声10min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0154]
3.2对照药材溶液的制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，同法制成对照材溶液。
[0155]
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液，对照药材和供试品溶液点样量为5μl，分别点于同一硅胶g板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(10∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。供试品色谱中，在于对照药材相应的位置上显相同颜色的斑点。
[0156]
四.试验研究
[0157]
(一)称样量筛选
[0158]
1.样品处理
[0159]
供试品溶液制备：分别取本品0.5g、1g、1.5g，研细(过五号筛)，加甲醇15ml，加热回流30min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0160]
对照药材溶液制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，同法制成对照药材溶液。
[0161]
吸取上述四种溶液，对照药材和供试品溶液点样量为5μl，分别点于同一硅胶g板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
[0162]
2.试验结果
[0163]
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显示2个相同颜色的斑点。
[0164]
另，称样量筛选小结：
[0165]
在薄层色谱中，通过观察分析，当样品称样量为1g时，供试品斑点与对照药材斑点大小基本一致，颜色一致，称样量为0.5g时斑点较大,1.5g时斑点较大。称样量为1g时可以满足鉴别要求，所以确定藏茴香药材薄层色谱鉴别称样量为1g。
[0166]
(二)样品处理方式筛选
[0167]
1.样品处理
[0168]
供试品溶液制备：取本品1g，研细(过五号筛)，加甲醇15ml，超声30min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液1。
[0169]
取本品1g研细，加甲醇15ml，加热回流30min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液2。
[0170]
对照药材溶液制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，同法制成对照药材溶液。
[0171]
吸取上述三种溶液，对照药材和供试品溶液点样量为5μl，分别点于同一硅胶g板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
[0172]
2.试验结果
[0173]
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显示2个相同颜色的斑点。
[0174]
3.处理方式筛选小结
[0175]
在薄层色谱中，通过观察分析，超声方式处理样品和回流方式处理样品在与对照药材相应的位置上有相同颜色的色谱斑点。超声处理比回流处理方法操作更加简便，所以确定样品处理方式为超声。
[0176]
(三)样品处理超声时间筛选
[0177]
1.样品制备
[0178]
供试品溶液制备：取本品1g，研细(过五号筛)，加甲醇15ml，超声10min、20min、30min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0179]
对照药材溶液制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，同法制成对照药材溶液。
[0180]
吸取上述四种溶液，对照药材和供试品溶液点样量为5μl，分别点于同一硅胶g板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
[0181]
2.试验结果
[0182]
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显示2个相同颜色的斑点。
[0183]
3.超声时间筛选小结
[0184]
在薄层色谱中，通过观察分析，超声10，20，30分钟样品与对照药材有相同颜色的斑点。超声处理为10分钟，使得试验更加便捷。所以确定超声时间为10分钟。
[0185]
(四)点样量筛选
[0186]
供试品溶液制备：取本品1g，研细(过五号筛)，加甲醇15ml，超声10min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0187]
对照药材溶液制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，同法制成对照药材溶液。
[0188]
吸取上述两溶液，对照药材点样量5μl，供试品溶液点样量为2μl、5μl，10μl分别点于同一硅胶g板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
[0189]
2.试验结果
[0190]
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显示2个相同颜色的斑点。
[0191]
3.点样量筛选小结
[0192]
在薄层色谱中，通过观察分析，点样量为2μl时斑点颜色偏浅，点样量为10μl时斑点颜色偏深，所以确定点样量为5μl或10μl。
[0193]
(五)薄层板筛选
[0194]
1.样品制备
[0195]
供试品溶液制备：取本品1g，研细(过五号筛)，加甲醇15ml，超声10min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0196]
对照药材溶液制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，同法制成对照药材溶液。
[0197]
吸取上述四种溶液，对照药材和供试品溶液点样量为5μl分别点于硅胶g板、m板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(12∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
[0198]
2.试验结果
[0199]
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显示2个相同颜色的荧光斑点。
[0200]
3.薄层板筛选小结
[0201]
通过观察分析，与普通g板相比使用默克(m)板斑点显示更加清晰，但是考虑到默克板成本较高且普通板可以满足藏茴香的鉴别，所以确定的薄层板为普通硅胶g板。
[0202]
(六)展开剂筛选
[0203]
1.样品制备
[0204]
供试品溶液制备：取本品1g，研细(过五号筛)，加甲醇15ml，超声10min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0205]
对照药材溶液制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，同法制成对照药材溶液。
[0206]
吸取上述四种溶液，对照药材和供试品溶液点样量为5μl分别点于硅胶g板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(8∶1)、环己烷-乙酸乙酯(10∶1)、环己烷-乙酸乙酯(12：1)、环己烷-乙酸乙酯(14∶1)、环己烷-乙酸乙酯(15∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
[0207]
2.试验结果
[0208]
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显示2个相同颜色的斑点。
[0209]
3.薄层板筛选小结
[0210]
在薄层色谱中，通过观察分析，当展开剂为环己烷-乙酸乙酯(10∶1)时斑点显示最清晰，形状规则，当展开剂环己烷-乙酸乙酯比例低于8∶1或者高于15：1时最上面的点不好看，比较分散且环己烷比例越大，两个斑点的距离越小。所以确定藏茴香鉴别的展开剂为环己烷-乙酸乙酯比例为8-15∶1，所得图谱均有2个分开的斑点，比例10-12∶1时两个斑点分离度较好，10∶1时分离度最佳。
[0211]
(七)专属性
[0212]
供试品溶液的制备：取藏茴香药材、2批藏茴香药材样品各1g，另取2批含藏茴香的六味明目丸、不含藏茴香的六味明目阴性样品各2g，上述样品分别研细(过五号筛)、加甲醇15ml，超声10min，冷却，滤头滤过，取续滤液，其中六味明目丸及阴性对照样品的续滤液还需进一步浓缩至一半体积作为供试品溶液。
[0213]
对照药材溶液的制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，超声10min，冷却，滤头滤过，取续滤液，制成对照药材溶液。
[0214]
照薄层色谱法试验，吸取上述6种溶液，点样量为5μl，分别点于同一硅胶g板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(10∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
[0215]
2.试验结果
[0216]
供试品色谱中，藏茴香药材样品及六味明目丸样品在与对照药材色谱相应的位置上显示2个相同颜色的斑点，阴性对照相同位置无斑点。
[0217]
3.专属性小结：在薄层色谱中，通过观察分析，阴性空白无干扰，此方法专属性强。
[0218]
(八)藏茴香鉴别方法重复(重复性)
[0219]
供试品溶液的制备：3个人重复操作，各取3批藏茴香药材1g，研细(过五号筛)，加甲醇15ml，超声10min，冷却，滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0220]
对照药材溶液的制备：另取藏茴香对照药材细粉0.25g，加甲醇5ml，同法制成对照药材溶液。
[0221]
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液，对照药材和供试品溶液点样量为5μl，分
别点于同一硅胶g板上，使用前按药典方法于110℃烘干30min活化，展开前先于展开缸内预饱和15min，点样后吹风机吹干，以环己烷-乙酸乙酯(10∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
[0222]
2.试验结果
[0223]
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显示2个相同颜色的斑点。
[0224]
3.重复性小结：在薄层色谱中，通过观察分析，此方法由不同人或不同时间不同样品操作，重现性良好。
[0225]
综上所述，本发明所述的藏茴香的鉴别方法，展开后可得到两个明显的特征斑点，且分离度较好；所得特征斑点稳定，边界清晰，可长时间放置后观察；本发明处理方法操作简便，处理过程无需加热、无需使用易燃易爆和易制毒的乙醚，直接超声后过滤便可进行薄层鉴别，操作简便，大大缩短试验时间。
[0226]
本发明上述实施方案，只是举例说明，不是仅有的，所有在本发明范围内或等同本发明的范围内的改变均被本发明包围。

技术特征：
1.一种藏茴香的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：a、供试品溶液制备：取藏茴香药材细粉1重量份或其制剂细粉2重量份，加体积重量比为6-18的甲醇，回流30min或者超声10-20分钟，冷却至室温，滤过，取藏茴香药材续滤液作为供试品溶液，或将藏茴香制剂细粉的续滤液进一步浓缩至一半体积的浓缩液作为供试品溶液；b、对照药材溶液制备：取藏茴香对照药材细粉0.25重量份，加体积重量比为16-24的甲醇，超声处理10-20分钟，冷却至室温，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液；c、薄层色谱展开：先将硅胶板于110℃烘干30分钟活化，再吸取对照药材溶液和供试品溶液各5μl或10μl，分别点于同一硅胶板上，吹风机吹干后置于展开缸内预饱和15分钟，以体积比8-15∶1的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；d、图谱鉴别：观察对比鉴别图谱中各斑点的大小、位置、颜色和rf值。2.根据权利要求1所述的藏茴香的鉴别方法，其特征在于，在步骤a的供试品溶液制备过程中，所述的体积重量比为10-15。3.根据权利要求1所述的藏茴香的鉴别方法，其特征在于，在步骤a的供试品溶液制备过程中，所述的体积重量比为15。4.根据权利要求1所述的藏茴香的鉴别方法，其特征在于，在步骤b的对照药材溶液制备过程中，加体积重量比为20的甲醇。5.根据权利要求1所述的藏茴香的鉴别方法，其特征在于，在步骤b的对照药材溶液制备过程中，所述的超声处理时间为10分钟。6.根据权利要求1所述的藏茴香的鉴别方法，其特征在于，在步骤c的薄层色谱展开中，所述的展开剂为体积比10-12∶1的环己烷-乙酸乙酯。7.根据权利要求1所述的藏茴香的鉴别方法，其特征在于，在步骤c的薄层色谱展开中，所述的展开剂为体积比10∶1的环己烷-乙酸乙酯。8.根据权利要求1-7任一项所述的藏茴香的鉴别方法，其特征在于，在步骤c的薄层色谱展开中，所述的硅胶板为g板或m板。9.一种权利要求1-8任一项所述的藏茴香的鉴别方法在对藏茴香药材或含藏茴香药材制剂进行鉴别中的应用。

技术总结
本发明公开了一种藏茴香的鉴别方法及其应用，所述方法包括如下步骤：A、取藏茴香药材细粉或其制剂细粉加入甲醇，制备供试品溶液；B、取藏茴香对照药材细粉加入甲醇，制备对照药材溶液；C、以环己烷-乙酸乙酯为展开剂展开；D、图谱鉴别；本发明的方法可应用于对藏茴香药材或含藏茴香药材制剂进行鉴别。本发明展开后可得到两个明显的特征斑点，且分离度较好；所得特征斑点稳定，边界清晰，可长时间放置后观察；本发明处理过程无需加热、无需使用易燃易爆和易制毒的乙醚，直接超声后过滤便可进行薄层鉴别，操作简便，大大缩短试验时间。大大缩短试验时间。大大缩短试验时间。


技术研发人员：杨秦亮 彭坤 王振 陈菲菲 田小雪 王爱芳 刘颖 却仍卓么
受保护的技术使用者：金诃藏药（山东）健康产业有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/20