转录因子SmMYB13在提高植物耐旱性中的应用

转录因子smmyb13在提高植物耐旱性中的应用
技术领域
1.本发明属于蔬菜与逆境胁迫技术领域，具体涉及转录因子smmyb13在提高植物耐旱性中的应用。


背景技术：

2.植物的茎、叶、果实等器官表面都覆盖着一层由表皮细胞构成的角质层，角质层被分为角质和蜡质。表皮蜡质是植物表皮与环境接触的第一道屏障，他在保护植物方面起到重要的作用，保护植物免受各种生物和非生物胁迫。植物表皮的蜡质是一种多有机物混合物，其具备的疏水结构会密集地覆盖在植物叶片的表层，其生理的功能状态就是为了有效防止水分的散失，从而降低蒸腾作用，促进干旱地区植物的生长，达到植物体内水分的自平衡。植物表皮叶片蜡质厚度和密实程度越高，那么植物相对应的抗旱能力会越强。
3.茄子作为人们日常生活中常见的一种蔬菜，其富含大量的花青素，具有较高的营养价值。在茄子生长中后期(开花坐果)，要求水分充足，如果遇到干旱会严重影响其生长发育。而已经有大量的研究表明植物表皮蜡质能够提高植物的抗旱性，但是目前这类研究仅在玉米、小麦、番茄等物种中进行研究，在茄子是鲜有的。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供转录因子smmyb13在提高植物耐旱性中的应用，本发明的smmyb13蛋白来源于茄子，smmyb13蛋白能够调控植物表皮蜡质来植物表皮蜡质。
5.本发明提供了smmyb13蛋白，所述smmyb13蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明还提供了上述方案所述smmyb13蛋白的编码基因smmyb13基因，所述smmyb13基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明还提供了上述方案所述的smmyb13蛋白或者所述的smmyb13基因在调控植物抗旱性中的应用。
8.本发明还提供了正调控上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因在提高植物抗旱性中的应用。
9.本发明还提供了正调控上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因在1)～3)所示中的一个或几个方面中的应用：1)促进植物表皮蜡质的积累；2)降低植物表皮的渗透性；3)降低植物对脱落酸的敏感性；4)提高植物中抗氧化酶含量和/或降低丙二醛含量。
10.优选的，所述正调控上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因通过试剂诱导和/或采用基因工程的手段在植物中过表达smmyb13蛋白和/或smmyb13基因实现；所述试剂包括nacl、peg6000或脱落酸。
11.优选的，所述脱落酸的工作浓度包括10mg/l；所述nacl的工作浓度包括0.1～0.15mol/l；所述peg6000的工作浓度包括体积浓度15％。
12.优选的，所述植物包括茄子或拟南芥。
13.优选的，所述抗氧化酶包括sod、pod和cat中的一种或几种。
14.本发明还提供了一种提高植物抗旱性和/或构建耐旱植株的方法，包括以下步骤：在植物中过表达上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因。
15.本发明提供了smmyb13蛋白，所述smmyb13蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。本发明的smmyb13蛋白能够响应盐胁迫和干旱胁迫。smmyb13蛋白过表达能够促进植物表皮蜡质的积累、降低植物表皮的渗透性、降低植物对脱落酸的敏感性以及提高植物中抗氧化酶含量和降低丙二醛含量，从而能够提高植物抗旱性。将smmyb13蛋白的转录因子smmyb13的过表达载体异源转化拟南芥后，发现拟南芥的蜡质含量显著增加了。并且smmyb13过表达后改变了拟南芥叶片的通透性，通过tb染色和失水率的测定，发现野生型的拟南芥比smmyb13过表达拟南芥更容易染色，并且失水率更高。在aba处理下，野生型拟南芥的发芽率和根长明显低于smmyb13过表达株系。通过10天的干旱处理，发现野生型拟南芥比smmyb13过表达株系受到的胁迫更为严重。并且sod、pod和cat酶活性在干旱胁迫后都呈现升高趋势，smmyb13过表达株系中的sod、pod和cat显著高于野生型。测定aba信号相关的基因表达发现，smmyb13过表达后，aba相关基因分别有明显的上下调，降低了对aba的敏感性，增强了抗旱性。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为smmyb13基因全长pcr克隆电泳；
18.图2为利用interproscan在线工具分析smmyb13蛋白的结构；
19.图3为smmyb13蛋白三级结构的预测；
20.图4为smmyb13转录激活活性的验证结果；
21.图5为smmyb13基因的组织定量；
22.图6为smmyb13基因相对表达情况，其中，a～g分别代表不同浓度nacl处理、不同浓度peg6000处理、0.1mol/llnacl溶液处理、10mg/laba溶液喷施、15％peg6000溶液处理、4℃低温处理、45℃高温处理；
23.图7为抗性阳性株系smmyb13的筛选；
24.图8为拟南芥过表达株系smmyb13 dna水平鉴定；
25.图9为拟南芥过表达株系smmyb13基因表达情况；
26.图10为野生型和smmyb13过表达株系叶片的表皮蜡质的含量和组成；其中，a为总蜡质含量，b为蜡成分，c为在野生型和两种转基因植株的叶片中鉴定的蜡质；fa-脂肪酸；alk-烷烃；ald-醛；alc-醇；est-酯；ket-酮；
27.图11为tb染色后野生型和smmyb13过表达株系拟南芥叶片的表型；
28.图12为野生型拟南芥和smmyb13过表达株系拟南芥失水率统计结果；
29.图13为发芽率试验；其中，a为培养皿中拟南芥种子分布情况；b～f分别为拟南芥野生型和过表达株系在不同处理下的萌发情况：b为对照1/2ms，c为1/2ms+0.25μmaba，d为1/2ms+0.5μmaba，e为1/2ms+1μmaba，f为1/2ms+1.5μmaba；
30.图14为野生型拟南芥和smmyb13过表达株系拟南芥在不同处理下的根生长情况；
其中，a为1/2ms处理，b为1/2ms+10μmaba处理，c为1/2ms+6％aba处理，d为根延伸长度统计，7天后拍照统计；
31.图15为干旱处理野生型拟南芥和smmyb13过表达株系；
32.图16为野生型拟南芥和过表达株系在盐胁迫后sod、cat、pod活性和mda含量，其中a为sod活性，b为cat活性，c为pod活性，d为mda含量；
33.图17为野生型拟南芥和过表达smmyb13株系中aba应答和调节基因的表达模式。
具体实施方式
34.本发明提供了smmyb13蛋白，所述smmyb13蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：
35.mgrtpccekkglkrgpwnkieddllinyikknghpnwralpklagllrcgkscrlrwtnylrpdikrgnftpqeedaiiklhqvlgnrwsaiaaklpgrtdneikniwhtrlkkkmsdsqpqgtpkikvetsksneifdadtepenskdnseisspktsieiqqqpssstlsssssedscsntnatsfeskdeiiwdnllevdddiwsevlwapvddnnlnlslmeenyqinssfndnwfwddlftrsnelmlelpel。
36.在本发明中，所述smmyb13蛋白的分子式为c
1295h2032n362o416
s9，分子量为29617.09。等电点(pi)为5.11。不稳定系数为55.20，大于40，该蛋白为不稳定蛋白，带负电荷残基总数(asp+glu)为41，带正电荷残基总数(arg+lys)为33。smmyb13蛋白的第34位天冬氨酸亲水性最强，疏水性值为-2.8，第41位的亮氨酸疏水性最强，疏水值为1.433。平均疏水性(gravy)为-0.846，小于0，推测为亲水蛋白，综合推测smmyb13蛋白是亲水性不稳定蛋白。
37.在本发明中，所述smmyb13蛋白中磷酸位点最多的是丝氨酸(ser)，其次是苏氨酸(thr)，最少的是酪氨酸(tyr)。
38.在本发明中，所述smmyb13蛋白还有myb结构域，分别是sant结构域(ipr001005)和hth结构域(ipr017930)；sant结构域存在于核受体辅抑制子和许多染色质重塑复合体的亚基中，它与myb相关蛋白的dna结合域有很强的结构相似性。两者都是由三个α螺旋组成的串联重复序列，它们排列在一个螺旋螺旋基序中，每个α螺旋都含有大量芳香残基。尽管总体上有相似之处，但也有不同之处，表明sant结构域在功能上不同于myb dna结合域。myb型hth结构域是一个由大约55个氨基酸组成的dna结合的螺旋-转角-螺旋(hth)结构域，通常发生在真核转录因子的串联重复序列中。
39.在本发明中，所述smmyb13蛋白不具有信号肽和跨膜结构。
40.在本发明中，所述smmyb13蛋白的二级结构中含有α-螺旋和无规卷曲；所述smmyb13蛋白的三级结构三维立体图如图3所示。
41.在本发明中，所述smmyb13蛋白主要定位于细胞核和线粒体(表1)。
42.表1smmyb13蛋白亚细胞定位预测
[0043][0044]
本发明还提供了上述方案所述smmyb13蛋白的编码基因smmyb13基因，所述
smmyb13基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体为：
[0045]
atgggaagaactccttgctgtgagaagaagggattgaaaagaggtccatggaacaaaatagaagatgatttactcatcaattacattaagaaaaatggtcatcccaattggcgtgcacttccaaaacttgcaggtctattaaggtgcggaaaaagttgtaggcttcgatggactaattacttgagacctgatattaaaagaggcaattttactcctcaagaagaagatgccattatcaaattgcatcaagttcttggaaacaggtggtctgcaattgctgcaaaattaccaggaagaacagataatgaaataaaaaatatttggcacactcgtctgaagaagaaaatgagtgattctcagcctcaaggaaccccaaagataaaagtagaaacatcaaaatccaatgaaatatttgacgcagatacggagcccgagaattccaaggataattctgaaatatcgagtcctaaaacaagtattgagattcagcaacaaccaagttcttccacactatcatcatcatcgagtgaagattcatgttcaaacacaaatgcaacgagttttgagtcgaaagatgaaataatatgggataatttattggaagttgatgacgatatttggtccgaggtactatgggcaccggtcgatgacaataatcttaatttgtcgttaatggaggaaaattaccagattaattccagctttaatgataattggttttgggatgatctttttaccagatccaatgagttgatgttagaattacctgaattatga。
[0046]
本发明对smmyb13基因(sme2.5_00014.1_g00027.1)进行克隆并测序，发现该基因长777bp，编码258个氨基酸。
[0047]
在本发明中，所述smmyb13基因具有转录激活活性。
[0048]
在本发明中，所述smmyb13基因在根、茎、叶、果皮、花和果肉中均有表达，在果皮和叶片中的表达含量最高。
[0049]
在本发明中，所述smmyb13在进化上与马铃薯stmyb13亲缘关系最近。通过转录活性分析发现，smmyb13基因具有转录激活活性。smmyb13主要在果皮和叶中发挥作用。当茄子进行旱胁迫或脱落酸(aba)处理时，smmyb13表达显著上调。
[0050]
本发明还提供了上述方案所述的smmyb13蛋白或者所述的smmyb13基因在调控植物抗旱性中的应用。
[0051]
本发明还提供了正调控上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因在提高植物抗旱性中的应用。
[0052]
在本发明中，所述提高植物抗旱性优选的通过促进植物表皮蜡质的积累、降低植物表皮的渗透性、降低植物对脱落酸的敏感性以及提高植物中抗氧化酶含量和降低丙二醛含量实现。
[0053]
本发明还提供了正调控上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因在1)～3)所示中的一个或几个方面中的应用：1)促进植物表皮蜡质的积累；2)降低植物表皮的渗透性；3)降低植物对脱落酸的敏感性；4)提高植物中抗氧化酶含量和/或降低丙二醛含量。
[0054]
在本发明中，所述促进植物表皮蜡质的积累优选的包括促进植物叶片表面蜡质的积累。在本发明中，所述促进植物叶片表面蜡质的积累优选的通过(1)～(3)中的一项或几项实现：(1)提高植物叶片表面的总蜡含量；(2)提高植物叶片表面的烷烃总量；(3)降低植物叶片表慢的醛类、酯类和酮类的含量。
[0055]
在本发明中，所述降低植物对脱落酸的敏感性优选的通过调控aba相关基因表达实现。在本发明中，所述调控aba相关基因表达优选的包括：正调控aba信号的负调节因子和/或负调控aba信号的正调节因子；所述aba信号的负调节因子优选的包括abi1和/或abi2；所述aba信号的正调节因子优选的包括abf4、abi5、gtg1、gtg2和pyr1/rcar11中的一种或几种。
[0056]
在本发明中，所述抗氧化酶优选的包括sod、pod和cat中的一种或几种。
[0057]
在本发明中，所述正调控上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因通过试剂诱导和/或采用基因工程的手段在植物中过表达smmyb13蛋白和/或smmyb13基因实现；所述试剂优选的包括nacl、peg6000或脱落酸。
[0058]
在本发明中，所述脱落酸的工作浓度优选的包括10mg/l；所述脱落酸的施用方式优选为喷施；所述nacl的工作浓度优选的包括0.1～0.15mol/l；所述peg6000的工作浓度优选的包括体积浓度15％。
[0059]
本发明对所述基因工程的手段没有特殊限制，采用本领域常见的方法即可。
[0060]
在本发明中，所述植物优选的包括茄子或拟南芥。
[0061]
本发明还提供了正调控上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因在脱落酸胁迫处理和/或peg胁迫处理下提高植物发芽率和/或促进植物生根中的应用。
[0062]
在本发明中，所述脱落酸胁迫处理时的工作浓度优选为0.5～10μm。
[0063]
在本发明中，所述peg胁迫处理时的工作浓度优选为体积浓度6％。
[0064]
本发明还提供了正调控上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因在调控aba相关基因表达中的应用。
[0065]
在本发明中，所述调控aba相关基因表达同上述方案记载的内容，此处不再赘述。
[0066]
本发明还提供了一种提高植物抗旱性和/或构建耐旱植株的方法，包括以下步骤：在植物中过表达上述方案所述的smmyb13蛋白和/或所述的smmyb13基因。
[0067]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的转录因子smmyb13在提高植物耐旱性中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0068]
实施例1茄子smmyb13基因的生物信息学及表达特性分析
[0069]
1、材料与方法
[0070]
1.1植物材料供试茄子材料
‘
qpcq’由上海市农业科学院设施园艺所自主选育。
[0071]
1.2试剂与仪器设备rna提取、反转录、荧光定量试剂盒购于上海翌圣生物科技有限公司；所用引物由北京擎科(上海)公司合成。试验所需仪器及设备主要有移液枪、离心机、低温冷冻离心机、超低温冰箱、高温灭菌锅、超净工作台、凝胶成像仪、pcr仪、荧光定量仪等。
[0072]
1.3试验方法
[0073]
1.3.1smmyb13基因克隆
[0074]
(1)rna的提取
[0075]
《1》将-80℃冻存的茄子组织转移至液氮预冷的研钵中，研磨成粉末；《2》取100g粉末加入到含有500μl buffer rls裂解液的1.5ml的离心管(rnase free)中，高速旋涡，使之充分裂解；《3》将上述裂解液静置2min后，12000rmp4℃离心2min；《4》吸取上清至新的rnase free管；《5》加入1/2体积的无水乙醇，转移至plantrna mini column管中，12000rmp室温离心2min，弃滤液；《6》向plant rna mini column管中加入600μl的buffer rwa，12000rmp室温离心1min，弃滤液；《7》向plantrna mini column管中加入750μl的buffer rwb(加入指定量的无水乙醇)，12000rmp室温离心1min，弃滤液；《8》向plantrna mini column膜中央滴入50μl dnase i反应液，室温静止15min；
[0076]
《9》向plantrna mini column中加入350μl buffer rwb，12000rmp室温离心1min，弃滤液；《10》向plantrna mini column中加入750μl buffer rwb，12000rmp室温离心1min，
弃滤液；《11》将plantrna mini column的吸附柱置于新的2ml collection tube上，12000rmp室温离心2min；《12》将plantrna mini column的吸附柱置于新的rnase free tube，在膜中央加入100μl的rnase free water，室温静置5min，12000rmp室温离心2min得到rna，放于-80℃保存。
[0077]
(2)反转录cdna
[0078]
按照表2内容进行反应液的配制，进行反转录反应。
[0079]
表2反应液的组成
[0080][0081]
反应条件：37℃15min；85℃5sec；4℃；
[0082]
(3)pcr扩增
[0083]
以cdna为模板，利用myb13-f(5'-gctgtgagaagaagggattgaa-3'，seq id no.3)和myb13-r(5'-gcccatagtacctcggaccaaa-3'，seq id no.4)为引物，进行pcr，扩增myb13基因。pcr反应体系参见表3，pcr反应条件参见表4。
[0084]
表3pcr反应体系
[0085][0086]
表4pcr反应条件
[0087][0088][0089]
注：变性、退火和延伸过程进行35个循环。
[0090]
1.3.2smmyb13基因序列与系统进化树的构建
[0091]
利用在线软件fgenesh(http///ww sofberry..com/berry.phtml)预测myb13的基因结构；运用在线软件interproscan:(https://ww.ebi.ac.uk/interpro/search/
sequence-search)预测myb13的蛋白结构域；采用在线软件psipred workench(http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测myb13蛋白的二级结构；通过在线软件swiss-mddel(http://swissmodel.expasy.org/interactive)预测myb13蛋白的三级结构。
[0092]
1.3.3myb13基因的转录活性
[0093]
(1)载体构建：在pgbkt7载体的ncol和bamhi的两个酶切位点处插入myb13基因的ofr序列，构建重组载体；
[0094]
(2)将空载pgbkt7和pgbkt7-myb13分别转化酵母
[0095]
《1》预冷1.5ml的离心管，加入质粒400ng，鲑鱼精(yeastmarker carrier dna)5ul，鲑鱼精使用前预变性：95℃20min；《2》加入50μl酵母感受态，混匀，在加入500ul peg/liac混匀；《3》30℃孵育30min，每10min轻弹混匀；《4》加入20μl dmso，混匀，42℃水浴15min，每5min轻弹混匀；《5》高速离心15sec，去上清，加入ypda液体培养基，混匀；《6》30℃200rmp摇菌1h，离心去上清，用1
×
te悬浮涂sd-try、sd-try-his平板，培养2～3天；《7》挑去单克隆，用灭菌的ddh2o稀释，在含x-α-gal的sd-try固体培养基上点板，30℃倒置培养，观察生长状况；
[0096]
1.3.4myb13基因的表达特异性分析
[0097]
取生长90天
‘
qpcq’的根，幼茎，老茎，花，果肉，果皮，幼叶，老叶贮藏在-80℃；提取rna，反转录cdna后，采用引物myb13-f(catgttcaaacacaaatgcaacgag，seq id no.5)和myb13-r(aagattattgtcatcgaccggtgcc，seq id no.6)进行荧光定量pcr；挑选大小一致，健康饱满的
‘
qpcq’的种子，浸泡一夜，播于发芽盒中，待子叶完全伸展后，移至穴盘中。待幼苗长至两叶一心时，对其0.1mol/llnacl溶液处理(将茄子幼苗使用0.1mol/llnacl溶液的连续浇灌，每次浇透，每棵苗子浇相同的量)、10mg/laba溶液喷施(喷施于叶面)、体积浓度为15％的peg6000溶液处理、4℃低温处理和45℃高温处理，分别于不同时间点(参见图6中的d～g)取幼苗叶片，用于rna提取。
[0098]
2、实验结果
[0099]
2.1smmyb13生物信息学分析
[0100]
2.1.1smmyb13基因克隆及蛋白结构域的分析
[0101]
首先对smmyb13基因进行克隆并测序，结果显示smmyb13基因全长777bp，编码258个氨基酸(图1)。之后利用interproscan在线软件对smmyb13蛋白的结构域进行预测，结果发现该蛋白有两个结构域(图2)，分别是sant结构域(ipr001005)和hth结构域(ipr017930)；sant结构域存在于核受体辅抑制子和许多染色质重塑复合体的亚基中，它与myb相关蛋白的dna结合域有很强的结构相似性。两者都是由三个α螺旋组成的串联重复序列，它们排列在一个螺旋螺旋基序中，每个α螺旋都含有大量芳香残基。尽管总体上有相似之处，但也有不同之处，表明sant结构域在功能上不同于myb dna结合域。myb型hth结构域是一个由大约55个氨基酸组成的dna结合的螺旋-转角-螺旋(hth)结构域，通常发生在真核转录因子的串联重复序列中。
[0102]
2.1.2smmyb13基因的转录激活活性分析
[0103]
为了验证smmyb13转录因子是否具有转录激活活性，在pgbkt7载体的ncol和bamhi的两个酶切位点处插入myb13基因的ofr序列，构建重组载体；将重组载体pgbkt7-myb13和空载分别转化酵母，在sd-try培养基上能正常生长，说明成功转化酵母；在sd-try-his上，pgbkt7载体不能生长，而pgbkt7-myb13载体能够正常生长，说明pgbkt7-myb13载体的酵母
rif和100mg/lkan)液体培养基中，28℃振荡培养至od600为1.2～1.5，6000rpm，离心10min，弃上清。用渗透buffer重悬(10mmmgcl2、5％蔗糖、0.05％sitfwetf-77溶于1l蒸馏水中)，使od600为0.6～0.7。
[0121]
浸染：将前面准备好的拟南芥花序浸于200ml重悬菌液中约1min，其间不停摇晃，使菌液进一步渗透至花序内部。取出后黑暗培养24h，再进行光照培养。
[0122]
鉴定与纯合：遗传转化的拟南芥成熟后，收去种子，即为t1代种子。
[0123]
抗性植株的筛选：转基因拟南芥的种子撒播于穴盘中，待长出幼苗，将basta(巴斯夫欧洲公司，有效成分15％)按照1:500的比例加水配置，喷施于转基因拟南芥的幼苗，含有basta抗性的幼苗会存活下来。
[0124]
2.2dna和rna的提取和阳性植株鉴定
[0125]
采用ctab法提取叶片的dna，以同品种非转基因拟南芥植株dna和h2o为阴性对照，以菌液为阳性对照。根据pearleygate 103-myb13重组载体上特有的基因序列设计引物：
[0126]
pearleygate 103-myb13-f：ctatctgtcacttcatcgaaaggac(seq id no.7)，pearleygate 103-myb13-r：cttggttgttgctgaatctcaatac(seq id no.8)，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察拍照。
[0127]
2.3失水率及tb染色
[0128]
失水率：将叶片在去离子水中黑暗浸泡24h，用餐巾纸吸干多余水分，并在微量天平上每30min称重。
[0129]
tb染色：0.05％甲苯胺蓝(tb)溶液浸泡2h，然后用去离子水冲洗3次，拍照。
[0130]
2.4拟南芥对渗透胁迫的耐受性分析
[0131]
将拟南芥wt和oe株系的种子播于aba(0、0.25、0.5和1.5μm)的1/2ms固体培养基上。用体式显微镜观察拟南芥种子在这些培养基上的发芽情况并统计，并在第4d拍照记录。
[0132]
将灭菌后的拟南芥种子在1/2ms固体培养基上生长4d，10μmaba和6％peg的1/2ms固体培养基上，竖直培养。在处理7d时测量根长，并拍照。
[0133]
2.5转基因拟南芥的干旱处理
[0134]
将col-0和smmyb13过表达株系的种子灭菌后铺在1/2ms固体培养基上，待种子长至四叶期，移至灭菌后的基质中(基质需严格称量，保证每个盆中基质重量一致，水分一致)，在16h光照/8h黑暗，22℃培养，水分适宜的条件下生长4周，然后停止浇水进行干旱处理，10天后观察表型并拍照。
[0135]
2.6拟南芥相关生理指标的测定
[0136]
sod、pod及cat活性和mda含量采用试剂盒法测定，所用试剂盒均来自于苏州格锐思生物科技有限公司。
[0137]
2.7aba响应基因的表达分析
[0138]
为了进行aba响应基因的表达分析，将来自野生型拟南芥和smmyb13过表达系的种子播种在1/2ms溶液饱和的滤纸上。生长21天后，幼苗在含有100μaba+1/2ms溶液的滤纸上处理，分别1h、3h、6h和12h后取样。提取rna，进行荧光定量的测定。引物参见表5。
[0139]
表5aba信号调节因子基因引物
[0140][0141]
[0142][0143]
2.8拟南芥叶片蜡质的测定
[0144]
取20天左右拟南芥叶片(拟南芥抽薹之前)，利用直径为1cm的打孔器，取相同部位的叶片，每个叶片取5个直径为1cm的叶片，作为一个样品重复，将其浸入10ml的氯仿，提取1h后，吸取1ml至离心管，氮气吹干后称重。减去空离心管的重量为蜡质总含量。每个材料重复3次。
[0145]
2.9统计分析
[0146]
用spss软件进行数据分析，采用origin 9.0作图。
[0147]
3、结果与分析
[0148]
3.1过表达smmyb13拟南芥的鉴定
[0149]
将过表达smmyb13的拟南芥种子撒播于穴盘中，待长出幼苗，用配置好的basta溶液喷施，如图7所示，具有basta抗性的幼苗生长健壮，而不具有basta抗性的幼苗，叶片变黄，逐渐死亡。待植株长至4叶时提取dna，dna鉴定结果表明，在被检验的16株抗性植株中，有10株在近777bp处有清晰条带，对照设计引物时的pcr产物，长度相等(图8)。对这10株提取rna，选择三个表达植株最高的植株(图9)，待这三个株系种子成熟后，分株收获，分别命名为oe-1、oe-4和oe-6，保存待用进行扩繁，以备后期试验使用。
[0150]
3.2野生型拟南芥和smmyb13过表达株系叶片蜡质组成
[0151]
gc
–
ms分析表明，两个过表达株系叶片表面的总蜡含量比野生型的增加了2倍左右(图10中的a)。与野生型植株相比，烷烃的总量增加了6倍多，过表达株系中的脂肪酸含量与野生型植株相比仅增加了2倍左右。而醛类、酯类和酮类的含量在过表达株系中显著下降，其中酮类下降最多，与野生型植株相比，过表达株系下降了3倍左右，酯类在两种基因型植株中没有显著差异(图10中的b)。脂肪酸含量在c16、c17、c18、c24、c25、c39中均显著增加，其中c18占脂肪酸含量的45％左右，并且c18在过表达株系中的含量与野生型相比增加了4倍多。烷烃含量的增加主要依靠与c19、c20和c21，c19在过表达株系中的含量与野生型相比增加了10倍左右，c20和c21在过表达株系中的含量与野生型相比分别增加了10倍左右8倍左右。酮的减少主要归因于c22酮的减少(图10中的c)。
[0152]
3.3smmyb13改变拟南芥表皮的渗透性
[0153]
通常来说，蜡质组分的改变影响植物表皮的渗透性，因此，我们通过tb染色测定了拟南芥叶片的渗透性。我们将野生型和过表达株系的拟南芥叶片浸泡在0.05％甲苯胺蓝溶液2h，结果发现，野生型拟南芥叶片比过表达株系的拟南芥叶片更容易染色(图11)。
[0154]
对野生型和过表达株系的拟南芥叶片进行失水率的测定，发现在前1.5h，失水率是相似的，1.5h后，野生型叶片的失水率逐渐高于过表达株系。这些结果表明，过表达smmyb13降低拟南芥叶片的通透性，进而可以提高转基因拟南芥的耐旱性(图12)。
[0155]
3.4smmyb13降低了对aba的敏感性，提高了植物的抗旱性
[0156]
为了验证smmyb13基因在aba反应中的功能，检测了aba处理下野生型和过表达系的发芽率，发现野生型和过表达系在1/2ms平板上的发芽率相似，过表达系的发芽率在处理
的第二天达到约90％以上，其余未发芽的种子在后续时间陆续发芽。尽管随着aba浓度的增加，种子发芽的趋势与对照相比有所下降，但在aba处理后，过表达的发芽率显著高于野生型。例如在1/2ms+0.5μmaba处理下，在第二天wt的发芽率只有50％左右，而过表达的发芽率高达80％左右(图13)。
[0157]
用10μmaba和6％peg处理了野生型和过表达株系，通过对根长的测量分析发现，与对照组相比，在10μmaba和6％peg的处理下，不论是野生型还是过表达株系的根的伸长都受到了抑制，但是过表达株系的根长长度显著高于野生型，并且有较多的侧根，这表明过表达smmyb13后，与野生型相比，过表达株系收到了更小的影响(图14)。
[0158]
为了探究smmyb13过表达拟南芥植株对干旱胁迫的应答，待拟南芥生长一月后停止浇水，在停止浇水的10天后，发现野生型拟南芥叶片几乎全部枯死，而过表达的拟南芥叶片，只有极少数叶片变干枯，证明smmyb13过表达株系与野生型相比受到干旱胁迫的影响较小。(图15)
[0159]
3.5干旱胁迫对拟南芥叶片mda和抗氧化酶活性的影响
[0160]
由图16中的a～c可知，野生型拟南芥和smmyb13过表达株系经干旱处理10天后，sod、pod和cat活性的变化趋势一致，都被诱导升高。oe-1、oe-4和oe-6在干旱胁迫处理后，三种抗氧化酶活性较野生型显著增加。图16中的d显示，野生型拟南芥和smmyb13过表达株系经干旱处理10天后，mda含量显著上升。oe-1、oe-4和oe-6的含量较野生型拟南芥显著降低。
[0161]
3.6smmyb13过度表达改变了aba响应基因的表达
[0162]
为了研究smmyb13是否影响与aba信号相关的基因表达，我们用100μmaba处理野生型拟南芥和过表达株系，我们首先检测了一些应激反应标记基因的表达，结果发现，aba在野生型拟南芥和过表达株系中的基因表达，随着时间的推移，野生型拟南芥和过表达株系表现出相似的表达模式。但是，在aba处理后，smmyb13过表达系表现出比野生型株系显著更高的转录水平，并且大多数转录水平在aba处理3h后达到峰值。因此，我们选择aba调节因子时侯，选择在处理3h后测量转录水平，从图中可以看出，aba信号的负调节因子abi1和abi2在过表达系中上调，而abf4、abi5、gtg1、gtg2、pyr1/rcar11正调控因子在过表达系中下调，相关基因的下调可能限制了转基因植物对aba的感知，降低了对aba的敏感性，增强了对植株的抗旱性(图17)。
[0163]
4、讨论
[0164]
本实施例发现，smmyb13的过表达能够提高拟南芥种子在aba处理下的萌发和根的生长，猜测aba信号转导途径能够诱导smmyb13基因的表达。我们测定aba信号相关的应激反应标记基因的表达情况，即rd29a、rd22、cor47、cor15a、nced3和kin1，这些基因可能可以防止应激诱导的损伤，rd22基因是通过myc和myb途径诱导干旱和aba的应答，而nced3参与并介导aba的应答。当用aba处理野生型和smmyb13过表达株系时，这些基因都上调，尤其是在处理的早期。与野生型植株相比，过表达植株表现出更高水平的转录。接下来，我们分析了在smmyb13过表达系中aba信号调节因子的表达，abi1和abi2编码两种负aba信号负调节因子，在过表达株系中上调，而所有正调节因子，包括abf4、abi5、质膜aba受体gtg1/gtg2和pyr/pyl/rcar，aba受体介导的信号级联基因pyr1/rcar11、pyl2/rcar13、snrk2.2和snrk2.3，均下调。受体相关基因的下调限制过表达smmyb13拟南芥对aba的感知。我们对野
生型和smmyb13过表达拟南芥进行干旱胁迫试验，发现smmyb13过表达拟南芥比野生型更加耐旱。本实施例中，植株内sod、pod和cat酶活性在干旱胁迫后都呈现升高趋势，且smmyb13过表达株系中的sod、pod和cat都显著高于野生型。sod、pod和cat是主要的抗氧化酶，当受到外界胁迫时，植物体内的抗氧化酶活性增大，用于清除外界胁迫诱导产生的活性氧，降低植株受到的毒害效应，起到保护植株的作用。
[0165]
综上所述，本实施例在茄子中鉴定了一个与蜡质合成相关基因smmyb13。smmyb13促进拟南芥表皮蜡的积累，降低植物表皮的渗透性以及对aba的敏感性，从而提高植物的抗旱性。本实施例结果为进一步研究茄子蜡生物合成的分子机制奠定了基础，为提高茄子抗旱性和果实品质提供了候选基因。
[0166]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.smmyb13蛋白，其特征在于，所述smmyb13蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述smmyb13蛋白的编码基因smmyb13基因，其特征在于，所述smmyb13基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.权利要求1所述的smmyb13蛋白或者权利要求2所述的smmyb13基因在调控植物抗旱性中的应用。4.正调控权利要求1所述的smmyb13蛋白和/或权利要求2所述的smmyb13基因在提高植物抗旱性中的应用。5.正调控权利要求1所述的smmyb13蛋白和/或权利要求2所述的smmyb13基因在1)～3)所示中的一个或几个方面中的应用：1)促进植物表皮蜡质的积累；2)降低植物表皮的渗透性；3)降低植物对脱落酸的敏感性；4)提高植物中抗氧化酶含量和/或降低丙二醛含量。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述正调控权利要求1所述的smmyb13蛋白和/或权利要求2所述的smmyb13基因通过试剂诱导和/或采用基因工程的手段在植物中过表达smmyb13蛋白和/或smmyb13基因实现；所述试剂包括nacl、peg6000或脱落酸。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脱落酸的工作浓度包括10mg/l；所述nacl的工作浓度包括0.1～0.15mol/l；所述peg6000的工作浓度包括体积浓度15％。8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述植物包括茄子或拟南芥。9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗氧化酶包括sod、pod和cat中的一种或几种。10.一种提高植物抗旱性和/或构建耐旱植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：在植物中过表达权利要求1所述的smmyb13蛋白和/或权利要求2所述的smmyb13基因。

技术总结
本发明提供了转录因子SmMYB13在提高植物耐旱性中的应用，属于蔬菜与逆境胁迫技术领域；所述SmMYB13蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的SmMYB13蛋白能够响应盐胁迫和干旱胁迫。SmMYB13蛋白过表达能够促进植物表皮蜡质的积累、降低植物表皮的渗透性、降低植物对脱落酸的敏感性以及提高植物中抗氧化酶含量和降低丙二醛含量，从而能够提高植物抗旱性。抗旱性。抗旱性。


技术研发人员：吴雪霞 周亚茹 黄倩茹 张爱冬 肖凯
受保护的技术使用者：上海市农业科学院
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/9/20