长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法与流程

1.本发明涉及长春鳊群体遗传育种技术领域，具体为长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法。


背景技术：

2.鱼类遗传多样性是指鱼类所携带的遗传信息的总和，一般指种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和，是鱼类对人为干扰进行成功反应的决定因素，其遗传变异程度也决定其进化的趋势，是鱼类生存与遗传进化的基础，利用分子技术手段对鱼类遗传多样性研究是分子遗传育种的基础和生物多样性研究的发展趋势之一。
3.近年来天然长春鳊分布范围迅速缩小，种群急剧减少，在规模化繁育技术上，存在亲鱼培育技术不成熟，不能保证规模化繁育，进而严重影响苗种数量，制约产业规模化生产，不能对野生群体、养殖群体及增殖放流群体的遗传多样性进行分析，没有及时了解野生群体资源量减少的遗传学原因，比较人工增殖群体和野生群体的遗传进化差异，因此提出了长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，来解决这个问题。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，具备快速准确的对长春鳊群体遗传多样性分析，筛选长春鳊鱼优良亲本等优点，解决了近年来天然长春鳊分布范围迅速缩小，种群急剧减少，在规模化繁育技术上，存在亲鱼培育技术不成熟，不能保证规模化繁育，进而严重影响苗种数量，制约产业规模化生产，不能对野生群体、养殖群体及增殖放流群体的遗传多样性进行分析，没有及时了解野生群体资源量减少的遗传学原因，比较人工增殖群体和野生群体的遗传进化差异的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，包括以下步骤：
8.1)长春鳊样本采集，采集长春鳊鳍条样本，置于95％乙醇中保存。
9.2)样本dna提取，应用基因组dna提取试剂盒进行基因组dna提取及纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测dna，微量紫外分光光度计测定dna浓度及纯度。
10.3)通过微卫星引物以及线粒体coi引物对样本进行检测，扩增微卫星序列和coi碱基序列。
11.4)通过对获得的微卫星序列和coi碱基序列分析，进行种群分析。
12.5)结合ssr标记和coi标记数据分析结果，对候选亲本群体进行遗传多样性分析，对筛选出遗传多样性丰富且遗传距离较远的亲本用于人工繁殖。
13.优选的，所述长春鳊样本采集通过安排相关人员对不同地区、不同流域长春鳊群体进行观察，选取长势较好死亡率低的长春鳊个体，对其进行样本采集，将采集的长春鳊鳍
条样本，置于95％乙醇中保存。
14.优选的，所述样本dna提取通过应用基因组dna提取试剂盒进行基因组dna提取及纯化，用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入sds破裂核膜，用蛋白酶k使核蛋白降解成小片段并从dna上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀dna，75％乙醇洗涤dna沉淀，真空干燥后，溶解于te中即得到高分子量的dna，然后通过1％琼脂糖凝胶对dna进行电泳检测，再通过微量紫外分光光度计测定dna浓度及纯度，-20℃保存备用。
15.优选的，所述通过微卫星引物筛选即先筛选遗传多样性丰富的长春鳊微卫星引物10对，然后在筛选出的微卫星引物中依次选取其中1条引物的dna加fam/hex/tamra等标记，合成荧光引物。对提取的基因组dna进行pcr扩增，pcr产物应用3730xl基因分析仪检测。所述线粒体coi引物对样本进行筛选即应用筛选出的线粒体coi引物对提取的基因组dna进行pcr扩增，并用凝胶纯化回收试剂盒对pcr产物纯化回收，将回收产物经测序仪进行碱基序列测定。
16.优选的，所述通过对获得的微卫星序列和coi碱基序列分析，进行种群分析分为ssr数据分析和coi数据分析，所述ssr数据分析采用popgen32软件处理，计算等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、香农信息指数(i)、hardy-weinberg平衡检验(p值)、近交系数(fis)、分化系数(fst)和基因流(nm)，采用pic-calc计算平均多态信息含量(pic)，构建系统进化树，分析长春鳊群体遗传多样性，所述coi数据分析采用dnastar软件对测得序列进行分析编辑，利用clustal x对所有序列进行序列比对，计算种间及种内遗传距离，分析长春鳊群体间及群体内个体间遗传多样性。
17.优选的，所述结合ssr标记和coi标记数据分析结果，对候选亲本群体进行遗传多样性分析，通过使用列表法以及制图法将ssr标记和coi标记数据分析结果通过图表的形式进行直观的体现，对两种检测方法获得的数据进行对比分析，从而选取品质优良的长春鳊群体进行人工繁育。
18.优选的，所述对筛选出遗传多样性丰富且遗传距离较远的亲本用于人工繁殖通过对长春鳊群体进行遗传多样性分析选取遗传多样性丰富且遗传距离较远的长春鳊个体，将其集中放置在适宜的池塘中进行繁殖，对其后代进行遗传检测，筛选出体格健壮子代的特有基因作为下一代亲本基因筛选条件，从而繁育出优良的长春鳊鱼。
19.(三)有益效果
20.与现有技术相比，本发明提供了长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，具备以下有益效果：
21.1、该长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，应用微卫星标记和线粒体coi标记两种分子检测技术进行长春鳊遗传多样性研究，分别在核基因组dna和mtdna层次上研究长春鳊群体遗传变异，使研究更全面，结果更可靠，通过长春鳊种质资源调查、保存及遗传学研究，可科学地实现长春鳊资源的可持续利用，更全面更系统地阐明长春鳊种群间及种群内的遗传多样性水平，从分子遗传学角度筛选优良亲本用于改善人工养殖群体的群体遗传质量。
22.2、该长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，通过针对候选亲本群体进行遗传多样性筛选，选择遗传多样性丰富的亲本用于人工繁殖，从根本上改善人繁群体质量，通过pcr将微卫星序列扩增出来，经过电泳可获得其多态性，具有共显性、多态性好、重
复性好、操作简便和稳定可靠的特点，通过鱼类线粒体细胞色素氧化酶i亚基来分析长春鳊的种群遗传多样性，根据获得的线粒体coi基因序列全长设计引物扩增coi基因部分序列为标记，一方面可以初步了解长春鳊的种群遗传多样性，另一方面可以了解环境改变对鱼类群体的影响，并进一步从分子水平了解环境对生物多样性的影响，为保护生态环境提供依据。
具体实施方式
23.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，包括以下步骤：
25.1)长春鳊样本采集，采集长春鳊鳍条样本，置于95％乙醇中保存。
26.2)样本dna提取，应用基因组dna提取试剂盒进行基因组dna提取及纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测dna，微量紫外分光光度计测定dna浓度及纯度。
27.3)通过微卫星引物以及线粒体coi引对样本进行检测，扩增微卫星序列和coi碱基序列。
28.4)通过对获得的微卫星序列和coi碱基序列分析，进行种群分析。
29.5)结合微卫星标记和coi标记数据分析结果，对候选亲本群体进行遗传多样性分析，筛选遗传距离远的亲本用于人工繁殖。
30.实施例一：
31.长春鳊样本采集通过安排相关人员对不同地区、不同流域长春鳊群体进行观察，选取长势较好死亡率低的长春鳊个体，对其进行样本采集，将采集的长春鳊鳍条样本，置于95％乙醇中保存。
32.样本dna提取通过应用基因组dna提取试剂盒进行基因组dna提取及纯化，用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入sds破裂核膜，用蛋白酶k使核蛋白降解成小片段并从dna上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀dna，75％乙醇洗涤dna沉淀，真空干燥后，溶解于te中即得到高分子量的dna，然后通过1％琼脂糖凝胶对dna进行电泳检测，再通过微量紫外分光光度计测定dna浓度及纯度，-20℃保存备用。
33.通过微卫星引物筛选即先筛选遗传多样性丰富的长春鳊微卫星引物10对，然后在筛选出的微卫星引物中依次选取其中1条引物的dna加fam/hex/tamra等标记，合成荧光引物。对提取的基因组dna进行pcr扩增，pcr产物应用3730xl基因分析仪检测。所述线粒体coi引物对样本进行筛选即应用筛选出的线粒体coi引物对提取的基因组dna进行pcr扩增，并用凝胶纯化回收试剂盒对pcr产物纯化回收，将回收产物经测序仪进行碱基序列测定。
34.通过对获得的微卫星序列和coi碱基序列分析，进行种群分析分为ssr数据分析和coi数据分析，ssr数据分析采用popgen32软件处理，计算等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、香农信息指数(i)、hardy-weinberg平衡检验(p值)、近交系数(fis)、分化系数(fst)和基因流(nm)，采用pic-calc计算平均多态信息含量(pic)，构建系统进化树，分析长春鳊群体遗传多样性，coi数据分析采用dnastar软件对测
得序列进行分析编辑，利用clustalx对所有序列进行序列比对，计算种间及种内遗传距离，分析长春鳊群体间及群体内个体间遗传多样性，通过构建长春鳊鱼系统进化树可以更好的观察其在培育过程中不同dna的遗传走向，方便去除影响长春鳊群发展的基因，使长春鳊鱼可以更快的繁殖出优良的长春鳊鱼群。
35.结合ssr标记和coi标记数据分析结果，对候选亲本群体进行遗传多样性分析，通过使用列表法以及制图法将ssr标记和coi标记数据分析结果通过图表的形式进行直观的体现，对两种检测方法获得的数据进行对比分析，从而选取品质优良的长春鳊群体进行人工繁育。
36.对筛选出遗传多样性丰富且遗传距离较远的亲本用于人工繁殖通过对长春鳊群体进行遗传多样性分析选取优良的长春鳊鱼个体，将其集中放置在适宜的水池中进行繁殖，对其后代进行遗传检测，筛选出体格健壮子代的特有基因作为下一代亲本基因筛选条件，从而繁育出优良的长春鳊鱼。
37.综上，该长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，先通过安排专业人员对野生长春鳊鱼以及人工养殖的长春鳊鱼进行样本选取，然后进行微卫星和线粒体dna标记，通过微卫星引物以及线粒体coi引物对样本进行筛选，扩增微卫星序列和coi碱基序列，筛选出多态性良好的微卫星引物以及扩增效果良好的coi引物序列，对长春鳊dna进行pcr扩增，然后通过使用popgen32软件和dnastar软件对数据进行分析，将采集的数据通过图表进行具体体现，然后对筛选的长春鳊鱼进行繁殖，在繁殖的过程中逐渐对长春鳊鱼基因进行选择淘汰，得到具有繁殖力高且体态优良的长春鳊鱼进行大规模养殖。
38.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)长春鳊样本采集，采集长春鳊鳍条样本，置于95％乙醇中保存。2)样本dna提取，应用基因组dna提取试剂盒进行基因组dna提取及纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测dna纯度，微量紫外分光光度计测定dna浓度及纯度。3)通过微卫星引物以及线粒体coi引物对样本进行检测，扩增微卫星序列和coi碱基序列。4)通过对获得的微卫星序列和coi碱基序列分析，进行种群分析。5)结合微卫星标记和coi标记数据分析结果，对候选亲本群体进行遗传多样性分析，筛选遗传距离远的亲本用于人工繁殖。2.根据权利要求1所述的长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，其特征在于，所述长春鳊样本采集通过安排相关人员对不同地区、不同流域长春鳊群体进行观察，选取长势较好死亡率低的长春鳊个体，对其进行样本采集，将采集的长春鳊鳍条样本，置于95％乙醇中保存。3.根据权利要求1所述的长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，其特征在于，所述样本dna提取通过应用基因组dna提取试剂盒进行基因组dna提取及纯化，用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入sds破裂核膜，用蛋白酶k使核蛋白降解成小片段并从dna上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀dna，75％乙醇洗涤dna沉淀，真空干燥后，溶解于te中即得到高分子量的dna，然后通过1％琼脂糖凝胶对dna进行电泳检测，再通过微量紫外分光光度计测定dna浓度及纯度，-20℃保存备用。4.根据权利要求1所述的长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，其特征在于，所述通过微卫星引物筛选即先筛选遗传多样性丰富的长春鳊微卫星引物10对，然后在筛选出的微卫星引物中依次选取其中1条引物的dna加fam/hex/tamra等标记，合成荧光引物。对提取的基因组dna进行pcr扩增，pcr产物应用3730xl基因分析仪检测。所述线粒体coi引物对样本进行筛选即应用筛选出的线粒体coi引物对提取的基因组dna进行pcr扩增，并用凝胶纯化回收试剂盒对pcr产物纯化回收，将回收产物经测序仪进行碱基序列测定。5.根据权利要求1所述的长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，其特征在于，所述通过对获得的微卫星序列和coi碱基序列分析，进行种群分析分为ssr数据分析和coi数据分析，所述ssr数据分析采用popgen32软件处理，计算等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、香农信息指数(i)、hardy-weinberg平衡检验(p值)、近交系数(fis)、分化系数(fst)和基因流(nm)，采用pic-calc计算平均多态信息含量(pic)，构建系统进化树，分析长春鳊群体遗传多样性。所述coi数据分析采用dnastar软件对测得序列进行分析编辑，利用clustal x对所有序列进行序列比对，计算种间及种内遗传距离，分析长春鳊群体间及群体内个体间遗传多样性。6.根据权利要求1所述的长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，其特征在于，所述结合ssr标记和coi标记数据分析结果，对候选亲本群体进行遗传多样性分析，通过使用列表法以及制图法将ssr标记和coi标记数据分析结果通过图表的形式进行直观的体现，对两种检测方法获得的数据进行对比分析，从而选取品质优良的长春鳊群体进行人工繁育。7.根据权利要求1所述的长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，其特征在
于，所述对筛选出遗传多样性丰富且遗传距离较远的亲本用于人工繁殖，通过对长春鳊群体进行遗传多样性分析选取遗传多样性丰富且遗传距离较远的长春鳊个体，将其集中放置在适宜的池塘中进行繁殖，对其后代进行遗传检测，筛选出体格健壮子代的特有微卫星基因作为下一代亲本基因筛选条件，从而繁育出优良的长春鳊鱼。

技术总结
本发明涉及长春鳊群体遗传育种技术领域，且公开了长春鳊群体遗传多样性分析及优良亲本筛选方法，包括以下步骤：长春鳊样本采集，采集长春鳊鳍条样本，置于95％乙醇中保存。样本DNA提取，应用基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取及纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA，应用微卫星标记和线粒体COI标记两种分子检测技术进行长春鳊遗传多样性研究，分别在核基因组DNA和mtDNA层次上研究长春鳊群体遗传变异，使研究更全面，结果更可靠，通过长春鳊种质资源调查、保存及遗传学研究，可科学地实现长春鳊资源的可持续利用，更全面更系统地阐明长春鳊种群间及种群内的遗传多样性水平，从分子遗传学角度筛选优良亲本用于改善人工养殖群体的群体遗传质量。群体遗传质量。


技术研发人员：闫春梅 柳鹏 金香琴 刘慧吉 李玲雪 肖志国 李秀颖 张莹 刘长有 陈婵娟 郑伟
受保护的技术使用者：吉林省水产科学研究院
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/9/20