一种适用于多类型样本的病毒保存液及其应用的制作方法

1.本发明属于病毒保存液的技术领域，具体涉及一种适用于多类型样本的病毒保存液及其应用。


背景技术：

2.基核酸检测技术是通过对患者的呼吸道样本、体液样本、粪便样本、组织样本、血液样本等各类型样本中进行核酸提取，将所得纯化后核酸模板可用于多种下游检测应用，如pcr、基因分型、基因测序等，以提示患者是否存在病原体感染。
3.目前病毒样本保存液分为灭活型与非灭活型，灭活型病毒保存液作为样本储存介质，需满足样本保护与实验人员保护，在样本保护方面，被保存样本核酸需在长期保存中不被dna酶与rna酶降解，以此保证检测时灵敏度。在实验人员保护方面，被保存样本中病原体需被灭活，失去传染性从而保护实验人员。
4.目前国内外各大主流厂家的病毒保存液，基本仅限于针对呼吸道样本的保存，对于其他样本类型的保存效果无法达到存储要求与处理要求（如组织样本需将胶原蛋白溶解，粪便样本需抑制细菌微生物活性以及萜类杂质进行溶解，全血样本需将红细胞彻底溶解），对存放温度与时间均有一定要求，多数要求4℃及以下低温保存，室温保存不可超过24小时，无法满足对绝大多数检测样本的处理及保存（血液/体液/粪便/组织样本）。有专利cn202010776891.5公开了一种有效保存病毒样品的病毒保存液，其保存液中所含有的β-巯基乙醇具有毒性以及挥发性，易对对实验人员健康造成影响；还有专利cn202010800497.0开发了一种病毒样本保存液及其制备方法与应用，该发明仅验证了血浆样本的保存效果，并没有验证其他所属样本，且血浆中对核酸保存影响因素少，因此更易于对核酸的保护，如粪便、唾液与肝脏组织样本中，含较多酶与其他复杂生物或化学成分，更容易对病毒保存液本身体系或所保存样本造成不同程度的影响；还有专利cn202210278109.6开发了一种灭活病毒样本保存液及其制备方法，该发明无实际保存效果实例，无法确认其对样本病毒保存能力；以及专利cn202011588126.7开发了一种拭子样本保存液，该发明仅针对拭子样本保存新型冠状病毒而做出研究，作用单一。
5.核酸检测由于灵敏度高、实验操作简单便捷、时间流程简短以及价格成本低，在检测领域中占重要地位。核酸检测需要依靠上游核酸提取纯化以及样本的采样与保存，当样本保存不当造成的核酸降解，会使检测灵敏度大幅下降，因此需要一种对样本核酸形成有效保护的病毒样本保存液。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种适用于多类型样本的病毒保存液及其应用。
7.本发明的技术内容如下：本发明提供了一种适用于多类型样本的病毒保存液，所述病毒保存液的组分包括
离液盐、非离子表面活性剂、离子螯合剂、有机溶剂、缓冲盐以及消泡剂，所述保存液的ph为2~6。
8.优选地，所述离液盐包括异硫氰酸胍、盐酸胍、高氯酸钠、高碘酸钠、碘化钠的一种以上，使用浓度为2~5mol/l。
[0009] 优选地，所述非离子表面活性剂包括peg 200、peg 600、np-40（壬基酚聚氧乙烯醚）、triton x-100（曲拉通x-100）、triton x-114（曲拉通x-114）、triton x-305（曲拉通x-305）、tween-20（吐温-20）、tween
ꢀ‑
80（吐温-80）、brij-35（异十三醇聚乙二醇醚）、brij-58（十六烷基聚氧乙烯醚）、aeo-7（脂肪醇聚氧乙烯醚(n=7)）、aeo-9（脂肪醇聚氧乙烯醚(n=9)）的一种以上，使用量为5~20%（v/v%）。
[0010]
非离子表面活性剂与有机溶剂dmso或dmf可溶解包膜病毒的脂类外壳，离液盐可溶解病毒的蛋白外壳，非离子表面活性剂与离液盐配合使用可有效灭活病毒，而离液盐、有机溶剂与离子螯合物可有效抑制dnase与rnase活性，从而保护液体中dna与rna不被降解。
[0011] 优选地，所述离子螯合剂包括edta（乙二胺四乙酸）、edta
·
na2（乙二胺四乙酸二钠）、egta（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）、8-hq（8-羟基喹啉）的一种以上，使用浓度为5~50 mmol/l。
[0012]
离子螯合剂对溶液中金属离子进行螯合作用，去除dna酶活性中心的金属离子，可同时抑制dna酶活性，保护dna核酸免受降解。
[0013]
优选地，所述有机溶剂包括dmso（二甲基亚砜）、dmf（n、n’二甲基甲酰胺）、甲酰胺、六甲基磷酰胺、四甲基乙二胺的一种以上，使用量为0.01~1%（v/v%）。
[0014]
采用的dmso与dmf有机试剂可对细菌与病毒活性抑制或灭活，增加细胞膜通透性，使试剂有效成分更易于进入病原体或细胞内发挥作用，且同时增加对化合物在液体中溶解度，是提高化合物在液体中溶解度增高的重要因素。
[0015] 优选地，所述缓冲盐包括tris（三羟基甲基氨基甲烷）、柠檬酸钠、醋酸钠、醋酸钾、mes（2-吗啉乙磺酸）、mops（2-吗啉丙磺酸）的一种以上，使用浓度为5~50 mmol/l；缓冲盐可保持一个利于核酸保存的ph环境。
[0016]
优选地，所述消泡剂为有机硅消泡剂，使用量为0.01~1%（v/v%）。
[0017]
本发明还提供了一种适用于多类型样本的病毒保存液的应用，所述病毒保存液适用于全血、唾液、粪便以及肝脏组织的病毒dna或rna的保存，且满足高温长时的稳定存放。
[0018]
本发明的有益效果如下：本发明的适用于多类型样本的病毒保存液，采用高比例的离子螯合剂，对溶液中金属离子进行螯合作用，去除dna酶活性中心的金属离子，可同时抑制dna酶活性，保护dna核酸免受降解；所采用的有机试剂dmso、dmf可对细菌与病毒活性抑制或灭活，增加细胞膜通透性，使试剂有效成分更易于进入病原体或细胞内发挥作用，且可同时增加对化合物在液体中溶解度，是提高化合物在液体中溶解度增高的重要因素；以及高浓度离液盐的搭配使用会比单一使用效果更优，增强其对蛋白变性作用，以及对rna酶活性造成强烈，保护rna核酸免受降解；非离子表面活性剂高浓度使用，可增加细胞膜通透性，或对样本内脂类物质充分溶解，使试剂内其他有效成分发挥出更大作用；以及消泡剂的加入可使样本混匀时不产生气泡，使样本混匀时更为充分；其中，离液盐与离子螯合剂用量大幅增加需依靠有机溶剂的加入，否则可能出现固体物质无法完全溶解的现象；
本发明的适用于多类型样本的病毒保存液，可对保存样本进行有效处理，且样本保存类型可实现全覆盖，无论是病毒dna或rna，在全血、体液、粪便或组织样本中均可实现长时间高温保存无降解，可在40℃高温环境下对样本保持长达15天的有效保存无降解，且病毒保存液中不含阴离子表面活性剂（在低温保存中易于析出，在北方或冬天低温时析出使用可能会影响其效果）与β巯基乙醇（有毒且易于挥发，对病毒保存液长时间存放与实验人员健康均会造成影响），且病毒保存液本身化学性质稳定（无易挥发或易析出化合物使用），配制后可实现长时间保存；所述病毒保存液使用易得化学物，价格低廉，化学性质稳定，配制方法简单，且配制用水无需使用depc去酶水，即可实现对rna核酸保护。
附图说明
[0019]
图1为全血样本asfv于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图2为全血样本hbv于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图3为全血样本covid-19于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图4为唾液样本asfv于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图5为唾液样本hbv于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图6为唾液样本covid-19于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图7为粪便样本asfv于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图8为粪便样本hbv于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图9为粪便样本covid-19于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图10为肝组织样本asfv于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图11为肝组织样本hbv于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图；图12为肝组织样本covid-19于不同保存液中保存0天、1天、5天、15天的pcr结果图。
实施方式
[0020] 下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021] 实施例1.表1 实施例1的病毒保存液
[0022]
实施例2.表2 实施例2的病毒保存液
[0023]
对比例1.对比例1的病毒保存液为1xpbs缓冲液。
[0024]
对比例2.对比例2的病毒保存液为博日科技（bsc82）的样本病毒保存液（为专利cn202210278109.6一种灭活病毒保存液及其配制方法制得）。
[0025] 将实施例1~2的病毒保存液以及对比例1的缓冲液、对比例2的病毒保存液用于病毒保存试验，实验过程以及结果如下：1.用于人血液病毒样本的保存选取非洲猪瘟病毒、乙肝病毒与新型冠状病毒随机量加入到人外周全血中，充分混匀后加入样本体积2倍量的上述病毒保存液中，在40℃下分别保存0天、1天、5天和15天后，使用广州奕昕生物科技有限公司的yxn-nzw-48a核酸提取试剂盒进行核酸提取纯化，并分别用自配制asfv核酸检测试剂盒（pcr荧光法）、自配制hbv核酸检测试剂盒（pcr荧光法）与自配制联合医学新冠核酸检测试剂盒（pcr荧光法）进行检测。
[0026] 表3 非洲猪瘟病毒人外周全血样本检测
[0027]
表4 乙肝病毒人外周全血样本检测
[0028]
表5 新型冠状病毒人外周全血样本检测
[0029]
由上表3~5结果以及结合图1~3可见，在全血样本中，对于dna样本保存较为简单，即使保存于对比例1中亦可稳定保存15天无明显降解。但在rna样本中，在对比例1中存在较为明显降解，对比例2、实施例1于实施例2中均可对全血样本核酸进行有效保存。其中对比例1中存在大量红细胞碎片沉淀，对比例2、实施例1与实施例2无红细胞碎片沉淀。
[0030] 2.用于人唾液原液病毒样本的保存选取非洲猪瘟病毒、乙肝病毒与新型冠状病毒随机量加入到人唾液原液中，充分混匀后加入样本体积2倍量的上述病毒保存液中，在40℃下分别保存0天、1天、5天和15天后，使用广州奕昕生物科技有限公司的yxn-nzw-48a核酸提取试剂盒进行核酸提取纯化，并分别用自配制asfv核酸检测试剂盒（pcr荧光法）、自配制hbv核酸检测试剂盒（pcr荧光法）与自配制联合医学新冠核酸检测试剂盒（pcr荧光法）进行检测。
[0031] 表6 非洲猪瘟病毒人唾液原液样本检测
[0032]
表7 乙肝病毒人唾液原液样本检测
[0033]
表8 新型冠状病毒人唾液原液样本检测
[0034]
由上表6~8结果以及结合图4~6可见，在唾液样本中，对比例1在asfv和新冠样本保存中核酸存在明显降解，但hbv保存较好，说明不同病毒在相同样本类型中稳定性存在差异。对比例2在新冠病毒保存后经提取所得核酸量较实施例1与实施例2低，说明病毒样本保存液在对于样本处理结果影响提取得率或扩增检测灵敏度。其中对比例2、实施例1与实施例2均可对唾液样本进行有效保存。其中对比例1中存在大量蛋白沉淀，对比例2、实施例1与实施例2无蛋白沉淀。
[0035] 3.用于粪便病毒样本的保存选取非洲猪瘟病毒、乙肝病毒与新型冠状病毒随机量加入到含100mg狗粪的保存
液中，表9 非洲猪瘟病毒狗粪样本检测
[0036]
表10 乙肝病毒狗粪样本检测
[0037]
表11 新型冠状病毒狗粪样本检测
[0038]
由上表9~11结果以及结合图7~9可见，在狗粪样本中，在对比例1对dna样本（asfv/hbv）初始提取时无扩增结果而对比例2、实施例1与实施例2成分对样本处理，从而才能成功获得病毒核酸。而对比例2以及实施例1在保存中均存在核酸大幅降解，说明其对粪便样本核酸保护能力弱。而实施例2在则可对粪便样本中核酸进行有效处理和保存。其中对比例1对比例2中液体浑浊，实施例1与实施例2液体澄清。
[0039] 4.用于肝组织样本的保存选取非洲猪瘟病毒、乙肝病毒与新型冠状病毒随机量加入到含1g猪肝组织样本的保存液中，充分混匀后加入样本体积2倍量的上述病毒保存液中，在40℃下分别保存0天、1天、5天和15天后，使用广州奕昕生物科技有限公司的yxn-nzw-48a核酸提取试剂盒进行核酸提取纯化，并分别用自配制asfv核酸检测试剂盒（pcr荧光法）、自配制hbv核酸检测试剂盒（pcr荧光法）与自配制联合医学新冠核酸检测试剂盒（pcr荧光法）进行检测。
[0040] 表12 非洲猪瘟病毒猪肝组织样本检测
[0041]
表13 乙肝病毒猪肝组织样本检测
[0042]
表14 新型冠状病毒猪肝组织样本检测
[0043]
由上表12~14结果以及结合图10~12可见，在猪肝组织样本中，对比例1有明显核酸降解，对比例2、实施例1与实施例2可对猪肝组织样本中核酸进行有效处理和保存。其中对比例1中存在大量组织碎片沉淀，对比例2、实施例1与实施例2中液体澄清无沉淀。
[0044]
其它同实施例2（如实施例3、实施例4）的病毒保存液，采用如上所述的成分替换，对各类型的病毒具有与实施例2的相同效果，在此不一一赘述。
[0045]
综上可见，本发明的病毒保存液在各类型样本中，对多种病毒保存以及对多种样本处理能力均优于对比例1、对比例2。
[0046]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种适用于多类型样本的包膜病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液的组分包括离液盐、非离子表面活性剂、离子螯合剂、有机溶剂、缓冲盐以及消泡剂，病毒保存液的ph为2~6。2.根据权利要求1所述的一种适用于多类型样本的病毒保存液，其特征在于，所述离液盐包括异硫氰酸胍、盐酸胍、高氯酸钠、高碘酸钠、碘化钠中的一种或多种，使用浓度为2 mol/l。3.根据权利要求1所述的适用于多类型样本的病毒保存液，其特征在于，所述非离子表面活性剂包括peg 200、peg 600、np-40、triton x-100、triton x-114、triton x-305、tween-20、tween
ꢀ‑
80、brij-35、brij-58、aeo-7、aeo-9中的一种或多种，使用量为5~20%（v/v%）。4.根据权利要求1所述的适用于多类型样本的病毒保存液，其特征在于，所述离子螯合剂包括edta、edta
•
na2、egta、8-hq的一种以上，使用浓度为20 mmol/l。5.根据权利要求1所述的适用于多类型样本的病毒保存液，其特征在于，所述有机溶剂包括dmso、dmf、甲酰胺、六甲基磷酰胺、四甲基乙二胺中的一种或多种，更优选地为dmso或dmf，使用量为0.01~1%（v/v%）。6.根据权利要求1所述的适用于多类型样本的病毒保存液，其特征在于，所述缓冲盐包括tris、柠檬酸钠、醋酸钠、醋酸钾、mes、mops中的一种或多种，使用浓度为50 mmol/l。7.根据权利要求1所述的适用于多类型样本的病毒保存液，其特征在于，所述消泡剂为有机硅消泡剂，使用量为0.01~1%（v/v%）。8.一种权利要求1~7任一项所述的适用于多类型样本的病毒保存液的应用，所述病毒保存液适用于全血、唾液、粪便以及肝脏组织的病毒dna或rna的保存，且满足高温长时的稳定存放。

技术总结
本发明属于病毒保存液的技术领域，具体涉及一种适用于多类型样本的病毒保存液及其应用。所述病毒保存液的组分包括离液盐、非离子表面活性剂、离子螯合剂、有机溶剂、缓冲盐以及消泡剂，病毒保存液的pH为2~6。所述病毒保存液采用高比例的离子螯合剂，可同时抑制DNA酶活性，保护DNA核酸免受降解，所述病毒保存液对病毒DNA或RNA，在全血、体液、粪便或组织样本中均可实现长时间高温保存无降解，可在40℃高温环境下对样本保持长达15天的有效保存无降解。境下对样本保持长达15天的有效保存无降解。境下对样本保持长达15天的有效保存无降解。


技术研发人员：黄庚锐 谭杰峰 欧少玲 许锦涛
受保护的技术使用者：广州奕昕生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/9/20