通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法

1.本发明涉及精子体外受精技术领域，具体为通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法。


背景技术：

2.顶体反应是指精子获能后，与卵相遇时，顶体开始产生的一系列改变。反应过程较长，包括顶体受体的激活、顶体膜与精细胞质膜融合、顶体中水解酶的释放、卵细胞外被(透明带)的水解等，最终导致精细胞质膜与卵细胞质膜的融合。顶体中含有顶体酶系统，它是一个复合酶系，包括透明质酸酶、放射冠分散酶、顶体素、芳基硫酸脂酶等。透明质酸酶的主要作用是溶解卵丘细胞间透明质酸，使卵丘细胞分散，精子得以通过这些细胞间隙。放射冠分散酶能使放射冠的细胞松解。顶体素，又称精子头粒蛋白，具有溶解卵透明带的作用。顶体素以酶原形式存在于顶体内，称前顶体素。当发生顶体反应时，顶体素原被激活成有活性的顶体素并释放，并与其他物质一起，参与了精子穿过透明带的机制，以完成精卵结合，达到受精的目的。芳基硫酸脂酶有溶解卵黄膜的作用。顶体反应是受精的先决条件，包括顶体外膜与精子质膜在许多位点的融合，并形成许多小囊泡状结构，最后顶体外膜破裂，顶体内各种酶的释放和顶体内膜的暴露。自附睾排出的精子进入雌性生殖道后，经过获能和完成顶体反应才能和卵结合。一般认为，卵丘细胞和透明带是诱发产生顶体反应的主要因素。体外培养条件下，ca2+、k+及高蛋白培养液能诱发及促进顶体反应。
3.精子获能和顶体反应是精子具有受精能力的前提。精子顶体反应分为完全顶体反应和不完全顶体反应，两者的检测标志不同。cd46能够检测由a23187引发的精子完全顶体反应，但是却无法检测出h-pz3和孕酮等诱发的不完全顶体反应。而在生理状态下，精子获能后的顶体反应多为不完全型。在受精过程中，卵母细胞透明带汇中h-zp3蛋白能够诱发精子顶体反应的发生，进而完成受精过程。一般检测精子顶体反应方法多为荧光染色后，通过荧光显微镜观察精子荧光变化来确定精子是否发生顶体反应。荧光染色判断较为主断。
4.因此，我们提出了通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，旨在解决cd46能够检测由a23187引发的精子完全顶体反应，但是无法检测出h-pz3和孕酮等诱发的不完全顶体反应的问题。
6.本发明是这样实现的，通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，包括以下步骤：s1、对过程中所需用到的相关试剂进行配制；s2、对zp3蛋白进行提取；s3、进行精子顶体反应的诱导，并进行上机检测分析，对分析的结果进行记录；s4、对记录的数据结果进行分析。
7.进一步地，所述s1包括以下步骤：s11、对oocytestoragebuffer进行配制；s12、对
neutralizationbuffer进行配制；s121、称量1mtris+hcl，将其ph值调到ph9.0；s13、对5mlnah2po4进行配制；s131、称量5mlnah2po4，将其ph值调到ph2.5；s14、对1xebss进行配制；s141、分别称量50ml的10xearle’s浓储液、1.1g的nahco3以及450ml的ddh2o，对上述成分进行混合调制即可；
8.s15、对0.3％bsa的ebss平衡液进行配制；s151、分别称量50ml的1xearle’s浓储液以及0.15g的bsa，然后进行混合调制即可；s16、对3％bsa的ebss平衡液进行配制；s161、分别称量50ml的1xearle’s浓储液以及1.5g的bsa，然后进行混合调制即可；s17、对facsbuffer进行配制；s171、分别称量2ml的edta、1g的bsa、5ml的nan3以及500ml的pbs，对上述成分进行混合调制即可。
9.进一步地，所述s11包括以下步骤：s111、分别称量1pack的pbs、304.95g的mgcl2·
6h2o、9.532g的hepes、1.1629g的pvp360以及1l的ddh2o；s112、对步骤s111中称量的成分进行混合，混合后，其ph值调至ph7.2，37℃状态下溶解，并对未溶解的颗粒进行过滤，即配制完成。
10.进一步地，所述s2包括以下步骤：s21、称量200μl的nah2po4，并向其中加入100个废弃卵母细胞，溶解5分钟；s22、2000rpm，进行离心操作，操作结束后，取上清液，丢弃沉淀；s23、加入1/10体积的neutralizationbuffer进行中和；s24、将中和后的液体在-20℃状态下保存备用。
11.进一步地，所述s3包括以下步骤：s31、精子上游，新鲜的精子上游，获取活力较好的精子，用于参与后续的操作；s32、诱导精子获能及顶体反应，通过3％bsa和h-zp3蛋白诱导精子获能和顶体反应；s33、对精子进行抗体染色，流式细胞术检测精子顶体反应。
12.进一步地，所述s31包括以下步骤：s311、取新鲜的精液吹打混匀后，将0.5ml一管分成多管；s312、小心加入1ml0.3％bsa的ebss平衡液，37℃下，5％co2中上游1h；s313、转圈吸取上层约500μl上清液，同一样本上清液混匀后计数。
13.进一步地，所述s32包括以下步骤：s321、用ebss平衡液将精子浓度稀释到10^6/ml后，分成4份，每份200μl，转移至96孔板中；s322、500
×
g，离心5分钟，弃上清液；s323、对照管加入100μl的含0.3％bsa的ebss平衡液重悬，其他三组分别用100μl3％bsa的ebss平衡液，37℃下，5％co2获能3h；s324、顶体反应诱导管加入h-zp3蛋白诱导顶体反应30分钟，其终浓度在1ng/μl。
14.进一步地，所述s33包括以下步骤：s331、顶体反应结束后，加1mlfacs buffer，37℃预热，500
×
g离心5分钟，弃上清液；s332、重悬并转移至96孔板中，加200μlfacsbuffer，500
×
g离心5分钟；s333、进行za抗体配制；s334、进行psa配制；s335、每孔加入100μl的fixation/permeabilization工作液重悬，4℃避光孵育60分钟；s336、孵育结束后，加入150μlpermeabilization洗液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，去上清液；s337、1
×
permeabilizationbuffer配制cb1抗体，1:200，每孔100μl，4℃避光孵育60分钟；s338、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，重复洗三次；s339、加入200μlfacsbuffer重悬，室温500
×
g，离心5分钟，然后通过70μm滤器过滤后转移至流式管，再加入100μlfacsbuffer混匀后等待上机进行流式分析，并对结果进行记录。
15.进一步地，所述s333包括以下步骤：s3331、1:500，每个孔100μl体系，4℃避光孵育15分钟；s3332、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，重复洗
三次。
16.进一步地，所述s334包括以下步骤：s3341、1:200，每个孔100μl体系，37℃避光孵育10分钟；s3342、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，重复洗三次。
17.与现有技术相比，本发明提供的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，具有以下有益效果：
18.精子在3％bsa-ebss37℃孵育3小时后，精子发生获能，再添加h-zp3诱导精子发生顶体反应，cb1作为精子膜表面的一种蛋白，cb1会因为顶体反应的发生而出现丢失，表达开始下降，实验结果显示在添加h-zp3诱导后，获能精子中cb1的表达出现显著降低，因此h-zp3能够诱导精子发生顶体反应；且在顶体反应发生后，cd46只能检测到有a23187诱导的精子顶体反应，而h-zp3蛋白诱导的顶体反应中，cd46的表达没有出现显著变化，如附图结果所示，可以得出cd46无法检测不完全顶体反应的结果，而psa作为精子顶体反应的另外一种检测方法，结果显示在h-zp3诱导的顶体反应中，psa的表达显著高于未诱导组，表明psa可以用过流式细胞术的方法对精子不完全顶体反应进行检测，得出psa可以检测h-zp3诱导的不完全顶体反应的结果，因此本专利通过流式细胞术的方法，通过psa检测由h-zp3诱导的不完全型精子顶体反应，更为准确地判断精子顶体反应率，可以为临床诊断提供一定的帮助。
附图说明
19.图1为本发明通过流式细胞术检测精子体外受精能力方法的流程图。
20.图2为本发明相关试剂配制方法的流程图。
21.图3为本发明oocytestoragebuffer配制方法的流程图。
22.图4为本发明zp3蛋白提取方法的流程图。
23.图5为本发明精子诱导以及上机检测方法的流程图。
24.图6为本发明精子上游方法的流程图。
25.图7为本发明诱导精子获能及顶体反应方法的流程图。
26.图8为本发明精子抗体染色以及检测精子顶体反应方法的流程图。
27.图9为本发明za抗体配制方法的流程图。
28.图10为本发明psa配制方法的流程图。
29.图11为本发明流式细胞术检测精子顶体反应散点图。
30.图12为本发明0.3％bsa与3％bsa下cd46检测zp3诱导的精子不完全顶体反应的结果图。
31.图13为本发明3％bsa+a23187与3％bsa+h-zp3下cd46检测zp3诱导的精子不完全顶体反应的结果图。
32.图14为本发明0.3％bsa下psa检测zp3诱导的精子不完全顶体反应的结果图。
33.图15为本发明3％bsa下psa检测zp3诱导的精子不完全顶体反应的结果图。
34.图16为本发明3％bsa+zp3下psa检测zp3诱导的精子不完全顶体反应的结果图。
35.图17为本发明facsbuffer的配方图。
具体实施方式
36.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
37.以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
38.本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
39.参照图1-17所示，为本发明提供的较佳实施例。
40.通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，包括以下步骤：s1、对过程中所需用到的相关试剂进行配制；s2、对zp3蛋白进行提取；s3、进行精子顶体反应的诱导，并进行上机检测分析，对分析的结果进行记录；s4、对记录的数据结果进行分析。
41.具体地，s1包括以下步骤：s11、对oocytestoragebuffer进行配制；s11包括以下步骤：s111、分别称量1pack的pbs、304.95g的mgcl2·
6h2o、9.532g的hepes、1.1629g的pvp360以及1l的ddh2o；s112、对步骤s111中称量的成分进行混合，混合后，其ph值调至ph7.2，37℃状态下溶解，并对未溶解的颗粒进行过滤，即配制完成；s12、对neutralizationbuffer进行配制；s121、称量1mtris+hcl，将其ph值调到ph9.0；s13、对5mlnah2po4进行配制；s131、称量5mlnah2po4，将其ph值调到ph2.5；s14、对1xebss进行配制；s141、分别称量50ml的10xearle’s浓储液、1.1g的nahco3以及450ml的ddh2o，对上述成分进行混合调制即可；s15、对0.3％bsa的ebss平衡液进行配制；s151、分别称量50ml的1xearle’s浓储液以及0.15g的bsa，然后进行混合调制即可；
42.s16、对3％bsa的ebss平衡液进行配制；s161、分别称量50ml的1xearle’s浓储液以及1.5g的bsa，然后进行混合调制即可；s17、对facsbuffer进行配制；s171、分别称量2ml的edta、1g的bsa、5ml的nan3以及500ml的pbs，对上述成分进行混合调制即可。
43.本实施方案中，oocytestoragebuffer为卵母细胞储存缓冲液，pbs为缓冲液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，hepes是一种非离子两性缓冲液，pvp360即为聚乙烯吡咯烷酮，又可写作pnvp，为一种水溶性高分子聚合物，ddh2o为双蒸水，neutralizationbuffer为中和缓冲液，tris+hcl为缓冲液(ph值7.5)，是一种经过ph值调整的预混合、无菌过滤溶液，ebss是与较弱的磷酸盐缓冲液相关的盐溶液，bsa为牛血清白蛋白，步骤s15以及s16均在超净台中操作，防止污染，可先配制1xearle’s溶液，然后再加入bsa进行溶解，facs缓冲液是一种缓冲盐溶液，可用于免疫荧光染色方案、抗体稀释和细胞稀释步骤、表面染色和洗涤步骤。
44.具体地，s2包括以下步骤：s21、称量200μl的nah2po4，并向其中加入100个废弃卵母细胞，溶解5分钟；s22、2000rpm，进行离心操作，操作结束后，取上清液，丢弃沉淀；s23、加入1/10体积的neutralizationbuffer进行中和；s24、将中和后的液体在-20℃状态下保存备用。
45.本实施方案中，nah2po4即为磷酸二氢钠，是一种磷酸的酸式盐，其是制造六偏磷酸钠和焦磷酸钠的原料，主要用于制革、处理锅炉水，作为品质改良剂和制焙粉，及在食品工业、发酵工业中作缓冲剂和发酵粉原料，还用作饲料添加剂、洗涤剂及染助剂等，2000rpm为离心机的转速，每分钟2000转，该步骤，用于对zp3蛋白进行提取。
46.具体地，s3包括以下步骤：s31、精子上游，新鲜的精子上游，获取活力较好的精子，用于参与后续的操作；s32、诱导精子获能及顶体反应，通过3％bsa和h-zp3蛋白诱导精子获能和顶体反应；s33、对精子进行抗体染色，流式细胞术检测精子顶体反应。
47.本实施方案中，顶体反应是指精子获能后，精子释放顶体酶，溶蚀放射冠和透明带的过程，顶体是覆盖于精子头部细胞核前方、介于核与质膜间的囊状细胞器，其本质是来源于高尔基体的特化的溶酶体，外包单层膜，呈扁平囊状，内含糖蛋白和多种水解酶，是顶体反应相关酶的储存场所，在体外条件下，血清白蛋白(bsa)、高密脂蛋白、氨基聚糖、孕酮、钙离子载体、精卵结合蛋白(zp)、co2等均可促进精子获能。
48.具体地，s31包括以下步骤：s311、取新鲜的精液吹打混匀后，将0.5ml一管分成多管；s312、小心加入1ml0.3％bsa的ebss平衡液，37℃下，5％co2中上游1h；s313、转圈吸取上层约500μl上清液，同一样本上清液混匀后计数。
49.本实施方案中，步骤s312中，为沿着管壁小心加入，使ebss和精液分成两层，避免混合，在0.3％bsa的ebss平衡液以及5％co2环境下，通过上游法使得活动能力好的精子上游至上层培养液中，该方法可除去精浆及精浆内抑制受精的物质，达到体外获能，具有操作简便、成本低廉、不良反应少，并可获得更高的颗粒大小和更低dna碎片率的精子，对上层清液进行吸取，即可获得活力较好的精子，吸取混匀后，对精子数量进行计数。
50.具体地，s32包括以下步骤：s321、用ebss平衡液将精子浓度稀释到10^6/ml后，分成4份，每份200μl，转移至96孔板中；s322、500
×
g，离心5分钟，弃上清液；s323、对照管加入100μl的含0.3％bsa的ebss平衡液重悬，其他三组分别用100μl3％bsa的ebss平衡液，37℃下，5％co2获能3h；s324、顶体反应诱导管加入h-zp3蛋白诱导顶体反应30分钟，其终浓度在1ng/μl。
51.本实施方案中，通过在不同浓度bsa的ebss平衡液环境下，使得多组精子进行获能，从而对多组反应结果进行记录比对，得出cd46无法检测zp3诱导的精子不完全顶体反应的结论。
52.具体地，s33包括以下步骤：s331、顶体反应结束后，加1mlfacsbuffer，37℃预热，500
×
g离心5分钟，弃上清液；s332、重悬并转移至96孔板中，加200μlfacsbuffer，500
×
g离心5分钟；s333、进行za抗体配制；s333包括以下步骤：s3331、1:500，每个孔100μl体系，4℃避光孵育15分钟；s3332、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，重复洗三次；s334、进行psa配制；s334包括以下步骤：s3341、1:200，每个孔100μl体系，37℃避光孵育10分钟；s3342、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，重复洗三次；s335、每孔加入100μl的fixation/permeabilization工作液重悬，4℃避光孵育60分钟；s336、孵育结束后，加入150μlpermeabilization洗液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，去上清液；s337、1
×
permeabilizationbuffer配制cb1抗体，1:200，每孔100μl，4℃避光孵育60分钟；s338、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，重复洗三次；s339、加入200μlfacsbuffer重悬，室温500
×
g，离心5分钟，然后通过70μ
m滤器过滤后转移至流式管，再加入100μlfacsbuffer混匀后等待上机进行流式分析，并对结果进行记录。
53.本实施方案中，za抗体可用于做荧光实验，psa就是前列腺特异性抗原，前列腺特异性抗原是由前列腺导管上皮产生的一种色氨酸蛋白酶，通常psa主要分泌到前列腺液和精液中，以具有活性的游离形式存在，psa具有器官特异性，仅由前列腺上皮细胞合成，fixation/permeabilization工作液即为固定/破膜工作液，在做流式细胞术之前通常需要对细胞进行固定和破膜，cb1抗体即为大麻素受体1抗体，将配制后的液体混匀后，上机进行流式分析，可以得出psa可检测zp3诱导的精子不完全顶体反应的结果。
54.上述本技术实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
55.精子在3％bsa-ebss37℃孵育3小时后，精子发生获能，再添加h-zp3诱导精子发生顶体反应，cb1作为精子膜表面的一种蛋白，cb1会因为顶体反应的发生而出现丢失，表达开始下降，实验结果显示在添加h-zp3诱导后，获能精子中cb1的表达出现显著降低，因此h-zp3能够诱导精子发生顶体反应；且在顶体反应发生后，cd46只能检测到有a23187诱导的精子顶体反应，而h-zp3蛋白诱导的顶体反应中，cd46的表达没有出现显著变化，如附图结果所示，可以得出cd46无法检测不完全顶体反应的结果，而psa作为精子顶体反应的另外一种检测方法，结果显示在h-zp3诱导的顶体反应中，psa的表达显著高于未诱导组，表明psa可以用过流式细胞术的方法对精子不完全顶体反应进行检测，得出psa可以检测h-zp3诱导的不完全顶体反应的结果，因此本专利通过流式细胞术的方法，通过psa检测由h-zp3诱导的不完全型精子顶体反应，更为准确地判断精子顶体反应率，可以为临床诊断提供一定的帮助。
56.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，包括以下步骤：s1、对过程中所需用到的相关试剂进行配制；s2、对zp3蛋白进行提取；s3、进行精子顶体反应的诱导，并进行上机检测分析，对分析的结果进行记录；s4、对记录的数据结果进行分析。2.根据权利要求1所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s1包括以下步骤：s11、对oocytestoragebuffer进行配制；s12、对neutralizationbuffer进行配制；s121、称量1mtris+hcl，将其ph值调到ph9.0；s13、对5mlnah2po4进行配制；s131、称量5mlnah2po4，将其ph值调到ph2.5；s14、对1xebss进行配制；s141、分别称量50ml的10xearle’s浓储液、1.1g的nahco3以及450ml的ddh2o，对上述成分进行混合调制即可；s15、对0.3％bsa的ebss平衡液进行配制；s151、分别称量50ml的1xearle’s浓储液以及0.15g的bsa，然后进行混合调制即可；s16、对3％bsa的ebss平衡液进行配制；s161、分别称量50ml的1xearle’s浓储液以及1.5g的bsa，然后进行混合调制即可；s17、对facsbuffer进行配制；s171、分别称量2ml的edta、1g的bsa、5ml的nan3以及500ml的pbs，对上述成分进行混合调制即可。3.根据权利要求2所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s11包括以下步骤：s111、分别称量1pack的pbs、304.95g的mgcl2·
6h2o、9.532g的hepes、1.1629g的pvp360以及1l的ddh2o；s112、对步骤s111中称量的成分进行混合，混合后，其ph值调至ph7.2，37℃状态下溶解，并对未溶解的颗粒进行过滤，即配制完成。4.根据权利要求1所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s2包括以下步骤：s21、称量200μl的nah2po4，并向其中加入100个废弃卵母细胞，溶解5分钟；s22、2000rpm，进行离心操作，操作结束后，取上清液，丢弃沉淀；s23、加入1/10体积的neutralizationbuffer进行中和；s24、将中和后的液体在-20℃状态下保存备用。5.根据权利要求1所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s3包括以下步骤：s31、精子上游，新鲜的精子上游，获取活力较好的精子，用于参与后续的操作；s32、诱导精子获能及顶体反应，通过3％bsa和h-zp3蛋白诱导精子获能和顶体反应；s33、对精子进行抗体染色，流式细胞术检测精子顶体反应。
6.根据权利要求5所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s31包括以下步骤：s311、取新鲜的精液吹打混匀后，将0.5ml一管分成多管；s312、小心加入1ml0.3％bsa的ebss平衡液，37℃下，5％co2中上游1h；s313、转圈吸取上层约500μl上清液，同一样本上清液混匀后计数。7.根据权利要求5所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s32包括以下步骤：s321、用ebss平衡液将精子浓度稀释到10^6/ml后，分成4份，每份200μl，转移至96孔板中；s322、500
×
g，离心5分钟，弃上清液；s323、对照管加入100μl的含0.3％bsa的ebss平衡液重悬，其他三组分别用100μl3％bsa的ebss平衡液，37℃下，5％co2获能3h；s324、顶体反应诱导管加入h-zp3蛋白诱导顶体反应30分钟，其终浓度在1ng/μl。8.根据权利要求5所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s33包括以下步骤：s331、顶体反应结束后，加1mlfacsbuffer，37℃预热，500
×
g离心5分钟，弃上清液；s332、重悬并转移至96孔板中，加200μlfacsbuffer，500
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g离心5分钟；s333、进行za抗体配制；s334、进行psa配制；s335、每孔加入100μl的fixation/permeabilization工作液重悬，4℃避光孵育60分钟；s336、孵育结束后，加入150μlpermeabilization洗液，在室温下，500
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g，离心5分钟，去上清液；s337、1
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permeabilizationbuffer配制cb1抗体，1:200，每孔100μl，4℃避光孵育60分钟；s338、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
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g，离心5分钟，重复洗三次；s339、加入200μlfacsbuffer重悬，室温500
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g，离心5分钟，然后通过70μm滤器过滤后转移至流式管，再加入100μlfacsbuffer混匀后等待上机进行流式分析，并对结果进行记录。9.根据权利要求8所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s333包括以下步骤：s3331、1:500，每个孔100μl体系，4℃避光孵育15分钟；s3332、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
×
g，离心5分钟，重复洗三次。10.根据权利要求8所述的通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，其特征在于，所述s334包括以下步骤：s3341、1:200，每个孔100μl体系，37℃避光孵育10分钟；s3342、孵育结束后，加入2000μlfacs缓冲液，在室温下，500
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g，离心5分钟，重复洗三次。

技术总结
本发明公开了通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，涉及精子体外受精技术领域。该通过流式细胞术检测精子体外受精能力的方法，在添加H-ZP3诱导后，获能精子中CB1的表达出现显著降低，因此H-ZP3能够诱导精子发生顶体反应，但在顶体反应发生后，CD46只能检测到有A23187诱导的精子顶体反应，而H-ZP3蛋白诱导的不完全顶体反应中，CD46无法检测出不完全顶体反应，但是，PSA可以用过流式细胞术的方法对精子不完全顶体反应进行检测，因此，通过流式细胞术的方法，PSA可以检测由H-ZP3诱导的不完全型精子顶体反应，更为准确地判断精子顶体反应率，可以为临床诊断提供一定的帮助。可以为临床诊断提供一定的帮助。可以为临床诊断提供一定的帮助。


技术研发人员：段永刚 杨宸 曾群雄 刘金川
受保护的技术使用者：香港大学深圳医院
技术研发日：2023.07.25
技术公布日：2023/9/20