一种酸性D-氨基酸氧化酶的突变体，构建方法及其在酶法拆分草铵膦中的应用

一种酸性d-氨基酸氧化酶的突变体，构建方法及其在酶法拆分草铵膦中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种酸性d-氨基酸氧化酶的突变体，构建方法以及其在酶法拆分草铵膦中的应用。


背景技术：

2.草铵膦铵盐(简称ppt)化学名为2-氨基-4-(羟甲基膦基)丁酸，是1986年由德国赫斯特公司开发的一种光谱的非选择性氨基酸类除草剂，具有除草活性高、杀草迅速、作用杂草种类多、有效施用量小、在土壤中易降解、对周边环境影响小等优点。是目前用量仅次于草甘膦的世界第二大转基因作物耐受除草剂，且由于抗草甘膦杂草的蔓延以及百草枯、敌草快等除草剂的限用，草铵膦的市场需求量快速增加。由于其分子内有一个手性碳原子(c2)，草铵膦具有两种不同的构型，其中d-草铵膦不具有除草活性，且易造成土壤板结，不利于保护环境。商业化应用的草铵膦除草剂通常由d，l-草铵膦的外消旋混合物组成，其中含有50％的d-草铵膦，因此通过将d-草铵膦转化为l-草铵膦，能够减少草铵膦原药一半的用量，这对于降低成本，提高原子经济性以及减轻环境压力具有重要意义。
3.目前l-草铵膦的制备方法主要包括化学法和生物法。但化学法存在步骤繁琐、成本偏高、产品光学纯度偏低以及用到大量有机试剂或剧毒试剂，安全性较差且环境不友好等缺点。目前精草铵膦(l-草铵膦)生产厂家普遍都趋于采用生物催化转化法。生物催化法生产精草铵膦具有步骤简单、反应条件温和、立体选择性高、产品收率高等优点，是工业化制备l-草铵膦的重要趋势，且受到国家的大力支持。生物转化法主要包括酶法合成法和酶法拆分法两类：
4.(1)酶法合成法主要以l-草铵膦的衍生物(如n-苯乙酰-d,l-草铵膦或草铵膦腈胺)为底物，通过酶法直接水解获得l-草铵膦，主要优点是转化率高，产物e.e.值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。
5.(2)酶法拆分法利用外消旋的d,l-草铵膦为底物，通过两步酶法进行选择性拆分，将d型草铵膦通过d-氨基酸氧化酶(daao)转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称ppo)，并进一步还原为l-草铵膦，同时保留原有质量分数为40-60％的l-草铵膦。该法具有原料简单易得、工艺简单、成本较低以及绿色环保等优势，具有较高的工业化应用价值。但由于d-草铵膦属于非天然底物，野生型d-氨基酸氧化酶无法识别，导致催化效率低下，限制了其工业应用。


技术实现要素：

[0006]
本发明首要目的是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种酸性d-氨基酸氧化酶的突变体。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
[0008]
一种酸性d-氨基酸氧化酶突变体，其氨基酸序列是在seq id no:1所示氨基酸序
列基础上包含以下至少一个突变位点：h70s、i74a、g244q、q337g。
[0009]
进一步地，突变包括以下几种之一：h70s、i74a、g244q、q337g、h70s/i74a、h70s/g244q、h70s/q337g、i74a/g244q、h70s/i74a/g244q、h70s/i74a/q337g、h70s/g244q/q337g、h70s/i74a/g244q/q337g；
[0010]
优选：h70s/i74a/g244q、h70s/i74a/q337g、h70s/g244q/q337g、h70s/i74a/g244q/q337g、h70s/i74a、h70s/g244q、h70s/q337g；
[0011]
进一步优选：h70s/i74a/g244q、h70s/i74a/q337g、h70s/i74a/g244q/q337g、h70s/i74a；
[0012]
最优选：h70s/i74a/g244q/q337g。
[0013]
上述斜线代表“和”[0014]
本发明的第二个目的是提供一种所述的酸性d-氨基酸氧化酶突变体的编码基因。
[0015]
本发明的第三个目的是提供一种含有所述酸性d-氨基酸氧化酶突变体编码基因的表达载体。
[0016]
本发明的第四个目的是提供一种含有所述表达载体的基因工程菌，所述基因工程菌由所述的表达载体通过常规转化或转染技术引入宿主细胞后获得。
[0017]
所述宿主细胞可以是原核或真核细胞；属于酵母属(saccharomyces)、曲霉属(aspergillus)、毕赤酵母属(pichia)、耶氏酵母属(yarrowia)、放线菌属(actinomycetes)、链霉菌属(streptomyces)、芽孢杆菌属(bacillus)或埃希氏杆菌属(escherichia)；优选地选自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia pastoris)、链霉菌(streptomyces)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或大肠杆菌(escherichia coli)中的至少一种。
[0018]
本发明的第五个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0019]
(1)确定酸性d-氨基酸氧化酶突变位点，设计定点突变引物，以seq id no:2所示的野生型酸性d-氨基酸氧化酶核苷酸序列为模板，进行全质粒pcr反应，获得具有所述氨基酸突变的基因片段；
[0020]
(2)将pcr得到的基因片段产物进行酶切处理以去除模板dna，结束后将产物转化至感受态细胞，筛选获得具有该酸性d-氨基酸氧化酶突变体编码基因的感受态细胞，培养并提取重组表达载体；
[0021]
(3)将该重组表达载体转化进入到表达宿主细胞中，筛选获得酸性d-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。
[0022]
步骤(2)详细过程：将pcr反应得到的产物片段进行dpni酶切处理，消化dna模板，酶切结束后将产物通过化学转化或电转化导入至感受态细胞，筛选后进行摇瓶培养并提取重组表达载体；所述表达载体可以是可方便地进行重组dna程序并且可引起酸性d-氨基酸氧化酶突变体的多核苷酸表达的任何载体(例如质粒或病毒)。
[0023]
优选的，步骤(2)所述的表达载体可以采用pet28、pet29、pet30系列载体中的其中一种。
[0024]
本发明所述重组宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞属于酵母属(saccharomyces)、曲霉属(aspergillus)、毕赤酵母属(pichia)、耶氏酵母属(yarrowia)、放线菌属(actinomycetes)、链霉菌属(streptomyces)、芽孢杆菌属
(bacillus)或埃希氏杆菌属(escherichia)；优选地选自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia pastoris)、链霉菌(streptomyces)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或大肠杆菌(escherichia coli)中的至少一种。
[0025]
优选的，步骤(1)所述pcr扩增采用以下定点突变引物：
[0026]
1)h70s-f的引物序列：5
’‑
gcaggtgcaagctatcgcccagcaccgggcgcaaccccg-3’；
[0027]
2)h70s-r的引物序列：5
’‑
gggcgatagcttgcacctgcccaccaagatgcataatc-3’；
[0028]
3)i74a-f的引物序列：5
’‑
ctatcgcccagcaccgggcgcaaccccgcagctgcagcg-3’；
[0029]
4)i74a-r的引物序列：5
’‑
gcgcccggtgctgggcgatagcttgcacctgcccacc-3’；
[0030]
5)g244q-f的引物序列：5
’‑
aatcgtgatcagtcatggattttcctgattccgcgtc-3’；
[0031]
6)g244q-r的引物序列：5
’‑
gaaaatccatgactgatcacgattctgacgggtaatgg-3’；
[0032]
7)r337g-f的引物序列：5
’‑
gcaggtggtggtggttatgaactgagctgggg-3’；
[0033]
8)r337g-r的引物序列：5
’‑
gttcataaccaccaccacctgcaccgtatgcatgaatg-3’。
[0034]
可以通过常规转化或转染技术将本技术的表达载体引入原核或真核细胞中。在本文中使用时，术语“转化”和“转染”是指在用于将外来核酸(例如dna)引入本领域技术人员公知的宿主细胞中的多种本领域公认的技术。
[0035]
本发明的第六个目的是提供一种所述酸性d-氨基酸氧化酶突变体在酶法拆分外消旋d,l-草铵膦中的应用。
[0036]
所述酶催化体系中以游离酶和/或引入酶的表达载体的宿主细胞的形式加入；
[0037]
优选所述引入酶的表达载体的宿主细胞的添加量与酶催化体系的总反应液的比例为1-200g/l。
[0038]
所述酶催化转化反应在ph为7-10的反应液体系中进行，优选地，所述反应体系的ph为8-9。反应温度为25-45℃，时间为6-24h。
[0039]
本发明所述酸性d-氨基酸氧化酶突变体生产l-草铵膦是将d-草铵膦转化为生产l-草铵膦的关键中间体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，同时保留原有外消旋d,l-草铵膦中质量分数占比为40-60％的l-草铵膦。
[0040]
在一些实施方式中，所述d-草胺膦最初存在于d-和l-草胺膦或其盐的外消旋混合物中。外消旋的草胺膦起始原料可以以多种形式提供。可使用外消旋草胺膦的各种盐，诸如铵盐和盐酸盐，或两性离子。
[0041]
优选的，具体包括以下步骤：
[0042]
在多酶催化体系下通过使用酸性d-氨基酸氧化酶使外消旋d，l-草铵膦中的d-草铵膦发生氧化转化反应生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，拆分后保留的l-草铵膦在底物d,l-草铵膦中的质量分数占比为40-60％；同时使用过氧化氢酶使副产物过氧化氢分解为水和氧气。
[0043]
在一些实施方式中，所述酶催化体系中还包括过氧化氢酶。所述过氧化氢酶用于去除副产物过氧化氢以防止过氧化氢的积累对酶催化剂造成的毒害作用。过氧化氢酶可以为本领域已知的任何具有过氧化氢酶活性的酶，例如购自上海源叶生物科技有限公司，商品编号为cas 9001-05-2的过氧化氢酶。
[0044]
优选的，所述多酶催化体系包括：用于将d-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的酸性d-氨基酸氧化酶突变体，用于将副产物过氧化氢转化为水和氧气的过
氧化氢酶。本技术所述的“酸性d-氨基酸氧化酶突变体”具有d-氨基酸氧化酶活性，即将d-氨基酸转化成酮酸(酮酸种类由d-氨基酸底物决定)、氨和过氧化氢的活性，特别地，本技术所述的酸性d-氨基酸氧化酶突变体具有将d-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称ppo)的活性。
[0045]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0046]
(1)本技术使用一种新的酸性d-氨基酸氧化酶并构建其突变体，获得具有对d-草铵膦更高催化活性的酸性d-氨基酸氧化酶突变体，且具有更高的催化效率，能够应用于生物酶法去消旋化拆分外消旋型d,l-草铵膦，绿色高效制备l-草铵膦。当使用外消旋型d,l-草铵膦为底物进行催化转化反应时，转化率远高于野生型，中间产物ppo的产率也大幅提升，同时保留了底物中原有的质量分数为40-60％的l-草铵膦，提高了底物利用率，大幅降低成本。
[0047]
本技术中所用的术语“催化效率”是指酸性d-氨基酸氧化酶允许其将d-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的性质。在一个实施方案中，与野生型或参照d-氨基酸氧化酶相比，本技术的酸性d-氨基酸氧化酶突变体的催化效率得以增强。
[0048]
(2)使用本技术所述酸性d-氨基酸氧化酶及其突变体催化氧化d，l-草铵膦，通过显色剂tbhba和4-aap显色，可将副产物h
202
转化为在500nm处有特征峰的蒽醌类物质，从而可以定量测定酸性d-氨基酸氧化酶及其突变体的酶活力。计算获得的酸性d-氨基酸氧化酶及其突变体的酶活力如表2所示。所得的酸性d-氨基酸氧化酶突变体(h70s/i74a/g244q/r337g)相比于野生型酶具有更高的催化活力(》400倍)，表明其对底物d-草铵膦优异的催化能力，且具有工业化大规模生产l-草铵膦的应用潜力。
[0049]
(3)使用本技术所述酸性d-氨基酸氧化酶及其突变体在多酶催化体系中去消旋化催化拆分d，l-草铵膦，通过测定产物ppo的生成量，从而计算的底物转化率如图1所示。所得的酸性d-氨基酸氧化酶突变体(h70s/i74a/g244q/r337g)可在6h内完全催化转化d-草铵膦生成中间产物ppo，底物转化率≥49.95％。使用该酸性d-氨基酸氧化酶突变体进行外消旋d,l-草铵膦的拆分和l-草铵膦的生产，具有反应步骤简单，反应条件温和，原料价格低廉，产物分离简便，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。
[0050]
本技术所述的方法用于在同一个反应容器中进行，同时产物的产率可以通过本领域已知的任何方法测量，如通过高效液相色谱(hplc)来测量所获得的产物中ppo的含量。
附图说明
[0051]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0052]
图1是实施例1、对比例1中测定ppo的生成量来比较酸性d-氨基酸氧化酶与其突变体的催化效率；
[0053]
图2是实施例1、对比例1中多酶催化体系去消旋拆分d，l-草铵膦的机理示意图。
具体实施方式
[0054]
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0055]
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0056]
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0057]
实施例1：
[0058]
(1)基因工程菌的构建。
[0059]
将来源于杜邦嗜热菌(thermomyces duponti)的酸性d-氨基酸氧化酶(daao，氨基酸序列如seq id no:1所示，核苷酸序列如seq id no:2所示)的基因序列送往北京擎科生物科技有限公司进行全基因合成后，克隆到表达质粒pet-30a(+)上，得到pet-30a-daao，并插入酶切位点为bamh i和xho i。测序验证无误后将pet-30a-daao转入克隆宿主大肠杆菌e.coli dh5α和表达宿主大肠杆菌e.coli bl21(de3)中用于后续突变体的构建以及重组酸性d-氨基酸氧化酶的表达。
[0060]
(2)工程菌体的培养
[0061]
lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，用去离子水溶解后定容，115℃灭菌30min待用。lb液体固体培养基组成(平板)：在lb液体培养基的基础上加入琼脂粉2％w/v，115℃灭菌30min，冷却至50-60℃，加入100mg/ml卡那霉素(kan)，使其终浓度达50μg/ml，倒入培养皿中，冷却凝固后封存于4℃冰箱待用。tb液体培养基组成：胰蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，甘油4g/l，kh2po
4 2.31g/l，k2hpo
4 12.54g/l，用去离子水溶解后定容，115℃灭菌30min待用。
[0062]
将上述重组基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet-30a-daao经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基中，37℃，230rpm震荡过夜培养。按2％的接种量转接至10ml tb液体培养基中，37℃，230rpm震荡培养至od
600
达到0.8左右时，加入终浓度为1％w/v的乳糖，25℃下震荡培养12h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。
[0063]
(3)酸性d-氨基酸氧化酶(daao)突变体的构建
[0064]
针对(1)中所述野生型酸性daao序列突变了第70位，第74位、第244位和第337位(具体为h70s、i74a、g244q和r337g)，与其他野生型daao氨基酸序列做比对，确定了70，74，244以及337这四个底物活性中心附近的非保守位点，对其进行定点突变，获得对ppo具有更高活力的daao突变体。以该核苷酸序列为模板设计定点突变引物，如下方表1所示：
[0065]
表1第70位，第74位、第244位和第337位核苷酸序列定点突变引物
[0066]
编号引物名引物序列引物序列表1h70s-fgcaggtgcaagctatcgcccagcaccgggcgcaaccccg如seq id no:3所示2h70s-rgggcgatagcttgcacctgcccaccaagatgcataatc如seq id no:4所示3i74a-fctatcgcccagcaccgggcgcaaccccgcagctgcagcg如seq id no:5所示4i74a-rgcgcccggtgctgggcgatagcttgcacctgcccacc如seq id no:6所示
5g244q-faatcgtgatcagtcatggattttcctgattccgcgtc如seq id no:7所示6g244q-rgaaaatccatgactgatcacgattctgacgggtaatgg如seq id no:8所示7r337g-fgcaggtggtggtggttatgaactgagctgggg如seq id no:9所示8r337g-rgttcataaccaccaccacctgcaccgtatgcatgaatg如seq id no:10所示
[0067]
pcr扩增体系(50μl)如下：
[0068]
10
×
kod-plus-neo缓冲液5μl，dntps 5μl，mgso
4 3μl，上下游引物各1μl，模板dna1μl，kod-plus-neo 1μl，加入ddh2o使终体系为50μl。
[0069]
pcr扩增条件(两步法)：
[0070]
①
94℃预变性2min，
②
98℃变性10秒，
③
68℃延伸4min，30个循环，
④
72℃延伸7min，
⑤
4℃保存。
[0071]
pcr结束后取1μl产物进行核酸凝胶电泳分析，得到的目标条带清晰，向剩余产物加入0.5μl dpn i核酸内切酶，于37℃下消化模板dna 2h，再于80℃下失活20min。
[0072]
酶切结束后将产物转化至e.coli dh5α感受态细胞，涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，于37℃过夜培养。挑单菌落于含有50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基，在37℃，230rpm条件下过夜培养，经测序鉴定后提取质粒，转化进入e.coli bl21(de3)感受态细胞，涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，于37℃过夜培养，挑取单菌落于含有50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基，在37℃，230rpm条件下过夜培养，获得突变体转化子。按照(2)中所述获得产酸性d-氨基酸氧化酶突变体的e.coli bl21(de3)菌体。。
[0073]
(4)针对(3)中所述daao突变体，通过迭代定点突变获得两点、三点和四点突变体(具体为h70s/i74a,h70s/g244q,h70s/q337g,i74a/g244q,i74a/q337g,g244q/q337g,h70s/i74a/g244q,h70s/i74a/q337g,h70s/g244q/q337g和h70s/i74a/g244q/q337g)。
[0074]
pcr扩增体系(50μl)如下：
[0075]
10
×
kod-plus-neo缓冲液5μl，dntps 5μl，mgso
4 3μl，上下游引物各1μl，模板dna1μl，kod-plus-neo 1μl，加入ddh2o使终体系为50μl。
[0076]
pcr扩增条件(两步法)：
[0077]
①
94℃预变性2min，
②
98℃变性10秒，
③
68℃延伸4min，30个循环，
[0078]
④
72℃延伸7min，
⑤
4℃保存。
[0079]
pcr结束后取1μl产物进行核酸凝胶电泳分析，得到的目标条带清晰，向剩余产物加入0.5μl dpn i核酸内切酶，于37℃下消化模板dna 2h，再于80℃下失活20min。
[0080]
酶切结束后将产物转化至e.coli dh5α感受态细胞，涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，于37℃过夜培养。挑单菌落于含有50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基，在37℃，230rpm条件下过夜培养，经测序鉴定后提取质粒，转化进入e.coli bl21(de3)，涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，于37℃过夜培养，挑取单菌落于含有50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基，在37℃，230rpm条件下过夜培养，获得突变体转化子。按照(2)中所述获得产酸性d-氨基酸氧化酶突变体的e.coli bl21(de3)菌体。
[0081]
(5)酸性d-氨基酸氧化酶粗酶液制备及纯化
[0082]
将培养结束后收集到的菌体细胞，用50mm tris-hcl(ph8.0)的缓冲液洗涤菌体两次后重悬，超声破碎菌悬液，12000rpm离心5min去除沉淀，取上清液，即为重组酸性d-氨基酸氧化酶的粗酶液。
[0083]
将粗酶液与经过binding/wash buffer(含有8m尿素，500mm nacl，5mm咪唑，20mm ph8.0的tris-hcl缓冲液)平衡过的ni亲和层析树脂结合后，再用wash buffer(含有8m尿素，500mm nacl，5mm咪唑，20mm ph8.0的tris-hcl缓冲液)冲洗至流传液在280nm处吸光度接近基线，随后以elution buffer(含有8m尿素，500mm nacl，500mm咪唑，20mm ph8.0的tris-hcl缓冲液)洗脱并收集目的蛋白，取截留液采用bca法测定蛋白含量为0.419mg/ml，并通过sds-page电泳分析鉴定其分子量为40.8kda。纯化酶液按1：1比例加入30％甘油，分装后冻存于-80℃，即获得重组酸性d-氨基酸氧化酶纯酶液。
[0084]
(6)酸性d-氨基酸氧化酶突变体催化活力测定
[0085]
如图2所示，通过使用显色剂2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸(tbhba)和4-氨基安替比林(4-aap)显色，可将副产物h
202
转化为蒽醌类物质并在500nm处表现其特征峰，从而可以通过分光光度法定量测定酸性d-氨基酸氧化酶及其突变体对底物d-草铵膦的酶活力。反应体系为：50mm ph8.0的tris-hcl缓冲液，200mm外消旋d,l-草铵膦铵盐，10mm 4-aap，5mm tbhba，60u/ml过氧化氢酶，将上述反应液混合均匀后于30℃保温。加入daao重组酸性d-氨基酸氧化酶纯酶液100μl后开始反应，测定500nm下吸光度的变化值，计算daao酶活力，具体如下方表2所示：
[0086]
表2野生型/突变型d-氨基酸氧化酶酶活力
[0087][0088][0089]
本技术中酶活力的定义为：每1分钟转化1μmol d-草铵膦所需的酶量。
[0090]
由表2可以看出所得酸性d-氨基酸氧化酶突变体均具有相比于野生型daao较高的催化效率，能够在低底物浓度(本例中为100mm d-ppt)下高效催化d-草铵膦的氧化反应并生成ppo。其中活力最高的daao突变体的突变位点为第70位的氨基酸残基h替换为s，第74位的氨基酸残基i替换为a，第244位的氨基酸残基g替换为q，第337位的氨基酸残基q替换为g。
该daao突变体显示出其对非天然底物d-ppt较高的催化活力，相比于野生型daao酶活力提高大于400倍，有望应用于大规模d，l-草铵膦的酶法拆分中。
[0091]
(7)如图2所示的方法，多酶催化体系去消旋拆分d，l-草铵膦
[0092]
按照(2)中方法培养能够表达d-氨基酸氧化酶的基因工程菌株e.colibl21(de3)/pet-30a-daao-wt和e.colibl21(de3)/pet-30a-daao(h70s/i74a/g244q/q337g)，离心收集菌体细胞并冻干。
[0093]
分别在3l反应器中，向1600ml含有300mm，400mm和500mm的d,l-ppt，8000u/l过氧化氢酶，1％(v/v)消泡剂的tris-hcl缓冲液(ph8.0，50mm)体系中分别加入20g/l e.coli bl21(de3)/pet-30a-daao-wt和e.coli bl21(de3)/pet-30a-daao(h70s/i74a/g244q/q337g)菌体，通过加入氨水控制ph8.0，在温度30℃条件下反应6-24小时。定时取样，使用高效液相色谱测定样品中2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(ppo)的含量，计算转化率，结果如图1所示。
[0094]
由图1可以看出，当使用实施例1所述酸性d-氨基酸氧化酶突变体做为催化剂进行催化反应时，随着时间推移，d-草铵膦的浓度逐渐降低，ppo的浓度逐渐升高。在300mm的底物浓度下，反应结束后，液相检测ppo的浓度大于149mm，几乎无法检测到d-ppt的存在，产品ppo的转化率最高可达49.9％，且反应最快可在6h内完成。在较高底物浓度(500mm)下，该突变体仍表现出较高的催化效率，能够在14h内催化转化生成大于248mm的ppo，转化率大于49.5％。显示出该突变体具有在高底物浓度下高效催化外消旋型d，l-草铵膦生成ppo的能力，且所得突变体对底物d，l-ppt的转化效率远高于野生型daao的转化效率。该酸性daao突变体的突变位点为第70位的氨基酸残基h替换为s，第74位的氨基酸残基i替换为a，第244位的氨基酸残基g替换为q，第337位的氨基酸残基q替换为g。
[0095]
对比例1：
[0096]
采用实施例1步骤(6)的方法，通过测定蒽醌类物质的生成量来计算比较野生型酸性d-氨基酸氧化酶(e.coli bl21(de3)/pet-30a-daao)对底物d-草铵膦的酶活力，结果如表2所示。
[0097]
可以看出野生型酸性d-氨基酸氧化酶的酶活力较低，仅0.033u/mg，显示其对非天然底物d-ppt的比活力较低，难以用于d，l-草铵膦的酶法拆分。
[0098]
采用实施例1步骤(7)的方法，如图2所示，通过测定ppo的转化率来比较野生型酸性d-氨基酸氧化酶在多酶催化体系去消旋拆分高浓度(300mm)d，l-草铵膦的催化效率，结果如图1所示。
[0099]
野生型酸性d-氨基酸氧化酶在反应进行24h后所得ppo的转化率仍低于15％，表明其对外消旋型d,l-ppt较低的催化效率，无法应用于大规模d，l-草铵膦的酶法拆分中。
[0100]
seq id no.1
[0101]
mppriiilgagiiglstavelqqrhqhrsaeprpsitivsaelpsqpsewtedprcrpspdyaswwagahyrpipgatpqlqreaqwamdtfrrmrriardapeagvrmmpgieyledspkeygrlrtgdryagehdefrvldkaelpegvawgcryqtyslnaphysrwlldrflagggqivhrklerleeaftlfedgsqplvinctgrnfdqddkmriirgqtvlvrnqfdrtitrqnrdgswifliprpfagtiiggtkepgdmevkprmetrlkllencvrafpefvdrledfdvvldnvgrrpwrdgglrleeeriedgktvihaygaggrgyelswgiakevadlvlaterskfecrvsenlk
[0102]
seq id no.2
[0103]
atgccacctcgtattattattctgggtgccggtattattggtctgtccaccgccgttgaactgcagcagcgtcatcagcatcgtagcgccgaaccgcgtccttcaattaccattgtttctgcagaactgccttctcagcctagtgaatggaccgaagatcctcgctgccgtccgagtcctgattatgcatcttggtgggcaggtgcacattatcgcccaattccgggcgcaaccccgcagctgcagcgtgaagcacagtgggcaatggatacatttcgtcgtatgcgtcgtattgcacgcgatgcacctgaagcgggtgttcgtatgatgcctggtattgaatatctggaagatagccctaaagaatatggtcgtctgcgtacaggtgatcgttatgcaggtgaacatgatgaatttcgtgtactggataaagcggaactgccggaaggtgtggcatggggttgtcgttatcagacttatagcctgaatgcacctcattatagccgttggctgctggatcgttttctggcgggtggtggtcagattgttcatcgtaaactggaacgtctggaagaagcatttaccctgtttgaagatggttctcagccgctggttattaattgtacgggtcgtaattttgatcaggatgataaaatgcgtatcattcgcggtcagaccgtgctggttcgtaatcagtttgatcgtaccattacccgtcagaatcgtgatggttcatggattttcctgattccgcgtccttttgcaggtaccattattggcggcaccaaagaaccgggtgatatggaagttaaaccgcgtatggaaacacgcctgaaactgctggaaaattgtgtgcgcgcctttccggaatttgttgatcgtctggaagattttgatgttgttctggataatgttggtcgtcgtccgtggcgtgatggtggtctgcgtctggaagaagaacgtattgaagatggtaaaaccgtcattcatgcatacggtgcaggtggtcgtggttatgaactgagctggggtattgcaaaagaagttgcggatctggtgctggcaaccgaacgtagcaaatttgaatgtcgtgtgagcgaaaacctgaaacatcatcatcatcatcattaa

技术特征：
1.一种酸性d-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列是在seq id no:1所示氨基酸序列基础上包含以下至少一个突变位点：h70s、i74a、g244q、q337g。2.根据权利要求1所述的酸性d-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，突变包括以下几种之一：h70s、i74a、g244q、q337g、h70s/i74a、h70s/g244q、h70s/q337g、i74a/g244q、h70s/i74a/g244q、h70s/i74a/q337g、h70s/g244q/q337g、h70s/i74a/g244q/q337g；优选：h70s/i74a/g244q、h70s/i74a/q337g、h70s/g244q/q337g、h70s/i74a/g244q/q337g、h70s/i74a、h70s/g244q、h70s/q337g；进一步优选：h70s/i74a/g244q、h70s/i74a/q337g、h70s/i74a/g244q/q337g、h70s/i74a；最优选：h70s/i74a/g244q/q337g。3.一种如权利要求1或2所述酸性d-氨基酸氧化酶突变体的编码基因。4.一种含有权利要求3所述酸性d-氨基酸氧化酶突变体编码基因的表达载体。5.一种含有权利要求4所述表达载体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求4所述的表达载体通过常规转化或转染技术引入宿主细胞后获得。6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞可以是原核或真核细胞；属于酵母属(saccharomyces)、曲霉属(aspergillus)、毕赤酵母属(pichia)、耶氏酵母属(yarrowia)、放线菌属(actinomycetes)、链霉菌属(streptomyces)、芽孢杆菌属(bacillus)或埃希氏杆菌属(escherichia)；优选地选自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia pastoris)、链霉菌(streptomyces)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或大肠杆菌(escherichia coli)中的至少一种。7.一种权利要求5所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)确定酸性d-氨基酸氧化酶突变位点，设计定点突变引物，以seq id no:2所示的野生型酸性d-氨基酸氧化酶核苷酸序列为模板，进行全质粒pcr反应，获得具有所述氨基酸突变的基因片段；(2)将pcr得到的基因片段产物进行酶切处理以去除模板dna，结束后将产物转化至感受态细胞，筛选获得具有该酸性d-氨基酸氧化酶突变体编码基因的感受态细胞，培养并提取重组表达载体；(3)将该重组表达载体转化进入到表达宿主细胞中，筛选获得酸性d-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。8.一种权利要求1或2所述酸性d-氨基酸氧化酶突变体在酶法拆分外消旋d,l-草铵膦中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酶催化体系中以游离酶和/或引入酶的表达载体的宿主细胞的形式加入；优选所述引入酶的表达载体的宿主细胞的添加量与酶催化体系的总反应液的比例为1-200g/l。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酶催化转化反应在ph为7-10的反应液体系中进行，反应温度为25-45℃，时间为6-24h。

技术总结
本申请涉及一种酸性D-氨基酸氧化酶的突变体，构建方法及其在酶法拆分草铵膦中的应用。所述酸性D-氨基酸氧化酶突变体是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上包含以下至少一个突变位点：H70S、I74A、G244Q、Q337G。本发明构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30a-DAAO具有高产酸性D-氨基酸氧化酶的性质，用于催化外消旋型D，L-PPT的氧化反应，在300mM底物浓度下可于6h内达到最高49.8％的转化率，转化效率远高于野生型DAAO的转化效率，可应用于微生物酶法拆分外消旋型草铵膦以及绿色高效生产L-草铵膦。草铵膦。草铵膦。


技术研发人员：曾伟民 杨凯 黄斌 邱冠周 刘学端 周洪波
受保护的技术使用者：中南大学
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/9/20