区分红皮龙眼和非红皮龙眼的InDel标记引物对及方法

区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel标记引物对及方法
技术领域
1.本发明属于龙眼遗传育种与分子生物学技术领域，具体涉及一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel标记引物对及方法。


背景技术：

2.龙眼是我国南方重要的经济果树，近五年我国龙眼收获面积基本保持在350-490万亩，年总产值均超过100亿元。作为我国热带特色优势水果，发挥了重要作用。现商品龙眼果皮主要为黄褐色，与同为无患子科的荔枝和红毛丹相比，颜色较为暗淡和单调，极大的限制了其商品价值。红皮龙眼(也称作红宝石龙眼)，果皮为亮丽的紫红色，果形与果实大小与主栽品种
‘
石硖’龙眼相似，果肉水分含量高，熟期在主栽区为8月中下旬，是龙眼果皮颜色改良的良好材料。
3.现龙眼育种普遍采用常规杂交育种的方法，但由于龙眼子代分化程度高，童期长(6-8年)，树木占地面积大等特点，采用传统杂交育种手段，需将杂交子代培育至正常开花结果才能对果实性状进行鉴定和评价，这个过程周期长(10-16年)，盲目性高，经济成本高。分子标记可以采用简单的分子生物学方法，在杂交子代苗期就对目标性状进行筛选，从而淘汰非目标单株，可以极大的提高育种效率。
4.在龙眼现有种质中，果皮颜色只有红色和非红色，且栽培种未发现红皮龙眼，基于基因组开发的分子标记较易区分红皮龙眼和非红皮龙眼，因此开发红皮龙眼果皮颜色特异分子标记可以极大提高龙眼果皮颜色改良的效率，促进我国龙眼产业持续健康发展。indel标记是共显性分子标记，在基因组上密度大，分布广泛，适宜进行全基因组分子标记的开发。与ssr标记和snp标记相比，只需使用普通pcr扩增，普通琼脂糖电泳检测，具有操作简单、快捷经济等优点，但现今尚未有鉴定红皮龙眼果皮颜色的indel分子标记的研究报道，因此开发与红皮龙眼果皮颜色相关的分子标记对于龙眼果皮颜色改良具有非常重要的意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel标记引物对及方法。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel标记引物对，indel标记引物对，正向引物为5
’‑
atgaggtaccttggcgtgtg-3’，反向引物为5’[0008]-ttcagagagcggtaccaagc-3’。
[0009]
一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel标记引物对在鉴别区分红皮龙眼和非红皮龙眼的应用。
[0010]
一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的筛选方法，所述方法包括：
[0011]
对龙眼自然群体种质表皮颜色进行鉴定；
[0012]
结合龙眼自然群体简化基因组测序数据进行变异分析；
[0013]
从获得的变异中获取位于染色体上的双等位基因indel；
[0014]
对获得的indel进行质量过滤,获得高质量indel；
[0015]
对获得的高质量indel进一步筛选出在所有红皮龙眼为纯合基因型的indel和在所有非红皮龙眼中为纯合基因型的indel；
[0016]
对所述基因型位点筛选出indel长度大于10bp小于50bp的indel，并设计特异型引物，以龙眼自然群体种质dna为模板，进行pcr扩增和琼脂糖电泳验证，获得了能显著区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel位点及引物对。
[0017]
优选地，所述基因型位点位于龙眼参考基因组chr1的22856271bp处，等位基因序列为aatttgagtacaactctttaacgacatccag/a，编码方向为5
’‑3’
，indel长度为31bp，命名为rp-indel-2。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有操作简单，准确性高、对实验设备和试剂的要求低，快捷经济等优点，对于加速龙眼果皮颜色遗传改良具有极大的潜在应用价值。
附图说明
[0019]
此处所说明的附图用来公开对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0020]
图1为rp-indel-2标记在72份龙眼种质中的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中标号m为50dl marker，标号1，3，5，7，9，11，15，17为红皮龙眼种质，其他为非红皮龙眼种质。
具体实施方式
[0021]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0022]
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
[0023]
本发明实施例提供一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel标记引物对，indel标记引物对，正向引物为5
’‑
atgaggtaccttggcgtgtg-3’，反向引物为5
’‑
ttcagagagcggtaccaagc-3’。
[0024]
本发明实施例还提供一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的筛选方法，所述方法包括：
[0025]
对龙眼自然群体种质表皮颜色进行鉴定；
[0026]
结合龙眼自然群体简化基因组测序数据进行变异分析；
[0027]
从获得的变异中获取位于染色体上的双等位基因indel；
[0028]
对获得的indel进行质量过滤,获得高质量indel；
[0029]
对获得的高质量indel进一步筛选出在所有红皮龙眼为纯合基因型的indel和在
所有非红皮龙眼中为纯合基因型的indel；
[0030]
对所述基因型位点筛选出indel长度大于10bp小于50bp的indel，并设计特异型引物，以龙眼自然群体种质dna为模板，进行pcr扩增和琼脂糖电泳验证，获得了能显著区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel位点及引物对。
[0031]
所述基因型位点位于龙眼参考基因组chr1的22856271bp处，等位基因序列为aatttgagtacaactctttaacgacatccag/a，编码方向为5
’‑3’
，indel长度为31bp，命名为rp-indel-2。
[0032]
实验数据1
[0033]
1、材料来源
[0034]
供试材料为国家热带果树种质资源圃(湛江)中72份龙眼自然群体材料，包括8份红皮龙眼材料，64份非红皮龙眼品种。
[0035]
2、方法
[0036]
2.1、表型鉴定
[0037]
对试验材料连续3年果皮颜色性状进行调查。
[0038]
2.2、pcr反应
[0039]
分别以试验材料dna为模板，利用设计的标记引物rp-indel-2(表1)，采用20μl反应体系(表2)，以表3的pcr反应程序进行扩增。
[0040]
表1rp-indel-2引物设计及其产物预测
[0041][0042]
表2pcr反应体系
[0043][0044][0045]
表3pcr反应程序
[0046][0047]
2.3、pcr产物电泳检测
[0048]
取5μl扩增的pcr产物经3％的琼脂糖凝胶电泳，以50dl marker作为对照，电泳缓冲液为0.5
×
tbe，电压120v，电泳30分钟。电泳结束后，利用凝胶成像系统对电泳结果进行检测。
[0049]
3、结果
[0050]
3.1、龙眼果皮颜色调查
[0051]
通过3年对72份龙眼自然群体材料果皮颜色进行调查，8份红皮龙眼材料果皮颜色均为红色，没有出现非红色果皮果实，64份非红皮龙眼种质果皮颜色也均为非红色，未出现红皮龙眼果实，表明控制果皮颜色的基因为纯合的基因。
[0052]
3.2、rp-indel-2标记对红皮龙眼的检出能力
[0053]
rp-indel-2引物在72份龙眼种质dna中均能检测到目的条带，且红皮龙眼pcr片段大小均为247bp(标号为1，3，5，7，9，11，15，17)，非红皮龙眼种质因有一段31bp的缺失，pcr片段大小均为214bp，扩增片段在红皮龙眼和非红皮龙眼中均为纯合基因型，与表型调查结果一致(图1)。结果表明此rp-indel-2标记能较为直观的区分红皮和非红皮龙眼种质。
[0054]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel标记引物对，其特征在于，indel标记引物对，正向引物为5
’‑
atgaggtaccttggcgtgtg-3’，反向引物为5
’‑
ttcagagagcggtaccaagc-3’。2.一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel标记引物对在鉴别区分红皮龙眼和非红皮龙眼的应用。3.一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel筛选方法，其特征在于，所述方法包括：对龙眼自然群体种质表皮颜色进行鉴定；结合龙眼自然群体简化基因组测序数据进行变异分析；从获得的变异中获取位于染色体上的双等位基因indel；对获得的indel进行质量过滤,获得高质量indel；对获得的高质量indel进一步筛选出在所有红皮龙眼为纯合基因型的indel和在所有非红皮龙眼中为纯合基因型的indel；对所述基因型位点筛选出indel长度大于10bp小于50bp的indel，并设计特异型引物，以龙眼自然群体种质dna为模板，进行pcr扩增和琼脂糖电泳验证，获得了能显著区分红皮龙眼和非红皮龙眼的indel位点及引物对。4.根据权利要求3所述的区分红皮龙眼和非红皮龙眼的筛选方法，其特征在于，所述基因型位点位于龙眼参考基因组chr1的22856271bp处，等位基因序列为aatttgagtacaactctttaacgacatccag/a，编码方向为5
’‑3’
，indel长度为31bp，命名为rp-indel-2。

技术总结
本发明公开了一种区分红皮龙眼和非红皮龙眼的InDel标记引物对及方法，InDel标记引物对，正向引物为5


技术研发人员：胡小文 朱利飞 翁晓杰 刘丽琴 石胜友 周建男 李甜子
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/9/20