一种藤茶茎或叶总黄酮分离方法及乳膏的制备及应用

1.本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种藤茶茎或叶总黄酮分离方法及乳膏的制备及应用。


背景技术：

2.银屑病(psoriasis)是一种严重的非传染性，炎症介导的自身免疫性慢性皮肤疾病。银屑病的病理特征是角质形成细胞增生和t细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞的浸润。目前被认可的发病机制是以il-23/th17为轴的慢性炎症反应，髓系树突状细胞释放il-23和il-12，激活产生il-17的t细胞、th1细胞和th22细胞，产生丰富的银屑病细胞因子il-17、ifn-γ、tnf和il-22，进而诱导银屑病临床特征。同时，这些细胞因子介导角质形成细胞的过度增殖和趋化因子的释放，参与银屑病炎症反应。银屑病由于发病周期长，容易复发，而且无法痊愈，严重影响了患者的生活质量。银屑病的治疗需长期用药，治疗方法的选择取决于疾病的严重程度。根据银屑病患者病变的临床严重程度(pasi评分)、受影响体表面积的百分比(bsa评分)和患者的生活质量，常分为轻度或中度，重度银屑病。目前轻中度银屑病患者一般使用外用药物，中重度患者通常需要全身治疗。当今国内外银屑病的药物研发方向主要是il-12/23p40抗体，il-17a抗体，tnf-α抗体等生物制剂，以及pde4抑制剂，jak抑制剂和nrf2刺激剂等小分子化药。中药方面如复方青黛胶囊、雷公藤多甘片、郁金银屑片、消银胶囊等复方制剂。迄今，银血病的治疗尚缺乏特异性的治疗方法和有效的药物。
3.藤茶为葡萄科同属蛇葡萄、光叶蛇葡萄、异叶蛇葡萄、三裂叶蛇葡萄、广东蛇葡萄和大叶蛇葡萄等的干燥全株，一般生长自沟谷林中或山坡灌丛，海拔200～1500米。其中，以葡萄科，蛇葡萄属的显齿蛇葡萄(ampelopsis grossedentata)的茎叶为原料较多，经过摊青、杀青、揉捻、自然堆放、烘干、复干、精选分级、灭菌等工艺制作，保持其固有的色、香、味、形，供冲泡饮用的藤茶。其根和茎的细粉常作为藤茶粉使用。
4.藤茶富含黄酮类化合物、酚类、甾体及萜类化合物、挥发油等活性成分，以及氨基酸、维生素和矿物质元素等。藤茶味甘、淡、性凉，具清热解毒、祛风湿、强筋等功效。现代药理学研究认为，藤茶可用于增强免疫、治疗感冒发热、消炎、咽喉肿痛、黄疽型肝炎和降脂、降糖等功效。民间将其幼嫩茎叶制成茶饮治疗疾病已有几百年的应用历史。
5.由于藤茶基原较多，含有的化学成分相近，在大量民间应用和现代药理学研究基础上，针对藤茶的增强免疫和抗菌消炎的应用记载，结合银屑病的发病机制和治疗策略，开发了一种采用藤茶为原料的用于预防和/或治疗人银屑病的中药制剂及其制备方法。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明提出了一种藤茶茎或叶总黄酮分离方法及乳膏的制备及应用。
7.本发明第一方面提供了藤茶茎或叶总黄酮提取物在制备预防和/或治疗银屑病的
药物中的应用。
8.本发明第二方面提供了藤茶茎、叶总黄酮的提取分离方法。
9.本发明第三方面提供了藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏制备方法。
10.为达到上述目的，采用的技术方案为：
11.一种藤茶茎或叶总黄酮的提取分离方法，包括如下步骤：
12.步骤1：取藤茶茎或藤茶叶药材打粉，过筛得到粉末；
13.步骤2：将粉末分为两份，第一份粉末加水，加热回流，趁热过滤，得到滤液a；将第二份粉末加水，加热回流，趁热过滤，得到滤液b；合并滤液a和滤液b，得到滤液；
14.步骤3：滤液浓缩，加溶剂超声，静置分离，取上清液减压回收，挥干溶剂，得到藤茶茎总黄酮提取物；或者，滤液置于不高于4℃冰箱中静置，取得到的沉淀置于蒸发皿中，挥干水分，得到藤茶叶总黄酮提取物。
15.步骤1中所述取藤茶茎或藤茶叶药材打粉30-60s，过40目筛；
16.步骤2中第一份粉末与水的质量体积比为1g：40-80ml，加热回流时间为1-2h；所述第二份粉末与水质量体积比为1g：16-40ml，加热回流时间为0.5-1h；
17.步骤3中采用的溶剂为乙酸乙酯，所述滤液和乙酸乙酯的体积比为1:(8～12)；所述超声时间0.5-1h；所述减压的压力为900-1000pa；所述滤液置于4℃冰箱中静置时间为24-72h；
18.一种藤茶茎或藤茶叶总黄酮提取物的乳膏，由以下质量份的组分组成：
19.藤茶茎或藤茶叶总黄酮提取物200-800mg
20.丙二醇i 1000-2000mg
21.单硬脂酸甘油酯500-1000mg
22.硬脂醇100-300mg
23.液状石蜡200-400mg
24.聚山梨酯80 200-500mg
25.丙二醇ii 1000-1500mg
26.羟苯乙酯5-15mg
27.无菌水3-6g
28.所述藤茶茎或藤茶叶总黄酮提取物的乳膏的制备方法，包括：
29.将藤茶茎总黄酮提取物或藤茶叶总黄酮提取物与丙二醇i研磨成细腻糊状，备用；
30.将单硬脂酸甘油酯、硬脂醇、液状石蜡在水浴中加热至60-80℃使其熔化得到油相；
31.将聚山梨酯80、丙二醇ii、羟苯乙酯溶于无菌水，加热至与油相温度相近得到水相，在不断搅拌下将水相加入油相中，搅拌冷凝，待膏体呈半固体时，加入上述细腻糊状物，搅匀即可。
32.本发明提供的藤茶茎或藤茶叶总黄酮提取物乳膏在制备预防和/或治疗银屑病的药物中的应用。
33.本发明的有益效果为：
34.藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏在对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠进行干预治疗后，改善了银屑病小鼠的pasi评分；减小了真皮中炎性细胞的大量浸润；抑制了表皮细胞的异
常增殖；降低了皮肤的氧化损伤。因此藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏能够用于制备预防和/或治疗银屑病的药物，为银屑病的治疗提供了更新更广的选择。
附图说明
35.图1为藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏干预银屑病小鼠的流程图；
36.图2为藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠背部皮肤的影响；
37.图3为藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠体重及pasi评分的影响；
38.图4为藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠脾脏指数及血清中炎症因子的影响；
39.图5为藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠背部皮肤中t-aoc、cat、mda的影响；
40.图6为藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠背部皮肤组织病理学切片染色结果。
具体实施方式
41.材料：
42.咪喹莫特乳膏：购自四川明欣药业有限责任公司
43.苏木素和伊红染色液：购于珠海贝索。
44.鼠il-17检测试剂盒：购自欣博盛生物科技有限公司。
45.balb/c小鼠：购于辽宁长生生物技术股份有限公司。
46.单硬脂酸甘油酯：天津市光复科技发展有限公司。
47.硬脂醇：天津市大茂化学试剂厂。
48.液状石蜡：天津市富宇精细化工有限公司。
49.羟苯乙酯：天津一方科技有限公司。
50.丙二醇：天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
51.聚山梨酯80：天津市科密欧化学试剂有限公司。
52.本发明的加热回流过程，在加热套中进行；
53.本发明的减压回收过程，为采用隔膜泵进行减压；
54.实施例1
55.藤茶茎、叶总黄酮的提取分离方法
56.1.1藤茶茎总黄酮的提取分离方法
57.取藤茶茎药材打粉30s，过40目筛，精密称定粉末2.5g于圆底烧瓶中，第一次加入100ml水，加热回流1h，趁热过滤。第二次加入50ml水，加热回流0.5h，趁热过滤，合并两次滤液，浓缩至10ml，加100ml乙酸乙酯超声1h置分液漏斗中。静置，分层，取上清液减压回收，挥干，称重得66.3mg提取物，经含量测定得总黄酮为11.69mg，提取率为0.46％。
58.1.2藤茶叶总黄酮的提取分离方法
59.取藤茶叶药材打粉30s，过40目筛，精密称定粉末2.5g于圆底烧瓶中，第一次加入100ml水，加热回流1h，趁热过滤。第二次加入50ml水，加热回流0.5h，趁热过滤，合并两次滤液，于4℃冰箱静置48h，取结晶置于蒸发皿中，挥干水分，称重得552.8mg提取物，经含量测
定得总黄酮为508.6mg，提取率为20.34％。
60.实施例2
61.藤茶茎总黄酮提取物的乳膏制备方法
62.将360mg藤茶茎总黄酮提取物与1080mg丙二醇i研磨成细腻糊状，备用。将单硬脂酸甘油酯676mg、硬脂醇225mg、液状石蜡338mg在水浴上加热至78℃使其熔化得到油相；将338mg聚山梨酯80、1464mg丙二醇ii、10mg羟苯乙酯溶于5.52ml的无菌水，加热至与油相温度相近得到水相，在不断搅拌下将水相加入油相中，搅拌冷凝，待膏体呈半固体时，加入上述细腻糊状物，搅匀即可。
63.实施例3
64.藤茶叶总黄酮提取物的乳膏制备方法
65.将600mg藤茶叶总黄酮提取物与1800mg丙二醇i研磨成细腻糊状，备用。将单硬脂酸甘油酯600mg、硬脂醇200mg、液状石蜡300mg在水浴上加热至78℃使其熔化得到油相；将300mg聚山梨酯80、1300mg丙二醇ii、10mg羟苯乙酯溶于4.9ml的无菌水，加热至与油相温度相近得到水相，在不断搅拌下将水相加入油相中，搅拌冷凝，待膏体呈半固体时，加入上述细腻糊状物，搅匀即可。
66.实施例4
67.4.1动物模型建立及分组给药
68.在6-8周龄雌性balb/c小鼠中诱导银屑病。小鼠购于辽宁长生生物技术股份有限公司，使用许可证：syxk(辽)2021
‑‑
0009。所有小鼠在实验前适应实验室环境(20
±
2℃，60
±
5％湿度，12/12h光照/黑暗周期)2周。所有动物方案均根据《实验动物关爱和使用指南》设计，并经沈阳药科大学动物房伦理委员会批准。小鼠建立银屑病模型，第0天进行脱毛处理，脱毛区域2cm
×
4cm。小鼠分为五组，第0天进行脱毛处理；第1-7天每天上午同一时间称取62.5mg咪喹莫特乳膏涂抹于五组小鼠背部脱毛区域；空白组第1-7天每天下午不做处理；模型组第1-7天每天下午给予不含藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏100mg；阳性药组第1-7天每天下午给予30mg卡泊三醇乳膏；低剂量组第1-7天每天下午给予3.6％藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏100mg；高剂量组第1-7天每天下午给予7.2％藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏100mg。第7天采用异氟烷麻醉后牺牲小鼠，流程见图1。
69.4.2小鼠体重及背部皮肤pasi评分记录
70.体重反应了小鼠的健康程度，每天对小鼠进行称重。pasi评分反映了小鼠银屑病严重程度。在牺牲之前，每天由两名研究人员通过视觉评分从0到4对小鼠的背部皮肤鳞屑和红斑严重程度分别进行评估：0，正常；1，轻度；2，中度；3，重度；4，极重度。计算pasi评分，每只动物最高评分为8分。
71.4.3小鼠背部皮肤病理学观察
72.4.3.1苏木素-伊红(he)染色
73.取背部皮肤浸泡于10％福尔马林缓冲液，10％edta脱钙处理后石蜡包埋，连续石蜡切片。
74.(1)包埋蜡块：组织经固定后，切取大小适宜，放入包埋盒，依次入梯度乙醇脱水，50％乙醇涮洗，70％乙醇50min，80％乙醇50min，95％乙醇i 50min，95％乙醇ii 50min，无水乙醇i 40min，无水乙醇ii 40min，二甲苯无水酒精混合液15min，二甲苯i10min，二甲苯
ii 10min，石蜡i1h，石蜡ii 40min，使用包埋托进行包埋成蜡块。
75.(2)石蜡切片脱蜡至水：(二甲苯2缸各5min，然后100％，95％，80％梯度酒精复水，每缸5min)，蒸馏水洗。
76.(3)0.5％固绿染色液内浸染30s-1min，1％醋酸快速漂洗2-3次，水洗。
77.(4)1％番红o溶液染色3-5min(具体摸条件)，95％乙醇洗脱。
78.(5)95％酒精5min、100％酒精5min、二甲苯。
79.(6)显微镜镜检，图像采集分析。
80.4.3.2ihc染色
81.(1)切片首先用二甲苯脱蜡3次，每次15min，接着依次置于无水乙醇(2次，每次5min)、85％乙醇(5min)、75％乙醇(5min)、50％乙醇(5min)，再用蒸馏水洗5min；
82.(2)若进行ki67染色，把切片浸入修复盒中的柠檬酸抗原修复缓冲液(ph 6.0)；若进行il-23或il-17染色，把切片浸入修复盒中的tris-edta抗原修复液(ph 9.0)。随后置于微波炉内，先开中火加热至沸，停火10min，再用中低火继续加热10min，进行抗原修复。自然室温冷却后将切片浸入pbs(ph 7.4)，置于脱色摇床进行晃动洗涤(3次，每次5min)；
83.(3)把切片浸入2％双氧水溶液，避光室温孵育20min，阻断内源性过氧化物酶。然后将切片浸入pbs(ph 7.4)，置于脱色摇床进行晃动洗涤(3次，每次5min)；
84.(4)在组化圈定范围内滴加1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)溶液，均匀地覆盖组织，室温下进行血清封闭60min；
85.(5)用滤纸轻轻擦掉切片上剩余的封闭液，再滴加按一定比例稀释后的一抗，将切片置于湿盒中4℃过夜；
86.(6)将切片浸入pbs(ph 7.4)，置于脱色摇床进行晃动洗涤(3次，每次5min)，稍用滤纸吸干后继续滴加已稀释的二抗(hrp标记)覆盖组织，室温再孵育60min；
87.(7)将切片浸入pbs(ph 7.4)，置于脱色摇床进行晃动洗涤(3次，每次5min)，稍用滤纸吸干后继续滴加dab显色液，显微镜连续观察以控制显色时间，阳性呈现棕黄色，用自来水冲洗终止显色；
88.(8)切片用苏木素染液复染3～5min后流水冲洗数秒钟，接着用分化液分化数秒钟后流水冲洗15s，随后用返蓝液返蓝，再用流水冲洗10min；
89.(9)将切片依次置于75％乙醇(5min)、85％乙醇(5min)、无水乙醇(2次，每次5min)、正丁醇(5min)、二甲苯(5min)中脱水透明，稍晾干后使用中性树胶封片。
90.(10)显微镜镜检，图像采集分析。
91.实施例5
92.藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠体重、背部皮肤及pasi评分的影响
93.小鼠的体重变化是评价藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏毒性的重要指标；pasi评分是评估小鼠银屑病严重程度的重要指标。本实施例对小鼠体重及pasi评分进行检测，于第1-7天每天进行检测和记录，结果如图2-3所示。
94.从图2中可以看出，第3天时模型组与阳性药组小鼠背部出现红斑，第5天模型组与阳性药组红斑症状加重，同时有鳞屑产生；低剂量和高剂量给药组有轻微鳞屑产生，第7天模型组与阳性药组鳞屑增厚严重甚至脱落；低剂量和高剂量组给药背部皮肤均有轻微鳞屑产生。与模型组、阳性药组相比，治疗组的背部皮肤症状有明显改善，pasi评分与形态学观
察结果一致(图3)。可见，藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏能够改善银屑病小鼠症状。
95.实施例6
96.藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠脾脏指数及体内血清中细胞因子的影响
97.脾脏是小鼠重要的免疫器官，脾脏指数一定程度上可以反映机体免疫功能的强弱。银屑病小鼠在实验第七天牺牲收集脾脏，计算脾脏指数。从图4中可以看出，藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏显著提高了小鼠脾脏指数。对银屑病小鼠进行眼眶静脉丛取血，静置3h后离心，取上清采用elisa法检测小鼠血清炎症因子il-17的水平，结果如图4所示。
98.实施例7
99.藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠背部皮肤氧化应激损伤的影响
100.t-aoc作为反映机体总抗氧化能力的重要指标，可以用来评估藤茶总黄酮提取物乳膏对咪喹莫特诱导的机体氧化应激损伤的保护作用；cat作为机体中重要的抗氧化酶，主要功能为清除ros和抗氧化应激。mda作为脂质过氧化物的产物，可反映机体受到自由基攻击的强度和程度。咪喹莫特诱导银屑病的发生会导致上述酶和氧化产物的平衡被打破，从而出现氧化应激损伤。从图5中可以看出，藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏可以显著提高咪喹莫特诱导后的小鼠总抗氧能力及cat活性，减少氧化中间产物mda的产生，保护小鼠的氧化应激损伤。
101.实施例8
102.藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠组织病理学的影响
103.balb/c小鼠经7天咪喹莫特造模后，会产生明显的银屑病症状。为进一步验证藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对银屑病小鼠的治疗作用，本实验采用小鼠背部皮肤经经4％福尔马林溶液固定后进行石蜡切片，分别进行小鼠背部皮肤he和ihc染色，观察小鼠背部皮肤的病理变化，结果如图6所示。从图中可以看出表皮厚度显著降低；炎症因子il-17、il-23水平显著降低；基底层ki67表达显著减弱。

技术特征：
1.一种藤茶茎或叶总黄酮分离方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取藤茶茎或藤茶叶打粉，过筛得到粉末；步骤2：将粉末分为两份，第一份粉末加水，加热回流，趁热过滤，得到滤液a；将第二份粉末加水，加热回流，趁热过滤，得到滤液b；合并滤液a和滤液b，得到滤液；步骤3：滤液浓缩，加溶剂超声，静置分离，取上清液减压回收，挥干溶剂，得到藤茶茎总黄酮提取物；或者，滤液置于不高于4℃冰箱中静置，取得到的沉淀置于蒸发皿中，挥干水分，得到藤茶叶总黄酮提取物。2.根据权利要求1所述的藤茶茎或叶总黄酮分离方法，其特征在于，步骤1中所述取藤茶茎或藤茶叶药材打粉30-60s，过40目筛。3.根据权利要求1所述的藤茶茎或叶总黄酮分离方法，其特征在于，步骤2中所述第一份粉末与水的质量体积比为1g：40-80ml，加热回流时间为1-2h；所述第二份粉末与水的质量体积比为1g：16-40ml，加热回流时间为0.5-1h。4.根据权利要求1所述的藤茶茎或叶总黄酮分离方法，其特征在于，步骤3中所述溶剂为乙酸乙酯，所述滤液和乙酸乙酯的体积比为1：(8～12)；所述超声时间0.5-1h；所述减压的压力为900-1000pa；所述滤液置于不高于4℃冰箱中静置时间为24-72h。5.一种采用权利要求1～4任意一项所述的藤茶茎或叶总黄酮分离方法获得的藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏，其特征在于，由以下质量份的组分组成：藤茶茎或藤茶叶总黄酮提取物200-800mg，丙二醇i 1000-2000mg，单硬脂酸甘油酯500-1000mg，硬脂醇100-300mg，液状石蜡200-400mg，聚山梨酯80 200-500mg，丙二醇ii 1000-1500mg，羟苯乙酯5-15mg，无菌水3-6g。6.一种权利要求5所述的藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将藤茶茎总黄酮提取物或藤茶叶总黄酮提取物与丙二醇i研磨成细腻糊状，备用；将单硬脂酸甘油酯、硬脂醇、液状石蜡在水浴中加热得到油相；将聚山梨酯80、丙二醇ii、羟苯乙酯溶于无菌水，加热得到水相，搅拌下将水相加入油相中，搅拌冷凝，待膏体呈半固体时，加入上述细腻糊状物，搅匀即得藤茶茎或藤茶叶总黄酮提取物的乳膏。7.根据权利要求6所述的藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏的制备方法，其特征在于，所述所述加热的温度为60-80℃。8.一种藤茶茎或藤茶叶总黄酮提取物的乳膏在制备预防和/或治疗银屑病的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种藤茶茎或叶总黄酮分离方法及乳膏的制备及应用，属于中药制药技术领域，本发明提供了藤茶茎或叶总黄酮提取物的分离方法和含有藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏的制备，以及藤茶茎或叶总黄酮提取物的乳膏在制备治疗和/或预防寻常型银屑病的药物中的应用。藤茶茎或叶总黄酮提取物乳膏对咪喹莫特诱导的Balb/c小鼠进行干预治疗后，对小鼠体重无明显影响、显著改善了Balb/c小鼠银屑病症状、降低了PASI评分、减少了真皮中炎性细胞的大量浸润、抑制了表皮细胞的异常增殖、减轻了氧化应激损伤。因此藤茶茎或叶总黄酮提取物能够用于制备治疗和/或预防银屑病的药物。于制备治疗和/或预防银屑病的药物。于制备治疗和/或预防银屑病的药物。


技术研发人员：贾景明 王安华
受保护的技术使用者：沈阳药科大学
技术研发日：2023.07.28
技术公布日：2023/9/20