一种管状固定化D-泛解酸内酯水解酶细胞的方法及其应用

一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.d-泛解酸，也被称为维生素b5，是一种水溶性维生素。d-泛解酸在人体内可以作为辅酶a（coa）的前体物质，参与葡萄糖、脂肪和蛋白质代谢等许多生化反应。此外，d-泛解酸还可以增强免疫系统功能、改善皮肤和头发健康、促进细胞的生长和分化等。d-泛解酸缺乏可以导致一些健康问题，包括皮肤炎症、神经系统障碍和肾上腺皮质功能受损等。
3.传统的d-泛解酸内酯拆分方法主要包括化学法和物理法。使用传统拆分方法所产生的废弃物，特别是化学废液，通常需要特殊处理和处置，消耗较大的人力、财力和物力。这会带来管理上的困难和成本上的增高。传统的拆分方法通常使用的试剂和溶剂对环境造成的负面影响较大，包括对水、土壤、海洋等环境的污染与破坏。同时传统方法能耗高、成本高，传统方法一般要求高温、高压、高能量等条件，能耗较高，成本相对较高。传统方法拆分d-泛解酸内酯时高温、高压或强酸、强碱等条件容易导致d-泛解酸的分解，降低产品的产率和纯度。相对而言，使用生物法拆分d-泛解酸内酯更温和并且更具环保性，产品的纯度也更高。
4.目前使用较多的固定化泛解酸内酯细胞方法，一般是采用戊二醛、大孔树脂、硅藻土交联固定等。
5.现有的固定化泛解酸内酯细胞方法主要存在的问题有：首先，目前使用的戊二醛交联剂等部分试剂有轻微毒性，不利于固定化细胞进行多次重复使用；使用戊二醛、大孔吸附树脂、硅藻土等进行固定化细胞，这种固定化细胞方法在每次终止反应后难以回收，或者进行回收后难以避免损失一部分固定化细胞；在使用海藻酸钙小球作为载体进行固定化细胞，解决了难以回收的问题，但是同时也减少了底物与细胞的接触，使得细胞的催化效率大大减少。以上的问题都会导致企业在生产过程中增加时间和材料成本，大大降低了生产效率。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法及其应用。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，以海藻酸钠、氯化钙和普朗尼克f-127为原料制备固定化载体，固定化产d-泛解酸内酯水解酶的菌体得到固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞。
8.优选的技术方案为：包括下列步骤：步骤1：向产d-泛解酸内酯水解酶的菌体中加入生理盐水，制成菌悬液；步骤2：向菌悬液中加入海藻酸钠，混合后得到溶液；
步骤3：配制含有cacl2和普朗尼克f-127的混合溶液；步骤4：使用注射泵将溶液和混合溶液混合注射，得到管状固定化细胞；步骤5：将固定化细胞保存在cacl2溶液中进行浸泡；步骤6：将浸泡后的固定化细胞放入tris-hcl溶液中进行长期保存。
9.优选的技术方案为：菌悬液的终浓度为100-300mg/ml；海藻酸钠的添加量为菌悬液的1-4w/v%。
10.优选的技术方案为：所述混合溶液中，cacl2的终浓度为1-4w/v%；普朗尼克f-127的浓度为0.2-1%w/v。
11.优选的技术方案为：注射溶液的注射泵的流速为2ml/min-3ml/min；注射混合溶液的注射泵的流速为2ml/min-3ml/min。
12.优选的技术方案为：步骤5中，所述cacl2溶液的浓度为1-3%w/v；浸泡时间为1-5h。
13.优选的技术方案为：所述tris-hcl溶液的ph为7.0-8.0；所述tris-hcl溶液的终浓度为50-200mm。
14.优选的技术方案为：包括下列步骤：step1：配制dl-泛解酸内酯缓冲液，调节ph值，得到dl-泛解酸内酯转化液；step2：向dl-泛解酸内酯转化液中加入固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞，再进行转化得到d-泛解酸。
15.优选的技术方案为：配制dl-泛解酸内酯缓冲液时，使用的缓冲液为50-200mm tris-hcl，ph为7.0-7.5，或者为50-200mm pipes-naoh，ph为7.-7.5；转化时的温度为30℃-35℃，转化时间为1-3h。
16.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：本发明将细胞固定在由海藻酸钠、氯化钙和普朗尼克f-127制备的中空管壁上，载体更加稳定，形成的固定化细胞更加稳定，同时增大了固定化细胞与底物的接触面积，使得水解效率增加。管状固定化细胞固定在管壁上，在固定化细胞长期存储时，能够充分的接触到缓冲液，大大延长了固定化细胞的寿命。管状固定化细胞可以根据需要制作成不同粗细的、大小的管状，同时可以根据需要裁剪成不同长短的载体，在进行多批次反复使用时，回收十分方便。
附图说明
17.图1为管状固定化细胞实际形态。
18.图2为管状固定化细胞显微镜下实际形态。
19.图3为管状固定化在扫描电镜下的实际形态。
20.图4为管状固定化细胞按照上述的酶活检测方法进行水解反应得到固定化细胞反应套用批次。
21.图5为管状固定化细胞在50mm tris
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hcl和50mm cacl2混合溶液中进行存储一个30天的相对酶活性。
具体实施方式
22.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施
例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
23.请参阅图1-5。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
24.以下实施例所述试剂或材料若无说明，均为市售。
25.下面结合实例，对本发明技术方案做进一步详细的说明。
26.实施例1：一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法及其应用向2g d-泛解酸内酯水解酶菌体 (大肠杆菌)中加入0.9%生理盐水，并定容至10ml，得到浓度为200mg/ml的菌悬液；菌悬液中加入3%的海藻酸钠，充分溶解成膏状，4℃过夜静止存放或3000rpm离心5-10min完全排除气泡。
27.配制2%氯化钙和1%普朗尼克f-127混合溶液。
28.将上述菌悬液和混合溶液使用注射泵进行混合注射打印，其中菌悬液的流速为2.5ml/mim，氯化钙和f-127混合液流速为3ml/min。
29.将打印完成的纤维管保存在2%氯化钙溶液中2h进行充分的反应，使固定化完成的材料结构保持均一稳定。
30.之后将固定化细胞存放在ph 7.4 50mm tris-hcl和50mm cacl2的混合溶液中进行长期4℃保存。
31.配制40ml 200mm ph 7.4 tris-hcl和50mm cacl2的混合溶液，加入5ml 10% dl-泛解酸内酯，之后加入1g固定化细胞，5ml纯水使反应体系至50ml于250ml锥形瓶中， 35℃ 180rpm摇床反应1h得到泛解酸，使用hplc进行酶活检测。
32.液相检测方法：c18色谱柱，sb-aqc18柱：250mm
×
4.6mm
×
5um；检测波长：210nm；流速：1.0ml/min，柱温：30℃，运行时间:20min； 流动相：乙腈：20mm kh2po4（1：9）。
33.如图1，为管状固定化细胞实际形态，将固定化细胞裁剪至实际需要的长短，按照上述的酶活检测体系进行水解反应.如图2，为管状固定化细胞显微镜下实际形态，其中固定化细胞外径为0.689mm，内径为0.646mm。
34.如图3，为管状固定化在扫描电镜下的实际形态，可以清晰看到固定在载体上的大肠杆菌菌体。
35.如图4，为管状固定化细胞按照上述的酶活检测方法进行水解反应得到固定化细胞反应套用批次，可以看到经过20批次的反应后，管状固定化细胞仍然保持了80%左右的相对酶活性。
36.如图5，为管状固定化细胞在50mm tris-hcl和50mm cacl2混合溶液中进行存储一个30天的相对酶活性，可以看到在混合溶液中保存30天，管状固定化细胞仍然保持了90%以上的相对酶活性。
37.实施例2：一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法及其应用
一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，以海藻酸钠、氯化钙和普朗尼克f-127为原料制备固定化载体，固定化产d-泛解酸内酯水解酶的菌体得到固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞。
38.优选的技术方案为：包括下列步骤：步骤1：向产d-泛解酸内酯水解酶的菌体中加入生理盐水，制成菌悬液；步骤2：向菌悬液中加入海藻酸钠，混合后得到溶液；步骤3：配制含有cacl2和普朗尼克f-127的混合溶液；步骤4：使用注射泵将溶液和混合溶液混合注射，得到管状固定化细胞；步骤5：将固定化细胞保存在cacl2溶液中进行浸泡；步骤6：将浸泡后的固定化细胞放入tris-hcl溶液中进行长期保存。
39.优选的实施方式为：菌悬液的终浓度为100mg/ml；海藻酸钠的添加量为菌悬液的1w/v%。
40.优选的实施方式为：所述混合溶液中，cacl2的终浓度为1w/v%；普朗尼克f-127的浓度为0.2%w/v。
41.优选的实施方式为：注射溶液的注射泵的流速为2ml/min；注射混合溶液的注射泵的流速为2ml/min。
42.优选的实施方式为：步骤5中，所述cacl2溶液的浓度为1%w/v；浸泡时间为1h。
43.优选的实施方式为：所述tris-hcl溶液的ph为7.0；所述tris-hcl溶液的终浓度为50mm。
44.优选的实施方式为：包括下列步骤：step1：配制dl-泛解酸内酯缓冲液，调节ph值，得到dl-泛解酸内酯转化液；step2：向dl-泛解酸内酯转化液中加入固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞，再进行转化得到d-泛解酸。
45.优选的实施方式为：配制dl-泛解酸内酯缓冲液时，使用的缓冲液为50-200mm tris-hcl，ph为7.0；转化时的温度为30℃，转化时间为1h。
46.实施例3：一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法及其应用一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，以海藻酸钠、氯化钙和普朗尼克f-127为原料制备固定化载体，固定化产d-泛解酸内酯水解酶的菌体得到固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞。
47.优选的实施方式为：包括下列步骤：步骤1：向产d-泛解酸内酯水解酶的菌体中加入生理盐水，制成菌悬液；步骤2：向菌悬液中加入海藻酸钠，混合后得到溶液；步骤3：配制含有cacl2和普朗尼克f-127的混合溶液；步骤4：使用注射泵将溶液和混合溶液混合注射，得到管状固定化细胞；步骤5：将固定化细胞保存在cacl2溶液中进行浸泡；步骤6：将浸泡后的固定化细胞放入tris-hcl溶液中进行长期保存。
48.优选的实施方式为：菌悬液的终浓度为300mg/ml；海藻酸钠的添加量为菌悬液的4w/v%。
49.优选的实施方式为：所述混合溶液中，cacl2的终浓度为4w/v%；普朗尼克f-127的
浓度为1%w/v。
50.优选的实施方式为：注射溶液的注射泵的流速为3ml/min；注射混合溶液的注射泵的流速为3ml/min。
51.优选的实施方式为：步骤5中，所述cacl2溶液的浓度为3%w/v；浸泡时间为5h。
52.优选的实施方式为：所述tris-hcl溶液的ph为8.0；所述tris-hcl溶液的终浓度为200mm。
53.优选的实施方式为：包括下列步骤：step1：配制dl-泛解酸内酯缓冲液，调节ph值，得到dl-泛解酸内酯转化液；step2：向dl-泛解酸内酯转化液中加入固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞，再进行转化得到d-泛解酸。
54.优选的实施方式为：配制dl-泛解酸内酯缓冲液时，使用的缓冲液为200mm pipes-naoh，ph为7.5；转化时的温度为35℃，转化时间为3h。
55.以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

技术特征：
1.一种管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，其特征在于：以海藻酸钠、氯化钙和普朗尼克f-127为原料制备固定化载体，固定化产d-泛解酸内酯水解酶的菌体得到固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞。2.根据权利要求1所述的管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：向产d-泛解酸内酯水解酶的菌体中加入生理盐水，制成菌悬液；步骤2：向菌悬液中加入海藻酸钠，混合后得到溶液；步骤3：配制含有cacl
2 和普朗尼克f-127的混合溶液；步骤4：使用注射泵将溶液和混合溶液混合注射，得到管状固定化细胞；步骤5：将固定化细胞保存在cacl2溶液中进行浸泡；步骤6：将浸泡后的固定化细胞放入tris-hcl溶液中进行长期保存。3.根据权利要求2所述的管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，其特征在于：菌悬液的终浓度为100-300mg/ml；海藻酸钠的添加量为菌悬液的1-4w/v%。4.根据权利要求2所述的管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，其特征在于：所述混合溶液中，cacl2的终浓度为1-4w/v%；普朗尼克f-127的浓度为0.2-1%w/v。5.根据权利要求2所述的管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，其特征在于：注射溶液的注射泵的流速为2ml/min-3ml/min；注射混合溶液的注射泵的流速为2ml/min-3ml/min。6.根据权利要求2所述的管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，其特征在于：步骤5中，所述cacl2溶液的浓度为1-3%w/v；浸泡时间为1-5h。7.根据权利要求2所述的管状固定化d-泛解酸内酯水解酶细胞的方法，其特征在于：所述tris-hcl溶液的ph为7.0-8.0；所述tris-hcl溶液的终浓度为50-200mm。8.根据权利要求1-7任一所述的固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞的应用，其特征在于：包括下列步骤：step1：配制dl-泛解酸内酯缓冲液，调节ph值，得到dl-泛解酸内酯转化液；step2：向dl-泛解酸内酯转化液中加入固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞，再进行转化得到d-泛解酸。9.根据权利要求9所述的固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞的应用，其特征在于：配制dl-泛解酸内酯缓冲液时，使用的缓冲液为50-200mm tris-hcl，ph为7.0-7.5，或者为50-200mm pipes-naoh，ph为7.-7.5；转化时的温度为30℃-35℃，转化时间为1-3h。

技术总结
一种管状固定化D-泛解酸内酯水解酶细胞的方法及其应用，以海藻酸钠、氯化钙和普朗尼克F-127为原料制备固定化载体，固定化产D-泛解酸内酯水解酶的菌体得到固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞。本发明主要使用海藻酸钠，氯化钙，普朗尼克F-127三种试剂，三种试剂均对细胞无损害，有利于转化效率及增加使用时间；固定化载体由上述三种试剂混合制作而成，形成稳定的管状结构，将细胞固定在管壁上，中空的结构使得底物可以进入载体中间，相对于传统的小球形态，增加了比表面，大大增加了底物与细胞接触面积，使得反应效率大大增加；同时管状载体也方便回收，继续后续的反应；中空管状也可以让缓冲液进入管壁中，让固定化后的细胞接触到缓冲液，为细胞的生存提供了稳定的环境，延长了固定化细胞的保存时间。长了固定化细胞的保存时间。长了固定化细胞的保存时间。


技术研发人员：陈华 周思方 常飞 涂学丰 刘杰
受保护的技术使用者：合肥学院
技术研发日：2023.07.28
技术公布日：2023/9/20