一种Vero残留DNA的检测方法及其检测试剂盒与流程

一种vero残留dna的检测方法及其检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，c12q1/00，尤其涉及一种vero残留dna的检测方法及其检测试剂盒。


背景技术：

2.在抗体或者疫苗等生物产品的生产过程中会用到vero细胞，但是vero细胞中残留的dna可能会携带并传递病毒、肿瘤等相关不良基因，在人体使用这些生物制品时对人体产生致癌的风险，所以宿主细胞dna的残留量检测已经成为了药监局对生物只要企业监管的重要内容。
3.《中国药典》公示了三种用于检测细胞中残留dna含量的方法，主要为dna探针杂交法、picogreen荧光法和qpcr法，其中qpcr法使用pcr扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反应每个循环过程中的扩增水平，得到扩增曲线；该方法通过对扩增曲线和循环阈值(ct)的分析，排除了过程中可能的干扰因素，检测准确度更高。
4.中国专利cn101565741b公开了一种实时荧光定量pcr检测vero细胞dna残留的试剂盒，该试剂盒中设计了具有特殊序列的正向引物vero-f、反向引物vero-r和寡核苷酸探针vero-p，以增加试剂盒的特异性，提高检测准确度；但是该方法的线性相关关系仍然较低。
5.此外，市面上的试剂盒其标准品的扩增效率都较低且不稳定，需要操作者在上机检测前进行pcr反应液的配置，该配置过程繁琐，很难保证不同批配置的反应液是完全一样的，给数据的可靠性带来了不利影响；因此，建立一种操作简便、测量快速、精准、检测限低、线性相关度高、特异性好、可靠性高的检测方法在临床上具有重要的意义。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种vero残留dna的检测方法，所述方法针对vero残留dna的基因组序列设计了靶多核苷酸的上游引物、下游引物和一个taqman探针，之后在pcr反应体系中循环扩增靶多核苷酸，从而实现vero残留dna的定量分析。
7.在一种优选的实施方式中，所述上游引物的序列为：5'-cctcagcacagaccctttacg-3'。
8.在一种优选的实施方式中，所述下游引物的序列为：5'-caaggtttctccccatgtgac-3'。
9.优选地，所述taqman探针的序列为：(fam)5'-caggtctttcccttcccacgaggc-3'(bhq1)；该序列中fam是指荧光端，bhq1是指荧光猝灭端。
10.进一步地，所述pcr反应体系包括：脱氧三磷酸核苷混合物、taq dna聚合酶、mg
2+
、pcr缓冲液。
11.进一步地，所述pcr反应体系中，脱氧三磷酸核苷混合物的浓度为0.15-0.6mmol/l，优选为0.22-0.4mmol/l。
12.在一种优选的实施方式中，所述pcr反应体系中脱氧三磷酸核苷混合物的浓度为0.3mmol/l。
13.进一步地，所述pcr反应体系中，taq dna聚合酶的浓度为0.002-0.006u/μl，mg
2+
的浓度为0.6-1.05mmol/l。
14.优选地，所述pcr反应体系中，taq dna聚合酶的浓度为0.003-0.0045u/μl，mg
2+
的浓度为0.8-0.98mmol/l。
15.在一种优选的实施方式中，所述pcr反应体系中，taq dna聚合酶的浓度为0.0038u/μl，mg
2+
的浓度为0.94mmol/l。
16.进一步地，所述pcr缓冲液为10
×
pcr buffer。
17.在一种优选的实施方式中，单个反应的pcr反应体系由15μlpcr反应液和5μl包含上游引物、下游引物和taqman探针的混合液所组成；所述pcr反应液为：5u/μl的taq dna聚合酶10μl、10mm的脱氧三磷酸核苷混合液400μl、25mm的mgcl2溶液500μl、10
×
pcr buffer 500μl、超纯水8.6ml。
18.进一步地，所述上游引物和下游引物在pcr反应体系中的浓度均为：0.02-0.09μmol/l；优选为0.03-0.07μmol/l；更优选为0.05μmol/l。
19.进一步地，所述taqman探针在pcr反应体系中的浓度为：0.03-1.2μmol/l；优选为0.04-0.08μmol/l；更优选为0.05μmol/l。
20.进一步地，所述循环扩增的条件为：46-53℃污染消化0.5-3min；92-97℃预变性10-40s；94-97℃处理2-5s，54-65℃处理20-40s，30-50次循环。
21.在一种优选的实施方式中，所述循环扩增的条件为：50℃污染消化2min；95℃预变性20s；95℃处理3s，60℃处理30s，40次循环。
22.其次，本技术还提供了一种基于所述检测方法的vero残留dna的检测试剂盒，所述试剂盒包括：pcr反应液、vero引物探针混合液、dna稀释液、定量参考品。
23.进一步地，所述pcr反应液由以下成分组成：5u/μl的taq dna聚合酶10μl、10mm的脱氧三磷酸核苷混合液400μl、25mm的mgcl2溶液500μl、10
×
pcr buffer 500μl、超纯水8.6ml。
24.进一步地，所述vero引物探针混合液中包括序列为：5'-cctcagcacagaccctttacg-3'的上游引物、序列为5'-caaggtttctccccatgtgac-3'的下游引物和序列为(fam)5'-caggtctttcccttcccacgaggc-3'(bhq1)的taqman探针。
25.进一步地，所述vero引物探针混合液中，所述上游引物、下游引物和taqman探针的浓度均为0.2μmol/l。
26.进一步地，所述dna稀释液为10mmol/l的tris-hcl缓冲溶液，ph为8.0。
27.进一步地，所述dna稀释液还包括0.6-1.5mmol/l的edta。
28.进一步地，所述定量参考品至少为5个浓度的vero细胞dna的标准溶液。
29.在一种优选的实施方式中，所述定量参考品为6个浓度的vero细胞dna的标准溶液，定量参考品的浓度分别为0.003pg/μl、0.03pg/μl、0.3pg/μl、3pg/μl、30pg/μl、300pg/μl。
30.进一步地，所述检测试剂盒的使用方法为：
31.(1)计算反应所需要的孔数和pcr反应体系的总量；
32.(2)配置pcr反应体系；
33.(3)分别将定量参考品、dna稀释液和待测样品加入pcr反应体系中进行循环扩增反应；
34.(4)根据结果获取样本浓度和ct值间的线性关系，计算出待测样品的dna浓度。
35.进一步地，每个样品至少做3个复孔。
36.进一步地，单个反应或单孔所需要的pcr反应体系量为20μl，单个反应或单孔的pcr反应体系具体为：15μl pcr反应液、5μlvero引物探针混合液。
37.进一步地，所述单个反应或单孔的反应容量为30μl。
38.进一步地，所述步骤(3)具体为：分别将10μl定量参考品、dna稀释液和待测样品加入20μl的pcr反应体系中进行扩增反应。
39.优选地，所述循环扩增反应条件为：50℃污染消化2min；95℃预变性20s；95℃处理3s，60℃处理30s，40次循环。
40.进一步地，循环扩增反应的效率为90-110％。
41.进一步地，所述试剂盒用于vero细胞残留的dna含量检测过程中。
42.本技术针对vero残留dna的基因组设计了具有特定序列的上游引物、下游引物和taqman探针，引物和探针具有合适的长度和碱基序列，对目标dna产生特异性识别的同时还能降低对其的结合难度、增加对其的结合速度，避免非特异性结合反应的发生；进一步限定上游引物和下游引物在pcr反应体系中的浓度为0.02-0.09μmol/l，taqman探针在pcr反应体系中的浓度为0.03-1.2μmol/l，提高扩增反应的速度，但是当探针浓度过高时不仅会增加自我复性而影响与目标dna的结合，还会增加非特异性结合而使背景增强。严格限定上游引物、下游引物和taqman探针的序列和其在反应体系中的浓度，才能使检测方法的特异性和准确性达到最佳。在此基础上进一步优化pcr反应体系中的试剂种类和浓度，增强扩增效率，使检测方法具有优异的灵敏度、检测限、可靠性等。
43.有益效果
44.1、本技术的检测方法针对vero残留dna的基因组序列设计了具有特定序列的上游引物、下游引物和taqman探针，该特殊的序列和目标dna具有特异性的结合位点，有效排除其他干扰因素(如cho细胞、e.coli细胞等的dna)对该检测结果的干扰，使本技术的检测方法具有优异的特异性；
45.2、本技术在检测方法中优化了pcr反应体系，选用了特定浓度的上游引物、下游引物、taqman探针和pcr反应液，进一步优化循环扩增反应条件，为pcr扩增反应创造了优异的反应环境，增强了测量方法的灵敏度和扩增效率，降低了方法的检测限；
46.3、本技术基于此方法设计了相应的vero残留dna的检测试剂盒，该试剂盒具有一系列的定量参考品，使用时无需稀释，也避免了使用者配置标准液的操作步骤，各试剂的稳定性优异，试剂盒具有很佳的使用便捷性、检测快速性和数据可靠性。
附图说明
47.图1：实施例2试剂盒的pcr图谱；
48.图2：实施例2试剂盒的标准曲线；
49.图3：实施例2试剂盒的标准曲线和添加了干扰物cho细胞的标准曲线对比图；
50.图4：实施例2试剂盒的标准曲线和添加了干扰物e.coli细胞的标准曲线对比图。
具体实施方式
51.实施例
52.实施例1
53.本实施例提供了一种vero残留dna的检测方法，所述方法针对vero残留dna的基因组序列设计了靶多核苷酸的上游引物、下游引物和一个taqman探针，之后在pcr反应体系中循环扩增靶多核苷酸，从而实现vero残留dna的定量分析；
54.所述上游引物的序列为：5'-cctcagcacagaccctttacg-3'，所述下游引物的序列为：5'-caaggtttctccccatgtgac-3'，所述taqman探针的序列为：5'-caggtctttcccttcccacgaggc-3'；
55.所述pcr反应体系具体包括：0.0038u/μl的taq dna聚合酶、0.94mmol/l的mg
2+
、0.3mmol/l的脱氧三磷酸核苷混合物、10
×
pcr buffer缓冲溶液、0.05μmol/l的上游引物、0.05μmol/l的下游引物和0.05μmol/l的taqman探针。
56.所述循环扩增的条件为：50℃污染消化2min；95℃预变性20s；95℃处理3s，60℃处理30s，40次循环。
57.实施例2
58.本实施例提供了一种基于实施例1的检测方法的检测试剂盒，所述试剂盒包括：pcr反应液、vero引物探针混合液、dna稀释液、6个定量参考品。
59.所述pcr反应液由以下成分组成：5u/μl的taq dna聚合酶10μl、10mm的脱氧三磷酸核苷混合液400μl、25mm的mgcl2溶液500μl、10
×
pcr buffer 500μl、超纯水8.6ml。
60.进一步地，所述vero引物探针混合液为以下组分：浓度为0.2μmol/l、序列为5'-cctcagcacagaccctttacg-3'的上游引物，浓度为0.2μmol/l、序列为5'-caaggtttctccccatgtgac-3'的下游引物，浓度为0.2μmol/l、序列为5'-caggtctttcccttcccacgaggc-3'的taqman探针。
61.所述dna稀释液为添加有edta的tris-hcl缓冲溶液(10mmol/l、ph为8.0)，dna稀释液中edta的浓度为1.0mmol/l。
62.所述6个定量参考品均为vero细胞dna的标准溶液，6个定量参考品的浓度分别为0.003pg/μl、0.03pg/μl、0.3pg/μl、3pg/μl、30pg/μl、300pg/μl。
63.所述检测试剂盒的使用方法为：
64.(1)根据以下公式计算反应所需要的孔数和pcr反应体系的总量：
65.反应孔数＝(定量参考品数量+无模板对照液数量+待测样品数量)
×
3；(此情况下每个样品做3个复孔)；
66.pcr反应体系总量＝(反应孔数+2或3)
×
20μl；(2或3指过程中的损失量)。
67.(2)配置pcr反应体系：
68.单个反应的pcr反应体系由15μl pcr反应液和5μl vero引物探针混合液混合而成。
69.(3)分别将10μl定量参考品、dna稀释液和待测样品加入20μl的pcr反应体系中进行扩增反应：
70.循环扩增的条件为：50℃污染消化2min；95℃预变性20s；95℃
71.处理3s，60℃处理30s，40次循环。
72.(4)根据结果获取样本浓度和ct值间的线性关系，计算出待测样品的dna浓度。
73.对比例1
74.与实施例2基本一致，区别在于：循环扩增的条件为：50℃污染消化2min；95℃预变性20s；93℃处理45s，60℃处理30s，40次循环。
75.对比例2
76.与实施例1基本一致，区别在于：所述pcr反应液由以下成分组成：5u/μl的taq dna聚合酶10μl、10mm的脱氧三磷酸核苷混合液400μl、25mm的mgcl2溶液200μl、10
×
pcr buffer 500μl、超纯水8.9ml。
77.性能测试方法：
78.1、标准曲线的线性：实施例2检测试剂盒的标准曲线的线性相关系数r2≥0.980，线性区间为3fg/μl-300pg/μl；扩增效率在90％-110％的区间内，阈值线交叉点间距均等，各浓度检测值cv《15％。其pcr图谱和标准曲线分别见图1和图2。该试剂盒经3次重复测量的检测结果见表1；
79.表1
[0080][0081]
对比例1和对比例2的扩增效率分别为96.915和93.531，线性相关系数分别为0.999和0.988。
[0082]
2、测试准确度——测量偏差：在测量系统线性范围内选择3pg/μl浓度的标准品，重复测定3次，测量偏差绝对值≤5％；测试结果见表2。
[0083]
表2
[0084][0085]
3、测试准确度——回收率：加标方式为：10μl定量参考品(3pg/μl)+90μl样品。三个批次的样品回收率和加标回收率均在70％-130％之间；测试结果见表3。
[0086]
表3
[0087][0088]
4、阴性参考品符合率：阴性参考品为dna稀释液，其ntc值应为undetermined或》35，测试结果见表4。
[0089]
表4
[0090][0091]
5、定量限：重复测定浓度为3fg/ml的参考物质10次后，计算其结果测量偏差及变异系数cv，cv≤20％；具体测试结果见表5。
[0092]
表5
[0093][0094]
6、精密度：检测线性范围高、低(300pg/μl、3pg/μl和3fg/μl)三个浓度样品各10次，高浓度和中浓度cv值《15％，低浓度cv值《20％；具体测试结果见表6。
[0095]
表6
[0096][0097]
7、专属性：考察生物制品生产中常用的dna对试剂盒的干扰，干扰组应与对照组重合，未见干扰。结果见图3(干扰物为cho细胞dna)和图4(干扰物为e.coli细胞dna)。
[0098]
8、耐用性——dna碎片化实验：
[0099]
(1)碎片化不同dna检测对比：
[0100]
取6支vero dna参考品，1支作为对照，余下5支分别进行不同时长的超声处理，获得一系列碎片化程度不同的dna，经过琼脂糖凝胶电泳后选3个碎片化程度区别较大的样品，分别进行稀释，检测300pg/μl，30pg/μl，3pg/μl，300fg/μl，30fg/μl，3fg/μl，获得检测值。结果表明dna的碎片化程度不会对检测结果造成影响。
[0101]
(2)碎片化dna回收实验：
[0102]
取1支碎片化最为明显的vero dna参考品，进行碎片化处理后，再用dna稀释液将此超声碎片化后的dna参考品梯度稀释成浓度分别为300pg/μl，3pg/μl，3fg/μl的3个样本，并对这3个样本进行前处理提取回收，计算回收率，所得回收率在70％-130％。
[0103]
9、稳定性验证：试剂盒在-20℃下可以稳定保存12个月，性能不受影响。

技术特征：
1.一种vero残留dna的检测方法，其特征在于，所述方法设计了靶多核苷酸的上游引物、下游引物和一个taqman探针，之后在pcr反应体系中循环扩增靶多核苷酸，从而实现vero残留dna的定量分析；所述上游引物的序列为：5'-cctcagcacagaccctttacg-3'，所述下游引物的序列为：5'-caaggtttctccccatgtgac-3'。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述taqman探针的序列为：(fam)5'-caggtctttcccttcccacgaggc-3'(bhq1)，该序列中fam是指荧光端，bhq1是指荧光猝灭端。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述pcr反应体系包括：脱氧三磷酸核苷混合物、taq dna聚合酶、mg
2+
、pcr缓冲液；所述pcr反应体系中，脱氧三磷酸核苷混合物的浓度为0.15-0.6mmol/l。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述pcr反应体系中，taq dna聚合酶的浓度为0.002-0.006u/μl，mg
2+
的浓度为0.6-1.05mmol/l。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述pcr反应体系中，taq dna聚合酶的浓度为0.003-0.0045u/μl，mg
2+
的浓度为0.8-0.98mmol/l。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物在pcr反应体系中的浓度均为：0.02-0.09μmol/l，所述taqman探针在pcr反应体系中的浓度为：0.03-1.2μmol/l。7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述循环扩增的条件为：46-53℃污染消化0.5-3min；92-97℃预变性10-40s；94-97℃处理2-5s，54-65℃处理20-40s，30-50次循环。8.一种基于权利要求1-7任一项所述的检测方法的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：pcr反应液、vero引物探针混合液、dna稀释液、定量参考品；所述pcr反应液由以下成分组成：5u/μl的taq dna聚合酶10μl、10mm的脱氧三磷酸核苷混合液400μl、25mm的mgcl2溶液500μl、10
×
pcr buffer 500μl、超纯水8.6ml。9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述vero引物探针混合液中包括序列为：5'-cctcagcacagaccctttacg-3'的上游引物、序列为5'-caaggtttctccccatgtgac-3'的下游引物和序列为(fam)5'-caggtctttcccttcccacgaggc-3'(bhq1)的taqman探针。10.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的使用方法为：(1)计算反应所需要的孔数和pcr反应体系的总量；(2)配置pcr反应体系；(3)分别将定量参考品、dna稀释液和待测样品加入pcr反应体系中进行扩增反应；(4)根据结果获取样本浓度和ct值间的线性关系，计算出待测样品的dna浓度；单个反应或单孔所需要的pcr反应体系量为20μl，单个反应或单孔的pcr反应体系具体为：15μl pcr反应液、5μl vero引物探针混合液。

技术总结
本申请提供了一种Vero残留DNA的检测方法及其检测试剂盒，所述方法针对Vero残留DNA的基因组序列设计了靶多核苷酸的上游引物、下游引物和一个TaqMan探针，之后在PCR反应体系中循环扩增靶多核苷酸，从而实现Vero残留DNA的定量分析。本申请的检测方法中优化了PCR反应体系，选用了特定浓度的上游引物、下游引物、TaqMan探针和PCR反应液，并进一步优化循环扩增反应条件，提高了扩增效率和检测方法的灵敏度、特异性和可靠性。特异性和可靠性。


技术研发人员：许金超 栗红建 张丹 李永锋 刘丽美 张伟男 蔡宇卿 郭彬彬
受保护的技术使用者：江苏谱新生物医药有限公司
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/9/20