一种用于检测前列腺癌的组合物，试剂盒及其用途的制作方法

1.本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于前列腺癌检测领域，更具体地，涉及前列腺癌基因标志物的甲基化水平的检测。


背景技术：

2.前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。globocan 2020数据显示，2020年我国前列腺癌新发病例约11.5万，占男性全部恶性肿瘤的4.7％，死亡病例约5.1万，占恶性肿瘤相关死亡的2.8％，发病率和死亡率分别位居中国男性恶性肿瘤发病和死亡的第6位和第7位。前列腺癌的病因及发病机制十分复杂，病因学研究显示前列腺癌与遗传、年龄、外源性因素(如环境因素、饮食习惯)密切相关。前列腺癌患者生存时间与初诊时临床分期紧密相关，美国前列腺癌初诊病例为临床局限性约占76％，而我国前列腺癌初诊病例以临床中晚期居多，临床局限性病例仅30％，从而导致我国前列腺癌总体预后较差。2003年-2015年间，我国前列腺癌年龄标化5年生存率从53.8％上升到66.4％，但与发达国家相比总体5年生存率仍有较大差异。美国监测、流行病学和最终结果数据库2010-2016年数据显示，临床局限性前列腺癌患者在接受标准化治疗后5年生存率接近100％。因此，对高风险人群进行筛查，及时发现早期前列腺癌患者并给予规范化治疗，是改善我国前列腺癌患者预后的重要手段。
3.目前，前列腺癌筛查方法包括：直肠指检(dre)、前列腺特异性抗原(psa)的检测、经直肠超声(trus)和多参数磁共振检查(mp-mri)等检测方法的联合诊断。直肠直检(dre)是早期检测前列腺癌的重要方法，简单、重复性好，然而很大程度上取决于医师的技能，因此不能作为前列腺癌的筛查手段。经超声引导前列腺活检是前列腺癌诊断的黄金标准，既可以获取前列腺组织样本，又可以做出病理诊断，但是具有侵入性，需要患者承受不适，同时可能伴随着感染等许多并发症，所以不适合常规筛查。近年来多参数磁共振检查在前列腺癌早筛可以提高临床有意义肿瘤的诊断，然而仍存在26％漏诊有临床意义的肿瘤，8％的患者的病灶大小被低估。目前临床上非侵入性前列腺癌检测技术是前列腺特异性抗原(psa)的检测，psa的变化反映了前列腺的功能，psa水平异常升高(大于4ng/ml)是前列腺癌变的指标，psa筛查前列腺癌的灵敏度和特异性分为57.43％和45.82％，并且存在诊断灰区(4～10ng/ml)，无法区分癌和非癌，导致过度诊断而进行不必要的穿刺活检。因此，亟待开发有效的早筛检测技术，实现前列腺癌筛查无痛无创、经济便捷、精准高效。
4.近年来，基于pcr、ngs等分子诊断技术，液体活检不断发展和突破，已成为癌症精准早筛的有力武器。从标志物的信号丰度和信号强度来看，ctdna甲基化是较为理想的检测标志物。研究表明，抑癌基因甲基化水平升高的现象通常发生在癌症初期，是肿瘤早期发展的标志性改变；而在人类基因组cpg岛中，60-80％的胞嘧啶残基被甲基化修饰，dna甲基化已成为癌症早筛中普遍而丰富的信号来源；此外，不同癌症类型有其独特的dna甲基化模式，器官特异性强，可实现组织溯源。因此，ctdna甲基化是国内外早筛企业采用的主流检测指标。
5.本领域亟需一种更有效的前列腺癌诊断产品，使得前列腺癌早期诊断兼具高灵敏度高特异性，且无创、快速。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供一种用于检测前列腺癌的组合物，所述组合物包括检测以下区域中的甲基化水平的检测试剂：
7.gstp1基因中如seq id no:1所示的区域；
8.rassf1a基因中如seq id no:2所示的区域；以及
9.prkcb基因中如seq id no:3所示的区域。
10.gstp1基因中如seq id no:1所示的区域、rassf1a基因中如seq idno:2所示的区域，以及prkcb基因中如seq id no:3所示的区域为各自基因区域的cpg岛的一段序列。
11.具体地，gstp1(genbank登录号：ng_012075.1)基因的seq id no:1区域如下所示：
12.tcgctgcgcacacttcgctgcggtcctcttcctgctgtctgtttactccctaggccccgctggggacctgggaaagagggaaaggcttccccggccagctgcgcggcgactccggggactccagggcgcccctctgcggccgacgcccggggtgcagcggccgccggggctggggccggcgggagtccgcgggaccctccagaagagcggccggcgccgtgactcagcactggggcggagcggggcgggaccacccttataaggctcggaggccgcgaggccttcgctggagtttcgccgccgcagtcttcgccaccagtgagtacgcgcggcccgcgtccccggggatg；
13.rassf1a(genbank登录号：dq444319.1)基因的seq id no:2区域如下所示：
14.ggccccacagtccctgcacccaggtttccattgcgcggctctcctcagctccttcccgccgcccagtctggatcctgggggaggcgctgaagtcggggcccgccctgtggccccgcccggcccgcgcttgctagcgcccaaagccagcgaagcacgggcccaaccgggccatgtcgggggagcctgagctcattgagctgcgggagctggcacccgctgggcgcgctgggaagggccgcacccggctggagcgtgccaacgcgctgcgcatcgcgcggggcaccgcgtgcaaccccacacggcagctggtccctggccgtggccaccgcttccagcccgcggggcccgcc；
15.prkcb(genbank登录号：ng_029003.2)基因的seq id no:3区域如下所示：
16.tcgctcctcccctgggcacatctcctgaacgcagccccgggggccgaggacggggtggggtggggggcgaggctcgggtccgacgaccccgggctgcggtcccggcgctgcagagctgcggctgtgcacgcttagccgcgaggcccgcggtagcccgggcgccgatatgtaaagcagctggcagcgctgggcggggcctgggcgcgatgcaaatgaggagggcggggctggcccggggctccgcc
17.tccctcccccgcagctggggccagcggtgccaagcgcagctggacgagc
18.ggcagcagctgggcgagtgacagccccggctccgcgcgccgcggccgccagagccg。
19.使用本发明的组合物，对前列腺癌癌组织样本检测的灵敏度达到了97.22％；本发明试剂组合以较少的标志物就能够在临床上以高灵敏度对前列腺癌进行检测，成本和时间均得到节约；在临床上，在前列腺癌恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。
20.在本发明中，“cpg岛”是胞嘧啶(c)-磷酸(p)-鸟嘌呤(g)的缩写，指的是基因组上富含cpg二核苷酸的一些区域，长度为300～3000bp。
21.在一些实施方案中，使用本发明的检测试剂，可以对样本中所存在的相应基因上的cpg岛或者cpg岛上的一段序列的甲基化水平进行检测。
22.在本发明中，“样本”为选自个体的生物样本。具体地，例如，选自组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、尿液、尿上清，或其组合。
23.优选地，本发明的“样本”为尿液，即尿液中的游离dna。
24.尿液中的游离dna能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在尿液中的含量极低，因此，存在灵敏度较低的问题。使用本发明的检测试剂，能够使用尿液中的游离dna作为样本，能够在临床上以88.16％的灵敏度，95.00％的特异性进行检测。
25.在本发明中，“检测试剂”指的是对样本中的基因的甲基化水平进行检测的试剂。其中，所述甲基化水平是通过扩增-测序、芯片检测、甲基化荧光定量pcr的方式测量。
26.在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂也可以是检测基因片段的平均甲基化水平的检测试剂。
27.在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂还可以是检测基因区段内的一个或多个甲基化位点的检测试剂。
28.在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物、测序tag序列，用于通过扩增-测序测量甲基化水平。
29.在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于芯片，所述芯片是甲基化芯片，所述甲基化芯片具有与甲基化区域特异性结合的探针。所述芯片可以是包括但不限于例如安捷伦的human cpg island microarrays和human dna methylation microarrays、illumina的infinium humanmethylation27 beadchip、infinium humanmethylation450 beadchip和goldengate methylation assay以及roche nimblegen的human dnamethylation 2.1m deluxe promoter array、human dnamethylation array等，用于通过芯片测量甲基化水平。
30.在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物以及核酸探针，用于通过甲基化荧光定量pcr测量甲基化水平。
31.进一步地，所述检测试剂还包括内标引物以及内标探针。
32.在一个具体的实施方案中，内标引物和探针的靶标为β-actin基因。
33.在一个优选的实施方案中，内标引物和探针的靶标为β-actin基因的如seq id no:4所示的区域。
34.β-actin基因(gene bank登录号：ng_007992.1)的seq id no:4区域如下所示：
35.cccccaaagttcacaatgtggccgaggactttgattgcacattgttgtttt
36.tttaatagtcattccaaatatgagatgcgttgttacaggaagtcccttgcc
37.atcctaaaagccaccccacttctctctaaggagaatggcccagtcctctc
38.ccaagtccacacaggggaggtgatagcattgctttcgtgtaaattatgtaa
39.tgcaaaatttttttaatcttcgccttaatacttttttattttgttttattttgaa。
40.当所述检测试剂包括核酸引物以及核酸探针时，所述检测试剂通过甲基化荧光定量pcr对样本中核酸的甲基化水平进行检测。
41.在本发明中，“甲基化荧光定量pcr”是指将待检测区域通过亚硫酸盐转化或甲基化敏感性限制性内切酶酶切，再使用针对检测靶标特异性设计的引物和探针进行荧光定量pcr检测，从而得出所述待检测区域的甲基化水平。
42.上述试剂组合还可以包括其余的试剂，具体地，例如，各种对样本进行前处理或者预处理所需要的试剂。例如，提取样本核酸的样本释放剂，纯化样本核酸的纯化剂，转化所
用的重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐等。
43.在一些具体的实施方案中，所述检测试剂为表1所示：
44.表1
45.引物名称编号序列(5
’‑3’
)pc-gstp1-fseq id no:5gctggggacctgggaaagagpc-gstp1-rseq id no:6ggccgctcttctggagggtcpc-gstp1-pseq id no:7agctgcgcggcgactccggggapc-rassf1a-fseq id no:8tgagctgcgggagctggcpc-rassf1a-rseq id no:9agctgccgtgtggggttgcpc-rassf1a-pseq id no:10cgctgggaagggccgcaccpc-prkcb-fseq id no:11acgcttagccgcgaggccpc-prkcb-rseq id no:12cccgccctcctcatttgcatpc-prkcb-pseq id no:13ccgatatgtaaagcagctggcagcgme-actin-fseq id no:14gttgttacaggaagtcccttgccme-actin-rseq id no:15gcaatgctatcacctcccctgtgme-actin-pseq id no:16cttgggagaggactgggccattctcc
46.在一些具体的实施方案中，所述检测试剂如表2所示：
47.表2
48.引物名称编号序列(5
’‑3’
)pc-gstp1-fseq id no:17actccggggactccagggcpc-gstp1-rseq id no:18cgagccttataagggtggtccpc-gstp1-pseq id no:19ccccagtgctgagtcacggcgcpc-rassf1a-fseq id no:20atgtcgggggagcctgagcpc-rassf1a-rseq id no:21ttgcacgcggtgccccpc-rassf1a-pseq id no:22ttgagctgcgggagctggcacpc-prkcb-fseq id no:23agagctgcggctgtgcacgpc-prkcb-rseq id no:24ccgccctcctcatttgcatpc-prkcb-pseq id no:25tagcccgggcgccgatatgtaaagcme-actin-fseq id no:14gttgttacaggaagtcccttgccme-actin-rseq id no:15gcaatgctatcacctcccctgtgme-actin-pseq id no:16cttgggagaggactgggccattctcc
49.在一些具体的实施方案中，本发明所采取的4个荧光通道分别为fam、rox、hex及cy5通道，但实际运用当中并不仅限于此，可以是其他任何荧光通道的组合；同时不同的靶标也可以对应不同的荧光通道，如可以采用任何一个荧光通道作为内标检测通道。
50.使用该优选的实施方案，相比检测靶标其他区域的引物和探针组合物，其检测的灵敏度和特异性分别提高了10％左右，所以，使用该优选的组合物在临床上能够以更高的灵敏度和更好的特异性检测早期前列腺癌，使得早期前列腺癌的检测准确率进一步提升。
51.第二方面，本发明提供了上述试剂组合在制备用于检测前列腺癌的试剂盒中的用途。
52.进一步地，本发明提供了上述试剂组合在制备使用尿液游离dna检测前列腺癌的试剂盒中的用途。
53.第三方面，本发明提供了一种用于检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的试剂组合。进一步地，所述试剂盒还包括但不限于提取核酸的试剂、纯化核酸的试剂、重亚硫酸盐中的至少一种。
54.进一步地，所述试剂盒还包括阴性样本。
55.具体地，阴性样本是经测序验证无目标基因甲基化的人基因组dna。
56.进一步地，所述提取核酸的试剂是提取组织dna的试剂和尿液游离dna的试剂。
57.进一步地，所述提取核酸的试剂是提取尿液游离dna的试剂。
58.进一步地，所述试剂盒还包括dntps、mg
2+
、甲基化敏感限制性内切酶、pcr缓冲液、热启动酶中的至少一种。
59.进一步地，所述甲基化敏感限制性内切酶包括hpaii和hinp1i中的至少一种。
60.进一步地，各组分终浓度的范围如下所示：mg
2+
1～6mm、dntps 1～80mm、甲基化敏感限制性内切酶0.01～30u、引物0.1～40μm、探针0.1～20μm。
附图说明
61.图1为本发明组合物在0.05ng/反应中甲基化的检测；
62.图2为本发明组合物在200ng/反应的非甲基化dna中无非特异扩增的检测；
63.图3为本发明组合物检测前列腺癌组织和癌旁组织的检测结果。
具体实施方式
64.下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
65.实施例1、甲基化基因的筛选
66.本发明从ucsc xena网站的tcga数据集(https://tcga.xenahubs.net)和美国国立生物技术信息中心(ncbi)的geo数据库中收集肿瘤甲基化检测数据。以前列腺癌和对照数据进行差异分析，对差异位点进行物理位置和基因信息注释，为保证筛选片段具有一致的甲基化水平，甲基化基因片段的筛选需要同时符合以下几点要求：1)要求所选基因片段具有不少于2个位点具有较为一致的甲基化水平；2)以前列腺癌和癌旁组织或正常对照组织进行差异分析，挑选前列腺癌样品中一致性高且与癌旁或正常组织存在高差异的甲基化基因片段；3)以前列腺癌和健康样本尿液甲基化检测数据进行差异分析，挑选两者甲基化显著差异的基因片段；4)最后再从满足上述3点的区段中进行逐个基因甲基化性能分析，从而得出候选甲基化基因。
67.最根据组织样品数据建模分析，确定了以gstp1、rassf1a、prkcb三个基因选定cpg岛区域为最佳组合的检测靶标，并进一步验证组合在尿液游离dna中检测前列腺癌的模型和性能。
68.实施例2、标准品的基因甲基化水平检测
69.阳性样本：标准甲基化人基因组dna和目标基因非甲基化人基因组dna混合配置而
成，浓度为1ng/μl含10％标准甲基化人基因组dna；浓度为1ng/μl含1％标准甲基化人基因组dna；浓度为1ng/μl含0.5％标准甲基化人基因组dna；
70.阴性样本：经测序验证无目标基因甲基化的人基因组dna，20ng/μl；
71.甲基化敏感型性限制性内切酶：包括hpaii、hinp1i；
72.检测流程：
73.pcr体系配置：按照下表3的试剂配方配制pcr反应液
74.表3
75.试剂组分单人份用量(μl)pc-gstp1-f(50μm)0.2pc-gstp1-r(50μm)0.2pc-gstp1-p(50μm)0.1pc-rassf1a-f(50μm)0.2pc-rassf1a-r(50μm)0.2pc-rassf1a-p(50μm)0.1pc-prkcb-f(50μm)0.2pc-prkcb-r(50μm)0.2pc-prkcb-p(50μm)0.1me-actin-f(50μm)0.2me-actin-r(50μm)0.2me-actin-p(50μm)0.1pcr扩增buffer(s10)32.3mg离子(1m)0.2dntps(80mm)1.5甲基化敏感限制性内切酶mix(10u/μl)2热启动酶(10u/μl)2
76.将样本按照10μl/反应加入到pcr反应管，然后依次加入40μl pcr反应液，盖上pcr管盖，震荡混匀后，瞬时离心5s。
77.荧光pcr反应与结果分析
78.1)将pcr反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
79.2)荧光检测通道选择：选择fam通道(reportere:fam,quencher:none)检测gstp1；选择rox通道(reportere:rox,quencher:none)检测rassf1a；选择hex通道(reportere:hex,quencher:none)检测prkcb；选择cy5通道(reportere:cy5,quencher:none)作为内标检测管家基因β-actin；
80.3)荧光定量pcr反应条件为表4：
81.表4
82.[0083][0084]
4)结果分析
[0085]
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，扩增曲线与阈值线的交点，称为ct(即cycle threshold，指pcr反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)。标准品扩增曲线如图1～2所示，本发明所提供的检测试剂0.05ng/反应(图1)，在200ng/反应的非甲基化dna中无非特异扩增(图2)。
[0086]
实施例3、前列腺癌癌组织和癌旁组织检测
[0087]
收集20例前列腺癌癌组织和20例癌旁组织石蜡切片样本。
[0088]
采用圣湘生物s1008核酸提取试剂盒对石蜡组织样本进行提取；按照实施例2的流程，在同一反应管中进行核酸样本酶切处理及pcr扩增检测。按照以下方式进行临床结果的判读：根据内标基因β-actin的ct值判断实验结果是否满足质控要求，若ct值》27，则不纳入结果统计；根据检测试剂最低检出限，设置gstp1、rassf1a、prkcb三个靶标基因的阳性判断ct值为32。表5为40例样本荧光定量pcr检测结果ct值，20例前列腺癌癌组织样本(t001-t020)检测结果均为阳性，20例癌旁组织样本(n001-n020)检测结果均为阴性，表明gstp1、rassf1a、prkcb三个靶标基因在前列腺癌癌组织中基因表达水平高于癌旁组织(图3)。
[0089]
表5、40例样本荧光定量pcr检测结果ct值
[0090][0091]
[0092]
注：“un”表示基因无扩增，无ct值。
[0093]
实施例4、本发明组合物检测临床样本的结果
[0094]
收集136例临床尿液样本，其中前列腺癌患者尿液样本76例，健康人尿液样本30例，其他癌症患者尿液样本30例(包括肝癌8例，胃癌13例，膀胱癌9例)；同时也收集了72例前列腺癌患者癌组织石蜡切片样本。
[0095]
采用血浆游离dna提取试剂盒(同样适用于尿液游离dna提取)对尿液游离dna进行提取；按照实施例3，采用圣湘生物s1008核酸提取试剂盒对石蜡组织样本进行提取；按照实施例2的流程，在同一反应管中进行核酸样本酶切处理及pcr扩增检测。按照实施例3判读方式进行判读。本试剂盒在尿液样本中检测灵敏度和特异性分别为88.16％和95.00％，组织样本中的检测灵敏度为97.22％，具体如下表6。
[0096]
表6
[0097][0098]
组织样本检测灵敏度(％)＝阳性检出数/阳性病例总数*100％＝97.22％；
[0099]
尿液样本检测灵敏度(％)＝阳性检出数/阳性病例总数*100％＝88.16％；
[0100]
尿液样本检测特异性(％)＝阴性检出总数/阴性样本总数*100％＝95.00％；
[0101]
癌种特异性(％)＝非前列腺癌癌症患者阴性检出数/非前列腺癌癌症患者总数*100％＝93.33％，
[0102]
其中阴性样本为所有非前列腺癌患者样本综合。
[0103]
综上所述，采用gstp1、rassf1a、prkcb三靶标组合标志物对前列腺癌癌组织样本检测的灵敏度为97.22％，说明这三个检测靶标是前列腺癌组织特异性甲基化基因，与前列腺癌密切相关；采用本发明的靶标组合标志物对非前列腺癌患者尿液样本进行检测，特异性达到93.33％，说明这一检测体系具有良好的癌种特异性；采用本发明的靶标组合标志物对前列腺癌患者尿液样本的检测灵敏度达到88.16％，特异性达到95.00％。
[0104]
实施例5本发明基因区域另一组合物检测临床样本的结果
[0105]
采用实施例4中收集到的临床样本，使用表2的组合物，按照实施例4所述方法进行检测，检测灵敏度和特异性分别为89.47％和95％，组织样本中的检测灵敏度为95.83％，具体如表7所示。
[0106]
表7
[0107][0108]
实施例6、本发明对比例组合物检测临床样本的结果
[0109]
收集136例临床尿液样本，其中前列腺癌患者尿液样本76例，健康人尿液样本30例，其他癌症患者尿液样本30例(包括肝癌8例，胃癌13例，膀胱癌9例)；同时也收集了72例前列腺癌患者癌组织石蜡切片样本。
[0110]
根据实施例4中收集到的临床样本，采用血浆游离dna提取试剂盒(同样适用于尿液游离dna提取)对尿液游离dna进行提取；采用圣湘生物s1008核酸提取试剂盒对石蜡组织样本进行提取；按照实施例2的流程，使用表8所示组合物在同一反应管中进行核酸样本酶切处理及pcr扩增检测。本试剂盒在尿液样本中检测灵敏度和特异性分别为84.72％和78.95％，组织样本中的检测灵敏度为84.72％，具体检测结果如下表9所示。
[0111]
表8
[0112]
引物/探针编号序列(5
’‑3’
)pc-gstp1-fseq id no:26acgtccccagtgccgttagcpc-gstp1-rseq id no:27ggcactgcagcgaacaaagaapc-gstp1-pseq id no:28tgctggagcccgggggaggatpc-rassf1a-fseq id no:29tggtgcgacctctgtggcgpc-rassf1a-rseq id no:30ctgccgcgacttgacccgpc-rassf1a-pseq id no:31tcgtgcgcaaaggcctgcagtgpc-prkcb-fseq id no:32aagatggctgacccggctgpc-prkcb-rseq id no:33aagaagcgggcggtgaattpc-prkcb-pseq id no:34agcgagggcgaggagagcaccg
[0113]
gstp1检测序列(如seq id no:35所示的区域)如下所示：
[0114]
ggctcagagctcccagcatggggccaacccgcagcatcaggcccgggctcccggcagggctcctcgcccacctcgagacccgggacgggggcctaggggacccaggacgtccccagtgccgttagcggctttcagggggcccggagcgcctcggggagggatgggaccccgggggcggggagggggggcagactgcgctcaccgcgccttggcatcctcccccgggctccagcaaacttttctttgttcgctgcagtgccgccctacaccgtggtctatttcccagttcgaggtaggagcatgtgtctggcagggaagggaggcaggggctggggctgcagcccacagcc；
[0115]
rassf1a检测序列(如seq id no:36所示的区域)如下所示：
[0116]
acgcacacgtggtgcgacctctgtggcgacttcatctggggcgtcgtgcgcaaaggcctgcagtgcgcgcgtgagtagtggccccgcgcgcctacgagagcggaaggggcagccaaggggcagcgcagtcgccgcgggtcaagtcgcggcagagggggtcggcggggacagctcccgaggactaggtccgttactttcgccccatcgctgaagagtgcgcgaaaatggtttatcccttgtcgcactccactcgtatctgggccacagatgagcagaggtggctgcttatatgtaaa
aatacgctgattttaagtttcttatctttaaaatgccttggcccttcttgagaa；
[0117]
prkcb检测序列(如seq id no:37所示的区域)如下所示：
[0118]
ccgcagcccgcggtcccgcggccccggggccggcacctctcgggctccggctccccgcgcgcaagatggctgacccggctgcggggccgccgccgagcgagggcgaggagagcaccgtgcgcttcgcccgcaaaggcgccctccggcagaagaacgtgcatgaggtcaagaaccacaaattcaccgcccgcttcttcaagcagcccaccttctgcagccactgcaccgacttcatctggtgagcgcgcgcgcgcagggcaccttcccgggcccccgagggcagcgccgcgccagggaccccctctccgcgccctctgcgccctccgcgccctccgcaccctgggaccccg；
[0119]
表9
[0120][0121]
实施例6、其余基因检测样本的结果
[0122]
对四个靶标gstp1、rassf1a、adamts12、prkcb构建三靶标联合检测体系，并对组合进行前列腺癌临床尿液样本中灵敏度测试和健康人尿液样本中特异性测试(表10)，最终筛选出以gstp1、rassf1a、prkcb为最优检测体系。
[0123]
表10
[0124][0125]

技术特征：
1.一种用于检测前列腺癌的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测以下区域中至少两个的甲基化水平的检测试剂：gstp1基因中如seq id no:1所示的区域；rassf1a基因中如seq id no:2所示的区域；以及prkcb基因中如seq id no:3所示的区域。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述检测试剂为扩增-测序、芯片检测，或甲基化荧光定量pcr检测甲基化水平中所使用的检测试剂。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述检测试剂为核酸引物、测序tag序列、甲基化芯片、核酸探针中的任意一种或多种。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述检测试剂为核酸引物和核酸探针。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述核酸引物和核酸探针为：seq id no:5～13或seq id no:17～25所示的核酸引物和探针。6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述检测试剂还包括用于监测的内标上游引物、内标下游引物以及内标探针。7.权利要求1～6中任一项所述组合物在制备用于检测前列腺癌的试剂盒中的用途。8.一种用于检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～6中任一项所述组合物。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dntps、mg
2+
、甲基化敏感限制性内切酶、pcr缓冲液、热启动酶中的至少一种。10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述甲基化敏感限制性内切酶包括hpaii和hinp1i中的至少一种。

技术总结
本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及前列腺癌检测领域。本发明提供了一种用于检测前列腺癌的组合物，包括用于检测以下区域的甲基化水平的检测试剂：GSTP1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；RASSF1A基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；以及PRKCB基因中如SEQ ID NO:3所示的区域。同时，还提供了包括该组合物的试剂盒和所述组合物的用途，使用所述组合物和试剂盒能够在临床上以高灵敏度和好特异性对前列腺癌进行检测。对前列腺癌进行检测。对前列腺癌进行检测。


技术研发人员：刘丽亚 高堂杰 罗诗雅 吴康 戴立忠
受保护的技术使用者：圣湘生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.08.02
技术公布日：2023/9/20