一株发酵粘液乳杆菌ZF621及其应用的制作方法

一株发酵粘液乳杆菌zf621及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株发酵粘液乳杆菌zf621及其应用。


背景技术：

2.果蔬原料因含有丰富的营养物质，水分含量高，存在不易储存，容易腐败的问题，因而提高其加工水平，研究果蔬的深加工尤为重要。采用乳酸菌发酵是果蔬深加工的重要途径之一，常见的果蔬乳酸菌发酵制品主要包括泡菜腌菜类和果蔬汁饮料。
3.乳酸菌发酵果蔬汁是将果汁、蔬菜汁以单一或复配形式作为原料，经过灭菌后接种单一乳酸菌或与醋酸菌、酵母菌等混菌发酵，制成的一类饮料产品。作为一种绿色果蔬加工方式，乳酸菌发酵不仅可以赋予果蔬汁产品独特的风味，还可以转化基质中的营养物质，提高产品生物活性，具有广阔的市场前景。但是因为果蔬汁含有丰富的营养物质，其生产、加工、储藏及运输过程中容易出现变质的问题。霉菌是引起乳制品、肉制品、谷物类食品及果蔬腐败变质的重要因素之一，导致其外观状态、气味色泽及营养价值的改变，影响食品的货架期。
4.富马酸主要用于肉制品、鱼肉制品加工等，可作为酸度调节剂、酸化剂、抗氧化助剂、腌制促进剂、香料使用，对抑菌防霉有重要作用，有助于制品的保存期。目前还没有富马酸应用在果蔬汁中的报道，高产富马酸的乳酸菌通过发酵果蔬原料提高果蔬汁中富马酸含量，提升果蔬汁防腐能力，在果蔬汁发酵中具有很广阔应用前景。


技术实现要素：

5.基于以上技术问题，本发明的主要目的在于克服上述背景技术的不足之处，提供一株发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)zf621，该菌株应用于果蔬汁发酵，在不改变现有工艺的基础上，提高发酵产物中富马酸的含量，对霉菌产生良好的抑制作用，提升果蔬汁防腐能力，可以延长货架期，同时还能提高果蔬汁香气以及口感。
6.为实现上述目的，发明人进行了深入研究，并经重复多次研究论证而完成获得本发明方案，具体如下：
7.第一方面，本发明提供了一株发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)zf621，其特征在于，已于2023年4月18日保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:63366。
8.分离筛选得到的发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)zf621在固mrs平板培养基上菌落呈现乳白色，直径3mm-5mm，菌落凸起、呈圆形，表面光滑，边缘整齐。
9.第二方面，本发明提供了一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包含上述的发酵粘液乳杆菌zf621。
10.第三方面，本发明提供了上述发酵粘液乳杆菌zf621或发酵菌剂在食品发酵中的应用。
11.进一步地，所述的应用为用于果蔬汁的发酵。
12.进一步地，所述的应用为在果蔬汁发酵过程中提高富马酸含量中的应用。
13.第四方面，本发明提供了一种发酵果蔬汁的制备方法，其特征在于，所述方法为在果蔬汁中添加上述发酵粘液乳杆菌zf621或发酵菌剂进行发酵的方法。
14.进一步地，所述发酵粘液乳杆菌zf621的添加量为105～106cfu/ml。
15.进一步地，所述发酵时间为12-72h。
16.第五方面，本发明提供了一种发酵果蔬汁，其特征在于，所述发酵果蔬汁由本发明所述的制备方法制得。
17.第六方面，本发明提供了一种抑菌制剂，其特征在于，所述抑菌制剂包括上述发酵粘液乳杆菌zf621。
18.本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
19.1、本发明提供的发酵粘液乳杆菌zf621，应用于果蔬汁发酵，在不改变现有工艺的基础上，提高果蔬汁发酵产物中富马酸的含量，对霉菌产生良好的抑制作用，提升果蔬汁防腐能力，可以延长货架期。
20.2、本发明提供的发酵粘液乳杆菌zf621，用于果蔬汁发酵时能提高果蔬汁香气以及口感，发酵后的果蔬汁中不会有异味，后期还可以与其它果汁调配使用，即提高了果蔬汁的品质，又保留了果蔬汁的浓郁风味。
附图说明
21.图1为发酵粘液乳杆菌zf621菌落形态图；
22.图2为发酵粘液乳杆菌zf621显微镜下形态图；
23.图3为发酵粘液乳杆菌zf621抑制霉菌结果示意图；
24.图4为发酵苹果汁中检测出的富马酸与标准品的结果图；
25.本发明提供的发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)zf621，已于2023年4月18日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no:63366；该菌株于2023年4月18日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2023年4月18日检测为存活菌株。
具体实施方式
26.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
27.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
28.除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规食品级试剂、方法和设备。
29.本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
30.实施例1目的菌株的筛选
31.1.原材料的处理
32.取传统工艺条件下发酵的咸腌菜，加工成浆状，加入无菌生理盐水逐级10倍梯度稀释至10-1-10-6
，制成菌体稀释液，随后分别从各浓度稀释液中取0.1ml均匀涂布于mrs(含0.015％溴甲酚紫)固体培养基平皿上，37℃培养48h，挑选菌落呈现黄色、菌落凸起、表面光滑、菌落边缘整齐的单菌落，接入mrs液体培养基中，37℃培养。
33.2.菌株初筛
34.将第一步所培养的菌液在mrs固体培养基上划线进行二次纯化，挑取9个单菌落，编号fj081～fj089分别接种于液体mrs培养基中活化，活化温度37℃，培养24h。将活化后的菌液分别接种于苹果汁(nfc苹果汁与水以2：1(w/w)混合)中，接种浓度105cfu/ml，37℃条件下，静置发酵。
35.发酵72h时，从各罐中取样进行常规理化指标检测，采用超高压液相(uhplc)方法，检测发酵液中总酸和富马酸的含量，流动相：0.2％磷酸水，色谱柱：capcell pak adme-hr s5，流速0.2ml/min。检测结果如表1所示：
36.表1发酵苹果汁检测结果
37.菌株名称总酸(mg/l)富马酸(mg/100ml)fj081209.848.9fj08287.5-fj083224.6-fj084197.858.2fj085163.3-fj086128.8-fj08782.2-fj088222.650.5fj089166.71.41
38.由表1结果可知，编号fj 081、fj084、fj088菌株发酵的苹果汁中富马酸含量较高，选取这三株菌进行复筛。
39.3.乳酸菌复筛
40.将初筛选出的株乳酸菌fj081、fj084、fj088，重新活化培养，接于苹果汁中发酵，接种浓度105cfu/ml，温度37℃，发酵72h。发酵结束后，取各组苹果汁进行感官评价，结果如表2所示：
41.表2发酵苹果汁感官分析结果
[0042][0043][0044]
备注：各项指标满分为100分，得分越高表示结果越好。
[0045]
由表2结果可知，fj084感官评价结果最好，作为复筛目标菌株，该菌株在固mrs平板培养基上的形态观察如图1所示，菌落直径3mm-5mm，菌落呈现乳白色，菌落凸起、呈圆形，表面光滑，菌落边缘整齐。革兰氏染色后至显微镜下观察，结果如图2所示。
[0046]
将上述筛选得到fj084菌株进行16s rdna测序鉴定，经过对比分析，本发明的菌种所测得的16s区序列与发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)相似度达到99.93％，可确定该菌种为一株发酵粘液乳杆菌，可应用于食品发酵工业，将其命名为发酵粘液乳杆菌zf621，于2023年4月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:63366。
[0047]
实施例2发酵粘液乳杆菌zf621的遗传稳定性检测
[0048]
将实施例1中的发酵粘液乳杆菌zf621在mrs培养基上连续传代10代，分别将第1代、第5代、第10代培养菌种接种至苹果汁中发酵，接种浓度105cfu/ml，温度37℃，发酵72h。发酵结束后，按照实施1中的方法检测所发酵苹果汁中总酸和富马酸含量并进行感官评价，以判断其传稳定性，具体数据见表3：
[0049]
表3传代稳定性测试检测结果
[0050]
代传次数生长情况总酸含量(mg/l)富马酸(mg/100ml)zf621第1代菌落特征正常215.1
±
6.3262.8
±
9.34zf621第5代菌落特征正常208.8
±
10.7466.3
±
5.63zf621第10代菌落特征正常218.7
±
4.5765.7
±
4.49
[0051]
由表3结果可知，不同代数发酵粘液乳杆菌zf621菌株的菌落特征均正常，发酵液中富马酸含量变化在10％范围内，菌株遗传稳定性好，符合生产使用要求。
[0052]
实施例3发酵粘液乳杆菌zf621菌株抑制霉菌测试
[0053]
将发酵粘液乳杆菌zf621接种至苹果汁中，接种浓度为105cfu/ml，放在37℃发酵。在发酵6h、12h、24h时分别取一定量发酵苹果汁进行高温灭菌，然后接种1
×
103cfu/ml的青霉菌，放30℃培养48h，观察青霉菌的生产情况，用以检测发酵粘液乳杆菌zf621抑制霉菌的效果，结果如图3所示。
[0054]
由图3结果可知，接种发酵粘液乳杆菌zf621发酵12h时，已经能达到明显抑制霉菌的效果。取发酵12h的苹果汁，按照实施1中的方法检测发酵苹果汁中富马酸含量，结果如图4所示。此时取样检测的发酵苹果汁中富马酸的含量为210.5
±
10.2mg/l，也说明苹果汁中含有此浓度的富马酸即可起到明显的抑制霉菌的作用。
[0055]
实施例4发酵粘液乳杆菌zf621发酵苹果汁
[0056]
将发酵粘液乳杆菌zf621以终浓度为10
4-108cfu/ml的剂量添加在苹果汁中作为实验组，另取一组苹果汁接种10
4-108cfu/ml fj082作为对照组，两组同时放在37℃发酵12h。
[0057]
发酵结束后按照实施1中的方法检测所发酵苹果汁中总酸和富马酸含量，结果记录在表4中；同时请专业鉴评师对发酵苹果汁进行感官评价，结果记录在表5中。
[0058]
表4.发酵苹果汁中总酸和富马酸含量检测结果
[0059][0060]
表5发酵苹果汁感官评价结果
[0061][0062][0063]
注：每项评定满分10分，以0.5为评分间隔，综合评分为各项总和值。
[0064]
由表4和表5结果可知，在苹果汁中接种发酵粘液乳杆菌zf621，可显著增加发酵苹果汁中富马酸的含量，且接种量越多，富马酸的含量越高；但是发酵粘液乳杆菌zf621接种浓度过高会对苹果汁香气、甜味、酸味产生影响，最适宜的接种浓度为10
5-106cfu/ml，该浓度既能产生足够的富马酸，又能提高苹果汁的风味和口感。
[0065]
实施例5发酵粘液乳杆菌zf621发酵番茄浆
[0066]
将发酵粘液乳杆菌zf621以终浓度为106cfu/ml的剂量添加在番茄浆(番茄酱与水以2：1(w/w)混合)中作为实验组，另取一组番茄浆接种相同浓度的fj082作为对照组，两组同时放在37℃发酵12h。
[0067]
发酵结束后按照实施1中的方法检测所发酵番茄浆中总酸和富马酸含量，同时请专业鉴评师对发酵番茄浆进行感官评价，结果记录在表6中。
[0068]
表6发酵番茄浆中富马酸含量及感官评价结果
[0069][0070]
注：感官评价每项评定满分10分，以0.5为评分间隔，综合评分为各项总和值。
[0071]
由表6结果可知，在番茄浆中接种106cfu/ml发酵粘液乳杆菌zf621，可显著增加发酵番茄浆中富马酸的含量，且可以达到抑制霉菌所需的浓度；此外还可以改善番茄浆的感官水平，增加番茄香气，提高番茄浆的风味和口感，使其番茄香气四溢、风味酸甜可口。
[0072]
实施例6发酵粘液乳杆菌zf621发酵辣椒浆
[0073]
将发酵粘液乳杆菌zf621以终浓度为106cfu/ml的剂量添加在辣椒浆(辣椒酱与水以4：1(w/w)混合)中作为实验组，另取一组辣椒浆接种相同浓度的fj082作为对照组，两组同时放在37℃发酵12h。
[0074]
发酵结束后按照实施1中的方法检测所发酵辣椒浆中总酸和富马酸含量，同时请专业鉴评师对发酵辣椒浆进行感官评价，结果记录在表7中。
[0075]
表7发酵辣椒浆中富马酸含量及感官评价结果
[0076][0077]
注：感官评价每项评定满分10分，以0.5为评分间隔，综合评分为各项总和值。
[0078]
由表7结果可知，在辣椒浆中接种106cfu/ml发酵粘液乳杆菌zf621，可显著增加发酵辣椒浆中富马酸的含量，且可以达到抑制霉菌所需的浓度；此外还可以改善辣椒浆的感官水平，增加辣椒浆的香气，提高辣椒浆的风味和口感，使辣椒浆酸辣可口。
[0079]
实施例7发酵粘液乳杆菌zf621发酵芒果汁
[0080]
将发酵粘液乳杆菌zf621以终浓度为106cfu/ml的剂量添加在芒果汁(nfc芒果汁与水以2：1(w/w)混合)中作为实验组，另取一组芒果汁接种相同浓度的fj082作为对照组，两组同时放在37℃发酵12h。
[0081]
发酵结束后按照实施1中的方法检测所发酵芒果汁中总酸和富马酸含量，同时请专业鉴评师对发酵芒果汁进行感官评价，结果记录在表8中。
[0082]
表8发酵芒果汁中富马酸含量及感官评价结果
[0083][0084]
注：感官评价每项评定满分10分，以0.5为评分间隔，综合评分为各项总和值。
[0085]
由表8结果可知，在辣椒浆中接种106cfu/ml发酵粘液乳杆菌zf621，可显著增加发酵芒果汁中富马酸的含量，且可以达到抑制霉菌所需的浓度；此外还可以改善芒果汁的感官水平，增加芒果汁香气，提高芒果汁的风味和口感，使芒果汁酸甜可口。
[0086]
综合以上实施例结果，本发明提供的发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)zf621，应用于果蔬汁发酵，在不改变现有工艺的基础上，可以显著提高发酵产物中富马酸的含量，对霉菌产生良好的抑制作用，提升果蔬汁防腐能力，延长货架期，同时还能提高果蔬汁香气以及口感，显著提升果蔬汁产品品质。
[0087]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一株发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)zf621，其特征在于，所述发酵粘液乳杆菌zf621的保藏编号为gdmcc no:63366。2.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包含如权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌zf621。3.如权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌zf621或权利要求2所述的发酵菌剂在食品发酵中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为用于果蔬汁的发酵。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为在果蔬汁发酵过程中提高富马酸含量的应用。6.一种发酵果蔬汁的制备方法，其特征在于，所述方法为在果蔬汁中添加权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌zf621或权利要求2所述的发酵菌剂进行发酵的方法。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵粘液乳杆菌zf621的添加量为105～106cfu/ml。8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵时间为12-72h。9.一种发酵果蔬汁，其特征在于，所述发酵果蔬汁由权利要求6-8任一所述的制备方法制得。10.一种抑菌制剂，其特征在于，所述抑菌制剂包括如权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌zf621。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株发酵粘液乳杆菌ZF621及其应用。本发明提供一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)ZF621，该菌株应用于果蔬汁发酵，在不改变现有工艺的基础上，提高果蔬汁发酵产物中富马酸的含量，具有良好抑制霉菌的作用，提升果蔬汁防腐能力，可以延长货架期。同时本发明提供的发酵粘液乳杆菌ZF621，应用于果蔬汁发酵时，能提高果蔬汁香气以及口感，发酵后的果蔬汁中不会有异味，后期还可以与其它果汁调配使用，即提高了果蔬汁的品质，又保留了果蔬汁的浓郁风味。汁的浓郁风味。汁的浓郁风味。


技术研发人员：刘辉 张会生 吴昌正 童星
受保护的技术使用者：正丰年农业科技有限公司
技术研发日：2023.08.08
技术公布日：2023/9/20