一种制备基因组DNA模板的方法与流程

一种制备基因组dna模板的方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，特别地涉及一种制备基因组dna模板的方法。


背景技术：

2.现有的酵母细胞基因组dna提取的方法有很多，包括酶解法、酵母基因组dna提取法和液氮研磨法等。酶解法提取过程需要进行dna纯化等诸多步骤而耗时；再者是超声和液氮提取需大量样本培养，所需耗材多、耗时长。更甚市场上现有的酵母基因组dna提取试剂盒由于需要纯化柱而费材成本高，并且操作步骤繁琐。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有的基因组dna模板的制备方法存在的缺陷，提供一种高效、快速、低成本、批量制备基因组dna模板的方法，其包括如下步骤：
4.(1)将菌液吸取至ep管中进行离心，收集菌体；
5.(2)向收集的菌体中加入一定量的超纯水重悬，获得重悬液；
6.(3)将重悬液放入液氮中冷冻，获得冷冻样品；
7.(4)将冷冻样品进行超声溶解；
8.(5)将步骤(3)和(4)重复多次；
9.(6)在冷冻样品最后一次溶解后，获取所得悬浮液作为基因组dna模板进行pcr。
10.根据本发明的一个实施方案，其中菌液为酵母细胞培养液。
11.根据本发明的一个实施方案，其中超纯水的量为使得收集的菌体能够重悬以形成重悬液的量。
12.根据本发明的一个实施方案，其中冷冻样品的温度范围为-20至-196℃、优选-40至-150℃，并且冷冻为速冻。
13.根据本发明的一个实施方案，其中超声溶解在超声仪中进行。
14.根据本发明的一个实施方案，其中上述步骤(5)中的多次为2至6次、优选3至5次、更优选4次。
15.根据本发明的一个实施方案，其中基因组dna模板进行pcr所获核酸产物的条带长度范围为100至10000bp、优选200至7000bp、更优选300至5000bp。
16.与现有制备基因组dna模板的方法相比，本发明的制备方法存在如下优点：高效简便；提取成本大幅降低；提取时间很短；能够一次制备多个不同分子量dna模板，30min左右即可pcr；所制备的基因组dna模板完整；并且可确保成功地制备酵母细胞基因组dna模板。
附图说明
17.下面结合附图来说明本发明，但本发明并不因此而受任何限制。其中：
18.图1显示通过根据本发明一个实施方案的制备方法和现有技术的制备方法制备野生型x33毕赤酵母基因组dna模板效果核酸电泳图；
19.图2显示通过根据本发明一个实施方案的制备方法和现有技术的制备方法制备基因重组x33毕赤酵母工程菌(xp-ca)基因组dna模板效果核酸电泳图；
20.图3显示通过根据本发明一个实施方案的制备方法和现有技术的制备方法制备基因重组x33毕赤酵母工程菌(xp-ct)基因组dna模板效果核酸电泳图；
21.图4显示通过根据本发明另一个实施方案的制备方法和现有技术的制备方法制备基因重组x33毕赤酵母工程菌(xp-hso)基因组dna模板效果核酸电泳图；
22.图5显示通过根据本发明另一个实施方案的制备方法和现有技术的制备方法制备基因重组x33毕赤酵母工程菌(xp-hct)基因组dna模板效果核酸电泳图；
23.图6显示通过根据本发明另一个实施方案的制备方法和现有技术的制备方法制备基因重组gs115毕赤酵母工程菌(gp-ct)基因组dna模板效果核酸电泳图；
24.图1中，m表示dna marker 2000，泳道1表示酵母基因组提取法，泳道2表示超声破壁法，泳道3表示液氮研磨法，泳道4表示溶菌酶破壁法，泳道5表示蜗牛酶破壁法，泳道6表示反复冻融法，泳道7表示液氮超声法；图2至5中，m均表示dna marker 5000，泳道1均表示酵母基因组提取法，泳道2均表示蜗牛酶破壁法，泳道3均表示溶菌酶破壁法，泳道4均表示液氮研磨法，泳道5均表示超声破壁法，泳道6均表示反复冻融法，泳道7均表示液氮超声法；图6中，m表示dna marker 10000，泳道1表示酵母基因组提取法，泳道2表示超声破壁法，泳道3表示液氮研磨法，泳道4表示溶菌酶破壁法，泳道5表示蜗牛酶破壁法，泳道6表示反复冻融法，泳道7表示液氮超声法。图1至6中，泳道1至6均表示现有技术的制备方法，泳道7表示本发明的制备方法。
具体实施方式
25.为了更好地理解本发明，下面通过特定实施方案并且结合附图来详细描述本发明，但是本发明并不限于此。
26.需要说明的是，本发明中提及但未解释说明和详述的科学术语和测试方法，与本领域技术人员所理解的含义和内容均是相同的。除非另外说明，否则本发明中的份、％均基于质量，所有的设备、原料和试剂均为本领域已知和商购可得的。
27.另外，需要说明的是，本发明中的数值范围均包括端值以及端值之间的任何点值。例如，数值范围1～10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；数值范围0.1～0.9包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9；数值范围0.01～0.09包括0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；数值范围0.08～0.21包括0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21。另外，本发明中的“以上”、“以下”和“以内”均包括本数，“大于/高于”、“小于/不到”和“不足”均不包括本数。
28.本发明所用的术语“基因组”是指是指生物体所有遗传物质的总和，这些遗传物质包括dna或rna。
29.本发明所用的术语“模板”是指一条dna单链，是合成rna互补链或mrna的模板，又是合成核酸或蛋白质的模板。
30.本发明所用的术语“菌体”是指单细胞蛋白，也叫微生物蛋白，是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。单细胞蛋白中重要的是真菌蛋白、细菌蛋白和藻类蛋白，它们的化学组成中一般以核
酸、蛋白质、脂肪为主。
31.本发明所用的术语“冷冻”是指降低温度，使物体凝固、冻结。
32.本发明所用的术语“凝胶电泳”又称“胶体电泳”，是指dna分子提取得到以后，需要通过电泳技术来检测其数量和质量。自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按相对分子质量大小分离dna的凝胶电泳技术，已发展成为一种分析鉴定dna分子的重要实验手段。琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是基因操作的核心技术之一，它能够用于分离、鉴定和纯化dna片段。该技术操作简单而迅速，已成为许多通用的分子生物学研究方法，如dna重组、dna核苷酸序列分析、dna限制性内切酶分析及限制性酶切作图等的技术基础。
33.本发明主要目的在于针对现有的制备方法存在的不足进行改进，以提供一种高效、快速、低成本、批量制备酵母细胞基因组dna模板的方法，从而能够多方面地提高酵母细胞基因组dna模板的高效制备。
34.根据本发明的一个优选的实施方案，提供一种制备酵母细胞基因组dna模板的方法，其包括如下步骤：
35.(1)将酵母细胞培养液吸取至ep管中进行离心，收集菌体；
36.(2)向收集的菌体中加入50至500μl、优选100至300μl的超纯水重悬，获得重悬液；
37.(3)将重悬液放入液氮中冷冻，获得冷冻样品；
38.(4)将冷冻样品进行超声溶解；
39.(5)将步骤(3)和(4)重复2至6次、优选3至5次；
40.(6)在冷冻样品最后一次溶解后，获取所得悬浮液作为所述基因组dna模板进行pcr。
41.根据本发明的一个特别优选的实施方案，提供一种制备酵母细胞基因组dna模板的方法，其包括如下步骤：
42.(1)将酵母细胞培养液吸取至ep管中进行离心，收集菌体；
43.(2)向收集的菌体中加入200μl的超纯水重悬，获得重悬液；
44.(3)将重悬液放入液氮中速冻，获得冷冻样品；
45.(4)将冷冻样品进行超声溶解；
46.(5)将步骤(3)和(4)重复4次；
47.(6)在冷冻样品最后一次溶解后，获取所得悬浮液作为所述基因组dna模板进行pcr。
48.通过根据本发明的实施方案制备的酵母细胞基因组dna模板进行pcr所获核酸产物的条带长度范围为100至10000bp、优选200至7000bp、更优选300至5000bp。因此，根据本发明的方法制备的酵母细胞基因组dna模板用于pcr的核酸条带范围较宽，该制备方法适用范围广，而且pcr产物的条带中杂条带极少。
49.本发明的制备酵母基因组dna模板的方法相比现有的制备方法过程所需的试剂耗材成本大幅度降低。而且，本发明的酵母基因组dna模板的制备过程简单，利用超纯水将菌体重悬，使用液氮速冻和超声裂解，裂解释放的dna不需要纯化回收即可直接用于常规pcr的dna模板，从而减少现有技术的制备方法制备酵母dna模板的繁琐步骤。因为制备过程简单，所以制备出的模板dna样本完整，没有损耗；并且，本发明可一次进行不同分子量dna模板、不同酵母宿主菌组成的重组酵母细胞及多样本实验，节省大量时间。
50.实施例
51.下面通过具体实施例来进一步详述本发明。但是，下述实施例仅为示例性和说明性的，本发明并不限于这些实施例。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本领域技术人员可对这些实施例和优选实施方案进行各种修改、替代、改变，经过修改、替代和改变后的实施例和优选实施方案仍落入本发明的范围内。
52.下述实施例的试验方法中，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的各标准物质均可从商业途径购买得到。
53.下述实施例中所用的仪器与试剂如下：超净台(苏州安泰空气技术有限公司)，冰箱(海尔电器)，酵母基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，吸附管(天根生化科技有限公司)，吸附柱(天根生化科技有限公司)，十字柄组织研磨器(乐天实验耗材)，试剂盒(天根生化科技有限公司)，野生型x33毕赤酵母培养液(自制)，重组毕赤酵母工程菌(xp-ca)培养液(自制)，重组毕赤酵母工程菌(xp-ct)培养液(自制)，重组毕赤酵母工程菌(xp-hso)培养液(自制)，重组毕赤酵母工程菌(xp-hct)培养液(自制)，重组毕赤酵母工程菌(gp-ct)培养液(自制)，山梨醇缓冲液(自制)，溶菌酶(lyticase)(飞净科研试剂)，缓冲液ga(天根生化科技有限公司)，蛋白酶k(天根生化科技有限公司)，rnasea(赛默飞世尔科技有限公司)，缓冲液gb(天根生化科技有限公司)，缓冲液gd(天根生化科技有限公司)，无水乙醇(大茂化学试剂)，漂洗液pw(天根生化科技有限公司)，ddh2o(南京诺维赞生物科技股份有限公司)，pbs(北京索莱宝科技有限公司)，蜗牛酶溶液(飞净科研试剂)，裂解液(按照1m tris-hcl，ph 8.0，0.5m edta，5m nacl，10％ sds的比例制备)(自制)，萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1，按体积比计)(自制)，3m次氯酸钠溶液(自制)，灭菌水(自制)，dna缓冲液(按照100mmol/l tris-hcl，ph8.0，10mmol/l edta，1％ sds的比例制备)(自制)，液氮(华特雅工业气体有限公司)，1mol/l山梨醇溶液(自制)，sds(北京索莱宝科技有限公司)，超纯水(自制)，灭菌超纯水(自制)，上、下游引物(生工生物)，eb(碧云天生物)，1％琼脂糖凝胶(自制)，2x santaq pcr master mix预混液(含蓝染料)【生工生物工程(上海)股份有限公司试剂】，核酸电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)，50x tae(自制)。
54.实施例1：利用本发明及现有技术的制备方法制备野生型x33毕赤酵母基因组dna模板以比对制备效果
55.1.1x33酵母基因组dna模板制备
56.①
酵母基因组提取法：按照所购试剂盒说明书进行提取。取1ml野生型x33毕赤酵母培养液，12000r/min离心2min，收集菌体，加入600μl山梨醇缓冲液、50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃处理30min。4000r/min离心10min，沉淀中加入200μl缓冲液ga进行重悬，加入20μl蛋白酶k混匀，然后加入4μl rnasea(100mg/ml)，室温放置5min。加入220μl缓冲液gb，颠倒混匀，70℃放置10min，加220μl无水乙醇充分颠倒混匀，所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12000r/min离心30s，向吸附管中加入500μl缓冲液gd，12000r/min离心30s，向吸附柱中加入500μl漂洗液pw漂洗两次，最后加入200μl ddh2o洗脱柱子上的酵母基因组dna。
57.②
超声破壁法：取50ml野生型x33毕赤酵母培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体，菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min，加入3ml 1mol/l山梨醇缓冲液，放
置冰上，设置超声时间10min，超声1min、停滞1min，如此重复超声9次。使用十字柄组织研磨器对超声后的细胞进行研磨破碎，再加入5ml dna缓冲液(自制，100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)，混匀，65℃保温1h，即可pcr。
58.③
液氮研磨法：取50ml野生型x33毕赤酵母培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体。菌体用液氮速冻，使用十字柄组织研磨器碾磨破壁至菌液溶解。加7ml dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)。混匀，65℃保温1h，即可pcr。
59.④
溶菌酶破壁法：取1ml野生型x33毕赤酵母培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体；菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min；菌体用500μl 1mol/l山梨醇溶液重悬，加入50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃温浴30min；加入100μl 2％ sds混匀，-20℃冰冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠溶液，混匀后加入2倍体积无水乙醇(相对于加入次氯酸钠溶液后的溶液总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清液，加入500μl75％乙醇，混匀后离心，弃上清液，加入500μl无水乙醇，混匀后静止5min，离心弃上清液，放置超净台吹干，加入200μl超纯水重悬，即可pcr。
60.⑤
蜗牛酶破壁法：取1ml野生型x33毕赤酵母菌液12000r/min离心2min，收集菌体，弃上清液，沉淀中加入500μl pbs重悬,12000r/min离心2min；弃上清液，重复悬浮一次，将沉淀溶于100μl含20mg/ml的蜗牛酶溶液中，45℃作用2h，再加入100μl裂解液，-20℃冷冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠溶液，混匀后加入2倍体积无水乙醇(基于加入氯酸钠溶液所得溶液的总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清液，加入500μl75％乙醇，混匀后离心，弃上清液，加入500μl无水乙醇，混匀后静止5min，离心弃上清液，放置超净台吹干，加入200μl超纯水重悬，即可pcr。
61.⑥
反复冻融法：取1ml野生型x33毕赤酵母培养液菌液，12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入沸水中煮5min，放入-80℃冰箱冷冻2h，再次放入沸水中煮5min，即可pcr。
62.⑦
液氮超声法：取1ml野生型x33毕赤酵母培养液菌液，12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入液氮中速冻，进行超声溶解(重复此操作四次)，即可pcr。
63.1.2pcr扩增
64.反应体系：灭菌超纯水4.3μl、2x santaq pcr master mix预混液(含蓝染料)5μl、上、下游引物各0.1μl；上游引物为：its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’)，下游引物为：its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’)。
65.反应条件：预变性94℃4分钟，变性94℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃40秒(重复变性-退火-延伸三个步骤循环35次)，72℃5分钟，4℃保存。
66.1.3pcr产物条带分型
67.eb染色，1％琼脂糖凝胶150v/cm，成像系统条带分型。条带长度是330bp，液氮超声条带比现有技术的制备方法条带较亮，反映出液氮超声制备的dna含量高，这表明液氮超声制备效果较佳。(见图1)
68.实施例2：利用本发明及现有技术的制备方法制备基因重组x33毕赤酵母工程菌(xp-ca)基因组dna模板以比对制备效果
69.①
酵母基因组提取法：按照所购试剂盒说明书进行提取。取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ca)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体，加入600μl山梨醇缓冲液、50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃处理40min。4000r/min离心10min，沉淀中加入200μl缓冲液ga进行重悬，加入20μl蛋白酶k混匀，然后加入4μl rnasea(100mg/ml)，室温放置5min。加入220μl缓冲液gb，颠倒混匀，70℃放置10min，加220μl无水乙醇充分颠倒混匀，所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12000r/min离心30s，向吸附管中加入500μl缓冲液gd，12000r/min离心30s，向吸附柱中加入500μl漂洗液pw漂洗两次，最后加入50μl ddh2o洗脱柱子上的酵母基因组dna。
70.②
蜗牛酶破壁法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ca)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体，弃上清液，沉淀中加入500μl pbs重悬,12000r/min离心2min；弃上清液，重复悬浮一次，沉淀溶于100μl含20mg/ml的蜗牛酶溶液中，45℃作用2h，再加入100μl裂解液，-20℃冷冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠混匀后，加入2倍体积无水乙醇(基于加入氯酸钠溶液所得溶液的总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清液，加入500μl75％乙醇，混匀后离心，弃上清液，加入500μl无水乙醇，混匀后静止5min，离心弃上清液，放置超净台吹干，加入50μl超纯水重悬，即可pcr。
71.③
溶菌酶破壁法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ca)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体；菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min；菌体用500μl 1mol/l山梨醇溶液重悬，加入50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃温浴20min后，加入50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，继续温浴20min；加入100μl 2％ sds混匀，-20℃冰冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠混匀后，加入2倍体积无水乙醇(基于加入氯酸钠溶液所得溶液的总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清液，加入500μl75％乙醇，混匀后离心，弃上清液，加入500μl无水乙醇，混匀后静止5min，离心弃上清液，放置超净台吹干，加入50μl超纯水重悬，即可pcr。
72.④
液氮研磨法：取50ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ca)培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体。菌体用液氮速冻，使用十字柄组织研磨器碾磨破壁至菌液溶解。加7ml dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)。混匀，65℃保温1h，即可pcr。
73.⑤
超声破壁法：取50ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ca)培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体，菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min，加入3ml 1mol/l山梨醇，放置冰上，设置超声时间10min，超声1min、停滞1min，如此重复超声9次。使用十字柄组织研磨器对超声后的细胞进行研磨破碎，再加入5ml dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)，混匀，65℃保温1h，即可pcr。
74.⑥
反复冻融法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ca)培养液，12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入沸水中煮5min，放入-80℃冰箱冷冻2h，再次放入沸水中煮5min，即可pcr。
75.⑦
液氮超声法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ca)培养液，12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入液氮中速冻，进行超声溶解(重复此操作四次)，即可
dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)。混匀，65℃保温1h，即可pcr。
86.⑤
超声破壁法：取50ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ct)培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体，菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min，加入3ml 1mol/l山梨醇，放置冰上，设置超声时间10min，超声1min、停滞1min，如此重复超声9次。使用十字柄组织研磨器对超声后的细胞进行研磨破碎，再加入5ml dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)，混匀，65℃保温1h，即可pcr。
87.⑥
反复冻融法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ct)培养液，12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入沸水中煮5min，放入-80℃冰箱冷冻2h，再次放入沸水中煮5min，即可pcr。
88.⑦
液氮超声法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-ct)培养液，12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入液氮中速冻，进行超声溶解(重复此操作四次)，即可pcr。
89.1.2pcr扩增
90.反应体系：灭菌超纯水4.3μl、2x santaq pcr master mix预混液(含蓝染料)5μl、上、下游引物各0.1μl；上游引物为：n-α-f(5
’‑
gcatcctccgcattagctgctccagtcaacac-3’)，下游引物为：n-pic-r(5
’‑
ctctcaggcaaatggcattctgacatcctcttg-3’)。
91.反应条件：预变性94℃4分钟，变性94℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃2分10秒(重复变性-退火-延伸三个步骤循环35次)，72℃5分钟，4℃保存。
92.1.3pcr产物条带分型
93.eb染色，1％琼脂糖凝胶150v/cm，成像系统条带分型。条带长度是1979bp，液氮超声条带比现有技术的制备方法条带较亮，并且无杂条带，其余制备方法除基因组提取外都出现杂条带，部分降解，这表明液氮超声制备效果较佳。(见图3)
94.实施例4：利用本发明及现有技术的制备方法制备基因重组x33毕赤酵母工程菌(xp-hso)基因组dna模板以比对制备效果
95.①
酵母基因组提取法：按照所购试剂盒说明书进行提取。取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-hso)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体，加入600μl山梨醇缓冲液、50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃温浴20min后，加入50μl溶菌酶，继续温浴20min。4000r/min离心10min，沉淀中加入200μl缓冲液ga进行重悬，加入20μl蛋白酶k混匀，然后加入4μl rnasea(100mg/ml)，室温放置5min。加入220μl缓冲液gb，颠倒混匀，70℃放置10min，加入220μl无水乙醇充分颠倒混匀，所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12000r/min离心30s，向吸附管中加入500μl缓冲液gd，12000r/min离心30s，向吸附柱中加入500μl漂洗液pw漂洗两次，最后加入50μl ddh2o洗脱柱子上的酵母基因组dna。
96.②
蜗牛酶破壁法：将1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-hso)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体，弃上清液，沉淀中加入500μl pbs重悬，12000r/min离心2min；弃上清液，重复悬浮一次，沉淀溶于100μl含20mg/ml的蜗牛酶溶液中，45℃作用2h，再加入100μl裂解液，-20℃冷冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠混匀后，加入2倍体积无水乙醇(基于加入氯酸钠溶液所得溶液的总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清
10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃处理40min。4000r/min离心10min，沉淀中加入200μl缓冲液ga进行重悬，加入20μl蛋白酶k混匀，然后加入4μl rnasea(100mg/ml)，室温放置5min。加入220μl缓冲液gb，颠倒混匀，70℃放置10min，加220μl无水乙醇充分颠倒混匀，所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12000r/min离心30s，向吸附管中加入500μl缓冲液gd，12000r/min离心30s，向吸附柱中加入500μl漂洗液pw漂洗两次，最后加入50μl ddh2o洗脱柱子上的酵母基因组dna。
109.②
蜗牛酶破壁法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-hct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体，弃上清液，沉淀中加入500μl pbs重悬,12000r/min离心2min；弃上清液，重复悬浮一次，沉淀溶于100μl含20mg/ml的蜗牛酶溶液中，45℃作用2h，再加入100μl裂解液，-20℃冷冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠混匀后，加入2倍体积无水乙醇(基于加入氯酸钠溶液所得溶液的总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清液，加入500μl75％乙醇，混匀后离心，弃上清液，加入500μl无水乙醇，混匀后静止5min，离心弃上清液，放置超净台吹干，加入50μl超纯水重悬，即可pcr。
110.③
溶菌酶破壁法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-hct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体；菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min；菌体用500μl 1mol/l山梨醇溶液重悬，加入50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃温浴40min；加入100μl 2％ sds混匀，-20℃冰冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠混匀后，加入2倍体积无水乙醇(基于加入氯酸钠溶液所得溶液的总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清液，加入500μl75％乙醇，混匀后离心，弃上清液，加入500μl无水乙醇，混匀后静止5min，离心弃上清液，放置超净台吹干，加入50μl超纯水重悬，即可pcr。
111.④
液氮研磨法：取50ml重组毕赤酵母工程菌(xp-hct)培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体。菌体用液氮速冻，使用十字柄组织研磨器碾磨破壁至菌体溶解。加7ml dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)。混匀，65℃保温1h，即可pcr。
112.⑤
超声破壁法：取50ml重组毕赤酵母工程菌(xp-hct)培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体，菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min，加入3ml 1mol/l山梨醇，放置冰上，设置超声时间10min，超声1min、停滞1min，如此重复超声9次。使用十字柄组织研磨器对超声后的细胞进行研磨破碎，再加入5ml dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)，混匀，65℃保温1h，即可pcr。
113.⑥
反复冻融法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-hct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入沸水中煮5min，放入-80℃冰箱冷冻2h，再次放入沸水中煮5min，即可pcr。
114.⑦
液氮超声法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(xp-hct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入液氮中速冻，进行超声溶解(重复此操作四次)，即可pcr。
115.1.2pcr扩增
116.反应体系：灭菌超纯水4.3μl，2x santaq pcr master mix预混液(含蓝染料)5μl，
上、下游引物各0.1μl；上游引物为：n-α-f(5
’‑
gcatcctccgcattagctgctccagtcaacac-3’)，下游引物为：n-pic-r(5
’‑
ctctcaggcaaatggcattctgacatcctcttg-3’)。
117.反应条件：预变性94℃4分钟，变性94℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃4分钟(重复变性-退火-延伸三个步骤循环35次)，72℃5分钟，4℃保存。
118.1.3pcr产物条带分型
119.eb染色，1％琼脂糖凝胶150v/cm，成像系统条带分型。条带长度是3852bp，液氮超声制备和基因组提取的制备dna条带比其它四种制备方法条带亮，但基因组提取需要用到吸附柱，耗材昂贵。几种制备方法都出现降解产生杂条带，其中蜗牛酶与溶菌酶制备基因组dna方法降解最为严重，这表明液氮超声制备效果较佳。(见图5)
120.实施例6：利用本发明及现有技术的制备方法制备基因重组gs115毕赤酵母工程菌(gp-ct)基因组dna模板以比对制备效果
121.①
酵母基因组提取法：按照所购试剂盒说明书进行提取。取1ml重组毕赤酵母工程菌(gp-ct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体，加入600μl山梨醇缓冲液、50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃处理40min。4000r/min离心10min，沉淀中加入200μl缓冲液ga进行重悬，加入20μl蛋白酶k混匀，然后加入4μl rnasea(100mg/ml)，室温放置5min。加入220μl缓冲液gb，颠倒混匀，70℃放置10min，加220μl无水乙醇充分颠倒混匀，所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12000r/min离心30s，向吸附管中加入500μl缓冲液gd，12000r/min离心30s，向吸附柱中加入500μl漂洗液pw漂洗两次，最后加入50μl ddh2o洗脱柱子上的酵母基因组dna。
122.②
蜗牛酶破壁法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(gp-ct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体，弃上清液，沉淀中加入500μl pbs重悬，12000r/min离心2min；弃上清液，重复悬浮一次，沉淀溶于100μl含20mg/ml的蜗牛酶溶液中，45℃作用2h，再加入100μl裂解液，-20℃冷冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠混匀后，加入2倍体积无水乙醇(基于加入氯酸钠溶液所得溶液的总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清液，加入500μl75％乙醇，混匀后离心，弃上清液，加入500μl无水乙醇，混匀后静止5min，离心弃上清液，放置超净台吹干，加入200μl超纯水重悬，即可pcr。
123.③
溶菌酶破壁法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(gp-ct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体；菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min；菌体用500μl 1mol/l山梨醇溶液重悬，加入50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，30℃温浴20min后，加入50μl 10u/l溶菌酶(lyticase)，继续温浴20min；加入100μl 2％ sds混匀，-20℃冰冻，然后室温震荡溶解，重复3次；离心取上清液，加入70％体积的萃取剂(三氯甲烷：异戊醇＝24：1)，混匀后静止5min，离心取上清液，加入1/10 3m次氯酸钠混匀后，加入2倍体积无水乙醇(基于加入氯酸钠溶液所得溶液的总体积)，-20℃静止2h，离心弃上清液，加入500μl75％乙醇，混匀后离心，弃上清液，加入500μl无水乙醇，混匀后静止5min，离心弃上清液，放置超净台吹干，加入200μl超纯水重悬，即可pcr。
124.④
液氮研磨法：取50ml重组毕赤酵母工程菌(gp-ct)培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体。菌体用液氮速冻，使用十字柄组织研磨器碾磨破壁至菌体溶解。加7ml dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)。混匀，65℃保温1h，即
可pcr。
125.⑤
超声破壁法：取50ml重组毕赤酵母工程菌(gp-ct)培养液，室温下12000r/min离心5min，收集菌体，菌体用灭菌水水洗1次，12000r/min离心2min，加入3ml 1mol/l山梨醇，放置冰上，设置超声时间10min，超声1min、停滞1min，如此重复超声9次。使用十字柄组织研磨器对超声后的细胞进行研磨破碎，再加入5ml dna缓冲液(100mmol/l tris-hcl，ph 8.0，10mmol/l edta，1％ sds)，混匀，65℃保温1h，即可pcr。
126.⑥
反复冻融法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(gp-ct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入沸水中煮5min，放入-80℃冰箱冷冻2h，再次放入沸水中煮5min，即可pcr。
127.⑦
液氮超声法：取1ml重组毕赤酵母工程菌(gp-ct)培养液，室温下12000r/min离心2min，收集菌体；加入200μl超纯水重悬，放入液氮中速冻，进行超声溶解(重复此操作四次)，即可pcr。
128.1.2pcr扩增
129.反应体系：灭菌超纯水4.3μl，2x santaq pcr master mix预混液(含蓝染料)5μl，上、下游引物各0.1μl；上游引物为：n-α-f(5
’‑
gcatcctccgcattagctgctccagtcaacac-3’)，下游引物为：n-pic-r(5
’‑
ctctcaggcaaatggcattctgacatcctcttg-3’)。
130.反应条件：预变性94℃4分钟，变性94℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃2分10秒(重复变性-退火-延伸三个步骤循环35次)，72℃1分，4℃保存。
131.1.3pcr产物条带分型
132.eb染色，1％琼脂糖凝胶150v/cm，成像系统条带分型。条带长度是1979bp，液氮超声条带比现有技术的制备方法条带较亮，并且无杂条带，这表明液氮超声制备效果较佳。(见图6)
133.上面通过具体实施例和优选实施方案详细描述了本发明。然而，在不脱离本发明的宗旨和精神的前提下，可对本发明的实施例进行各种修改、修饰、变化和变型。并且，对本发明的实施方式的各种修改、修饰、变化和变型并不影响本发明权利要求的保护范围，相反均落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种制备基因组dna模板的方法，其包括如下步骤：(1)将菌液吸取至ep管中进行离心，收集菌体；(2)向收集的菌体中加入一定量的超纯水重悬，获得重悬液；(3)将所述重悬液放入液氮中冷冻，获得冷冻样品；(4)将所述冷冻样品进行超声溶解；(5)将步骤(3)和(4)重复多次；(6)在所述冷冻样品最后一次溶解后，获取所得悬浮液作为所述基因组dna模板进行pcr。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述菌液为酵母细胞培养液。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一定量为使得所述收集的菌体能够重悬以形成重悬液的量。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述冷冻样品的温度范围为-20至-196℃、优选-40至-150℃，所述冷冻为速冻。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述超声溶解在超声仪中进行。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多次为2至6次、优选3至5次、更优选4次。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因组dna模板进行pcr所获核酸产物的条带长度范围为100至10000bp、优选200至7000bp、更优选300至5000bp。

技术总结
本发明公开一种制备酵母基因组DNA模板的方法，其方法步骤如下：使用超纯水来重悬菌体，放进液氮速冻，然后将其超声溶解，重复多次即可PCR鉴定。与现有的制备方法对比，本发明的制备方法高效简便；提取成本大幅降低；提取时间很短；能够一次制备多个不同分子量DNA模板，30min左右即可PCR；所制备的基因组DNA模板完整；并且可确保成功地制备酵母细胞基因组DNA模板。模板。模板。


技术研发人员：陈刚 郑春辉 丁贵蓉 马福军 朱燕 夏烈文
受保护的技术使用者：云锦华彰（北京）生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.08
技术公布日：2023/9/20