一种BALB/c小鼠Graves眼病模型及其构建方法和应用

一种balb/c小鼠graves眼病模型及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于动物模型构建领域，尤其是涉及一种balb/c小鼠graves眼病模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.graves病(graves’disease,gd)是自身免疫性甲状腺病最常见的类型。graves眼病(graves’ophthalmopathy,go)是gd最常见的甲状腺外表现，常见的临床表现包括突眼、眼睑红肿、泪阜肿胀、畏光、流泪、眼球自发性疼痛等，如未及时治疗，可能导致视力下降、复视、视野缺损等永久性视力损害甚至失明，对患者的外观和生活质量造成不同程度的负面影响。自身免疫性go的早期诊断是多学科领域交叉的共性难题，也是研究热点与难点，尤其发病机制的研究，迫切需要动物模型的构建，是挑战性研究，但遗憾的是目前缺乏理想的动物模型。近年来，国内外学者多为使用单独tshr质粒转染或使用腺病毒ad-tshra的方法诱导小鼠go模型。但使用单独tshr质粒转染或使用腺病毒ad-tshra的方法诱导小鼠go模型构建时间长、重复性不佳且成模率低。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种balb/c小鼠graves眼病模型及其构建方法和应用。
4.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
5.第一方面，本发明提供了一种balb/c小鼠graves眼病模型的构建方法，所述构建方法为：将重组质粒pcdna3.1/tshr289及重组质粒igf-1rα-pcdna
tm
3.1d/v5-his-topo多次联合注射于balb/c小鼠双腿腓肠肌进行协同免疫，并在注射部位进行电穿孔即制得balb/c小鼠graves眼病模型。
6.优选地，所述联合注射的方式为以下四种方式中的任一种：
7.(1)每次同时注射两种重组质粒；
8.(2)前若干次单独注射任一种重组质粒，后若干次同时注射两种重组质粒；
9.(3)前若干次同时注射两种重组质粒，后若干次单独注射任一种重组质粒；
10.(4)前若干次单独注射任一种重组质粒，后若干次单独注射另一种重组质粒。
11.优选地，重组质粒pcdna3.1/tshr289的浓度为0.5-2μg/μl，每次的注射剂量为25-100μl。
12.优选地，重组质粒igf-1rα-pcdna
tm
3.1d/v5-his-topo的浓度为0.5-2μg/μl，每次的注射剂量为25-100μl。
13.优选地，注射次数为8-16次，每次注射的间隔2-4周。
14.优选地，电穿孔的参数为：电极针插入小鼠注射重组质粒的部位深度为0.5-10mm；连续电击1-15次；电压为10-100v；频率为大于0且不大于50脉冲/秒；脉冲持续时长为10-500ms；脉冲间隔为20-1000ms。
15.更优选地，电穿孔的参数为：电极针插入小鼠注射重组质粒的部位深度为4-5mm；连续电击6次；电压为50v；频率为5脉冲/秒；脉冲持续时长为50ms；脉冲间隔为200ms。
16.优选地，balb/c小鼠为6-8周龄的balb/c小鼠。
17.第二方面，本发明还提供了上述构建方法得到的balb/c小鼠graves眼病模型。
18.第三方面，本发明还提供了上述balb/c小鼠graves眼病模型在作为研究graves眼病病因以及发病机制的动物模型中的应用。
19.第四方面，本发明还提供了上述balb/c小鼠graves眼病模型在作为筛选治疗和/或预防graves眼病药物的动物模型中的应用。
20.相对于现有技术，本发明具有以下优势：
21.本发明基于tshr/igf-1r共定位现象，设计了一种使用“重组质粒pcdna3.1/tshr289及igf-1rα-pcdna
tm
3.1d/v5-his-topo肌肉注射协同免疫+电穿孔”的小鼠模型构建方法，即首次使用双质粒转染的方法对balb/c小鼠进行免疫，构建稳定的balb/c小鼠go模型，成模率83.3％，为研究go的病因及发病机制奠定实验基础。
附图说明
22.图1为本发明balb/c小鼠graves眼病模型的构建技术路线图；
23.图2为小鼠血清t4水平的对比变化情况；
24.图3为小鼠血清tsh水平的对比变化情况；
25.图4为小鼠的血清tsab水平的对比变化情况；
26.图5为小鼠的血清tsbab水平的对比变化情况；
27.图6为小鼠的体重水平的对比变化情况；
28.图7为小鼠的血糖水平的对比变化情况；
29.图8为不同阶段的balb/c小鼠进行的甲状腺99mtco4-显像；
30.图9为小鼠的眼部外观表现；
31.图10为小鼠眼肌mri t2加权显像；
32.图11为小鼠mri显像重建眼肌体积分析；
33.图12为小鼠甲状腺外观；
34.图13为小鼠甲状腺病理he染色结果；
35.图14为小鼠甲状腺组织病理的免疫组化染色及tshr组化评分结果；
36.图15为小鼠甲状腺组织病理的免疫组化染色及igf-1r组化评分结果；
37.图16为小鼠眼部及球后组织he染色结果；
38.图17为小鼠眼眶及球后组织免疫组化染色及tshr组化评分结果；
39.图18为小鼠眼眶及球后组织免疫组化染色及igf-1r组化评分结果。
具体实施方式
40.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
41.下面结合实施例来详细说明本发明。
42.本发明实施例中使用的重组质粒pcdna3.1/tshr289具体制备方法参考文献(《tshr基因免疫诱导balb/c小鼠graves甲亢伴graves眼病的实验研究》，中华内分泌代谢杂志)；重组质粒igf-1rα-pcdna
tm
3.1d/v5-his-topo具体制备方法参考文献(《胰岛素样生长因子1受体α亚单位基因重组真核表达质粒的构建》，山东医药)。
43.本发明balb/c小鼠graves眼病模型的构建技术路线图如图1所示，具体过程及实验结果如下：
44.将6-8周龄的雌性balb/c小鼠使用不同方法进行免疫，分别于免疫前、第2次免疫开始后的每次免疫后及免疫结束后定期取血检测小鼠血t4、tsh、tsab、tsbab、血糖水平及体重变化。实验分组及免疫方案见下表：
45.表1实验分组及免疫方案
[0046][0047][0048]
同时设置f组(仅在免疫间隔时间设置上提前1周，余条件同d组)进行对照研究。
[0049]
小鼠血清t4水平从免疫前到第12次免疫结束的变化结果如图2所示，a、c、d、f组血清t4水平(分别为60.89
±
8.05，64.37
±
1.03，81.46
±
4.06，61.78
±
4.55ng/ml)明显高于b、e组小鼠的t4水平(分别为14.72
±
0.63，12.32
±
0.4ng/ml)(p《0.05)。其中升高程度最大者为d组，其次为c组，再次为a组。f组与d组相比较无明显差异(61.78
±
4.55v.s 81.46
±
4.06ng/ml，p＝0.85)。
[0050]
小鼠血清tsh水平从免疫前到第12次免疫结束的变化结果如图3所示，a、c、d、f组中23只t4水平升高的小鼠血清tsh水平(分别为0.01
±
0，0.01
±
0，0.01
±
0，0.02
±
0.02μiu/ml)明显低于e组小鼠tsh水平(3.17
±
0.42μiu/ml)(p《0.05)。b组小鼠血清tsh水平同样
也明显低于e组小鼠的tsh水平(分别为0.01
±
0，3.17
±
0.42μiu/ml)(p《0.05)。5组实验组小鼠tsh水平降低幅度无明显差异(p》0.05)。
[0051]
小鼠血清tsab水平从免疫前到第12次免疫结束的变化结果如图4所示，a、c、d、f组中23只t4水平升高的小鼠血清tsab水平(分别为537.17
±
19.47，431.46
±
153.11，568.57
±
135.48，483.47
±
112.82μiu/ml)明显高于e组小鼠的tsab水平(3.96
±
0.43μiu/ml)(p《0.05)。b组小鼠血清tsab水平同样也明显高于e组小鼠的tsab水平(172.22
±
18.87v.s 3.96
±
0.43μiu/ml)(p《0.05)。其中升高程度最大者为d组，其次为a组，再次为f组，最后为c组。f组与d组相比较无明显差异(568.57
±
135.48v.s 483.47
±
112.82μiu/ml，p＝0.62)。
[0052]
小鼠血清tsbab水平从免疫前到第12次免疫结束的变化结果如图5所示，a、c、d、f组中23只t4水平升高的小鼠血清tsbab水平(分别为17.75
±
0.76，19.78
±
1.27，19.40
±
1.18，18.55
±
2.24μiu/ml)均稍高于e组小鼠的tsbab水平(15.31
±
1.09μiu/ml)(p《0.05)。b组小鼠血清tsbab水平同样也稍高于e组小鼠的tsbab水平(18.17
±
0.95v.s 15.31
±
1.09μiu/ml)(p《0.05)。其中升高程度最较大者为c组，其次为d组，再次为a组和f组，最后为b组。f组与d组相比较无明显差异(18.55
±
2.24v.s 19.40
±
1.18μiu/ml，p＝0.28)。
[0053]
小鼠体重从免疫前到第12次免疫结束的变化结果如图6所示，可以看出，a、c、d、f组造模成功的23只小鼠的体重(分别为22.68
±
1.08，24.48
±
1.67，20.87
±
1.05，22.73
±
1.66g)较b实验组、e对照组小鼠的体重明显减轻(分别为29.96
±
1.45，31.61
±
2.81g)(p《0.05)。a、c、d、f实验组小鼠体重水平下降低幅度无明显差异，其中d组和f组之间无明显差异(p＝0.43)。
[0054]
小鼠血糖从免疫前到第12次免疫结束的变化结果如图7所示，可以看出，a组(单独tshr免疫组)小鼠血糖为(5.12
±
0.88)mmol/l-(6.78
±
1.36)mmol/l，c组(前4次单独tshr免疫后8次联合igf-1rα免疫组)小鼠血糖为(5.62
±
0.93)mmol/l-(6.72
±
0.58)mmol/l，d组小鼠血糖为(5.55
±
0.49)mmol/l-(6.6
±
0.51)mmol/l，e组小鼠血糖为(5.67
±
0.88)mmol/l-(6.85
±
0.65)mmol/l，f组小鼠血糖为(5.85
±
0.36)mmol/l-(6.23
±
0.36)mmol/l。a、b、c、d、f实验组血糖水平均处于相对稳定状态，与e组小鼠血糖比较未出现大范围波动，差异无统计学意义(均p＞0.05)。
[0055]
分别于免疫前、后对各组小鼠进行甲状腺显像及眼眶及球后组织显像，评价各组小鼠甲状腺及眼眶及球后组织组织的核素摄取能力及结构变化。
[0056]
第12次免疫后1周，6组小鼠再次行甲状腺ect显像，结果如图8所示，可以看出，a、c、d、f组小鼠的甲状腺均较b、e组小鼠摄取示踪剂99mtco4-的能力明显增强，其中摄取能力最强者为d组和f组，其次为c组，再次为a组。
[0057]
小鼠的眼部外观表现如图9所示，可以看出，在12次免疫期间，b组、e组小鼠的眼部外观未见明显变化，a、c、d、f组小鼠中出现眼部外观的变化(多为单眼)：眼睑充血、水肿、眼裂增宽、眼球突出等不同程度的变化。其中d、f组最为明显。
[0058]
在第12次免疫结束后1周，对各组小鼠行眼部及球后组织mri t2加权显像，通过imagej软件处理小鼠mri图像，测量勾画双侧眼肌体积，并进行统计分析。
[0059]
小鼠眼肌mri t2加权显像结果如图10所示，可以看出，a、c、d、f组小鼠的眼肌最大截面均不同程度的较b组、e组明显增粗，其中增粗最明显者为f组，其次为d组，再次为c组，最后为a组。
[0060]
小鼠的眼肌体积结果如图11所示，可以看出，a、c、d组小鼠的眼肌体积(分别为9.07
±
1.11mm3，12.48
±
2.04mm3，13.62
±
2.16mm3)均比b、e组小鼠的眼肌(分别为5.23
±
2.02mm3，5.12
±
2.01mm3)有不同程度的增粗、增大(p《0.05)，其中最为明显者为为d组，其次为c组，再次为a组。f组与d组相比较无明显差异(12.81
±
2.39mm
3 v.s 13.62
±
2.16mm3，p＝0.55)。
[0061]
小鼠甲状腺外观如图12所示，可以看出，a、c、d、f造模实验组小鼠的甲状腺比生理盐水免疫组(e组)及单独igf-1rα免疫组(b组)小鼠甲状腺均存在不同程度的增大，其中增大最为明显者为d组，其次为c组和f组，再次为a组。
[0062]
第12次免疫结束后1周，对各组小鼠甲状腺组织切片进行he染色分析，结果如图13所示，可以看出，a、c、d、f造模实验组小鼠的甲状腺he染色：滤泡上皮细胞胶质减少，程度不一，细胞增生较活跃、密集，可见微滤泡，部分滤泡为柱状或高柱状，可见淋巴浸润。其中最为明显者为d组和f组，其次为c组，再次为a组。
[0063]
小鼠甲状腺组织病理的免疫组化染色及tshr、igf-1r组化评分结果如图14和图15所示，可以看出，a、c、d、f组较e组小鼠甲状腺组织tshr、igf-1r表达量升高(p《0.05)。b组较e组小鼠甲状腺组织igf-1r表达量升高(p《0.05)，但b组和e组tshr表达量无明显差异(p》0.05)。d组和f组之间tshr、igf-1r表达量无明显差异(p＝0.89)。
[0064]
a、c、d、f造模实验组小鼠的眼眶及球后组织he染色，结果如图16所示，可以看出，部分可见视神经胞浆丰富、水肿，脂肪细胞增生，伴有不同程度的肌肉间质水肿。其中最为明显者为d组和f组，其次为c组，再次为a组。
[0065]
小鼠眼眶及球后组织免疫组化染色及tshr、igf-1r组化评分结果如图17和图18所示，可以看出，a、c、d、f小鼠的眼眶及球后组织较e组、b组小鼠眼眶及球后组织tshr表达量明显升高(p《0.05)。a、c、d、f实验组小鼠眼眶及球后组织tshr表达量无明显差异，其中a、c、d三组间无明显差异，d组和f组之间也无明显差异(均p》0.05)。d组小鼠的眼眶及球后组织较e组小鼠眼眶及球后组织igf-1r表达量明显升高(p《0.05)，a、b、c组实验组小鼠眼眶及球后组织igf-1r表达量较e组并无统计学意义(p》0.05)，但从数值上可观察到表达量有所增加。d组和f组之间无明显差异(p＝0.41)。
[0066]
根据图1-图16，可以得出本发明的构建方法可以成功构建graves眼病的小鼠模型，即c组和d组，经统计，用两种质粒同时转染的小鼠共12只(c组和d组)，其中10只造模成功，造模成功率83.3％。
[0067]
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

技术特征：
1.一种balb/c小鼠graves眼病模型的构建方法，其特征在于：所述构建方法为：将重组质粒pcdna3.1/tshr289及重组质粒igf-1rα-pcdna
tm
3.1d/v5-his-topo多次联合注射于balb/c小鼠双腿腓肠肌进行协同免疫，并在注射部位进行电穿孔即制得balb/c小鼠graves眼病模型。2.根据权利要求1所述的balb/c小鼠graves眼病模型的构建方法，其特征在于：所述联合注射的方式为以下四种方式中的任一种：(1)每次同时注射两种重组质粒；(2)前若干次单独注射任一种重组质粒，后若干次同时注射两种重组质粒；(3)前若干次同时注射两种重组质粒，后若干次单独注射任一种重组质粒；(4)前若干次单独注射任一种重组质粒，后若干次单独注射另一种重组质粒。3.根据权利要求1所述的balb/c小鼠graves眼病模型的构建方法，其特征在于：重组质粒pcdna3.1/tshr289的浓度为0.5-2μg/μl，每次的注射剂量为25-100μl。4.根据权利要求1所述的balb/c小鼠graves眼病模型的构建方法，其特征在于：重组质粒igf-1rα-pcdna
tm
3.1d/v5-his-topo的浓度为0.5-2μg/μl，每次的注射剂量为25-100μl。5.根据权利要求1所述的balb/c小鼠graves眼病模型的构建方法，其特征在于：注射次数为8-16次，每次注射的间隔2-4周。6.根据权利要求1所述的balb/c小鼠graves眼病模型的构建方法，其特征在于：电穿孔的参数为：电极针插入小鼠注射重组质粒的部位深度为0.5-10mm，优选为4-5mm；连续电击1-15次，优选为6次；电压为10-100v，优选为50v；频率为大于0且不大于50脉冲/秒，优选为5脉冲/秒；脉冲持续时长为10-500ms，优选为50ms；脉冲间隔为20-1000ms，优选为200ms。7.根据权利要求1所述的balb/c小鼠graves眼病模型的构建方法，其特征在于：balb/c小鼠为6-8周龄的balb/c小鼠。8.权利要求1-7任一所述的构建方法得到的balb/c小鼠graves眼病模型。9.权利要求8所述的balb/c小鼠graves眼病模型在作为研究graves眼病病因以及发病机制的动物模型中的应用。10.权利要求8所述的balb/c小鼠graves眼病模型在作为筛选治疗和/或预防graves眼病药物的动物模型中的应用。

技术总结
本发明提供了一种BALB/c小鼠Graves眼病模型及其构建方法和应用，所述构建方法为：将重组质粒pcDNA3.1/TSHR289及重组质粒IGF-1Rα-pcDNA


技术研发人员：郑薇 李宁 王萱 王深 谭建 申一鸣 贾强 于旸 李承霞
受保护的技术使用者：天津医科大学总医院
技术研发日：2023.08.09
技术公布日：2023/9/20