ZmENR1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用

zmenr1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用
技术领域
1.本发明属于植物生物技术育种领域，涉及雄性不育突变体基因enr1，以及zmenr1和其编码蛋白在玉米育性控制中的应用。


背景技术：

2.玉米（zea mays l.）是饲料和生物质燃料的重要来源。由于当前生产上应用的玉米品种几乎全为杂交种，因此优良杂交种的培育和生产显得尤为重要。常规杂交种制种过程中，需要经过人工去雄的过程，不仅耗费大量的人力物力和财力，还容易对植株造成机械损伤，并且去雄不彻底会有假杂种出现。玉米雄性不育系的出现，可以省去人工去雄的环节，使制种成本大大降低，提高玉米产量。雄性不育材料是研究玉米花粉和花药发育以及作物杂种优势利用和杂交制种的重要材料。以雄性不育系为母本进行杂交育种和制种，能加快新品种选育速度、提高制种产量和纯度、以及节约制种成本。不断创制新的稳定玉米雄性不育材料并鉴定新的雄性不育基因，可以推进玉米雄性不育化育制种在生产中广泛应用，最终实现提高玉米产量和节本增效。
3.导致植物雄性不育的因素多种多样，因此对植物雄性不育进行分类有着不同的标准。根据三型学说，雄性不育可分为三类：第一类是细胞质雄性不育（cms），控制不育性状的基因位于细胞质中的线粒体内；第二类是细胞核雄性不育（gms），控制不育性状的基因位于细胞核的染色体中；第三类是核质互作雄性不育，雄性不育的性状由染色体基因和线粒体基因共同控制。根据二型学说，植物雄性不育又分为细胞核雄性不育和核质互作雄性不育两种类型，而为了与细胞核雄性不育对应起来，研究人员将核质互作雄性不育称为细胞质雄性不育。cms是由线粒体基因和核基因共同控制的，虽然曾小面积应用于玉米杂交种生产，但由于不育胞质单一、易感病等问题突出，导致玉米cms不育至今不能像水稻cms在生产上得到有效应用。gms由核基因单独控制，可以克服cms缺陷，但很难通过常规育种方法大量繁殖纯合不育系。近年来，随着生物技术的进步，通过基因工程和分子设计育种相结合创制的玉米多控不育技术以及植物通用型显性不育技术，可以有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题。实现上述技术应用的重要前提是获得大量功能明确的控制玉米雄性发育的gms基因和对应的雄性不育材料。
4.本发明是以ems诱变获得的玉米雄性不育突变体enr1为材料，通过图位克隆鉴定了一个控制玉米雄花发育的zmenr1基因，并通过crispr/cas9技术获得3种enr1等位雄性不育突变体，为解析玉米雄花发育的分子机制提供了具有重要价值的遗传材料，并对提高玉米杂种优势利用提供了优异基因和关键种质资源。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供zmenr1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用，可以用来创制雄性不育系，应用于玉米杂交育种和制种，提高玉米杂种优势利用效率。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种玉米雄性育性基因zmenr1及其不育突变基因enr1，其特征在于，所述玉米雄性育性基因zmenr1核苷酸序列为seq id no.1，其编码蛋白zmenr1序列为seq id no.2；玉米雄性不育突变基因enr1，其特征在于，该突变是由野生型zmenr1基因第1个外显子的+84和+85位缺失2个碱基（gg）引起，该突变造成zmenr1蛋白翻译提前终止，蛋白长度只有29个氨基酸，这导致含有该突变核苷酸序列enr1突变体虽能正常抽雄，但不能正常开花，且花药明显较小和发白干瘪，最终表现为完全雄性不育表型；所述突变基因enr1的全长dna和氨基酸具体序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
7.在另一方面，本发明还提供了述zmenr1基因和zmenr1蛋白在培育雄性不育植物中的应用。
8.上述应用中所述的zmenr1基因为序列表中seq id no.1所示的dna分子，zmenr1蛋白是由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述的应用包括但不限于如下途径：（1）通过抑制或降低zmenr1基因的表达，获得玉米雄性不育系；（2）通过抑制zmenr1蛋白活性和/或含量，获得玉米雄性不育系。
9.在另一方面，本发明还提供了一种创制玉米enr1等位雄性不育突变体的方法，其特征在于，所述方法为基于crispr/cas9的基因编辑方法，对玉米基因组中的zmenr1基因进行定点突变，进而使其育性功能丧失，得到不同突变类型的玉米雄性不育系。
10.上述的crispr-cas9系统包含表达cas9蛋白的基因和sgrna的基因，所述sgrna的靶序列如seq id no.5和seq id no.6所示，均位于zmenr1基因的第1个外显子区域。
11.进一步本发明提供了玉米enr1的三种等位雄性不育突变体，其特征在于，enr1等位突变体包括zmenr1-cas9-1，zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3；其中，zmenr1-cas9-1在第1个外显子25 bp-37 bp处缺失13个碱基gtgcagatggtgg，在85 bp处缺失1个碱基g；zmenr1-cas9-2在第1个外显子31 bp-36 bp处缺失6个碱基atggtg，在85 bp处缺失1个碱基g；zmenr1-cas9-3在第1个外显子29 bp-31 bp处缺失3个碱基（aga），在85 bp处缺失1个碱基g。
12.在另一方面，本发明还提供了一种获得enr1雄性不育系的方法，其特征在于，将获得的enr1雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得enr1雄性不育的性状和基因突变。获得的enr1雄性不育系可以在杂交育种和制种中的应用。
13.本发明还提供了玉米enr1等位雄性不育突变体应用于玉米不育化育种和制种中的分子标记辅助选择方法；该方法包含如下3组功能标记：（1）针对玉米雄性不育突变体zmenr1-cas9-1的功能标记，其特征在于，所述功能分子标记引物zmenr1-f1和zmenr1-r1的序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示，该功能标记能同时区分野生型enr1基因和突变型enr1
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cas9-1基因；（2）针对玉米雄性不育突变体zmenr1-cas9-2的功能标记，其特征在于，所述功能分子标记引物zmenr1-f2和zmenr1-r2的序列分别如seq id no.9和seq id no.10所示，该功能标记能同时区分野生型enr1基因和突变型enr1
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cas9-2基因；（3）玉米雄性不育突变体zmenr1-cas9-3的功能标记，其特征在于，所述功能分子标记引物zmenr1-f3和zmenr1-r3的序列分别如seq id no.11和seq id no.12所示，该功能标记能同时区分野生型enr1基因和突变型enr1
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cas9-3基因。
14.本发明的优点及有益效果如下：zmenr1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用是
之前没有报道过的。本发明采用图位克隆方法，首先从获得的玉米雄性不育突变材料enr1中，分离了调控玉米雄花发育的新基因zmenr1，发现zmenr1突变造成不能正常开花，且花药明显较小和发白干瘪，最终表现为无花粉型的完全雄性不育。该基因的克隆为人工创制雄性不育系提供了资源和途径。本发明利用crispr/cas9基因编辑的方法定点突变zmenr1蛋白编码基因，可用于玉米育性控制和杂交种子生产。针对crispr/cas9编辑后获得的三个enr1等位雄性不育突变体开发的功能分子标记，可在玉米不育系育种和制种中应用于等位基因鉴定、目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。因此，本发明在玉米不育化育种和制种上具有重要意义，可以为玉米增产提供重要生物资源。
附图说明
15.图1为玉米野生型（wt）和突变体enr1的表型a和b：wt和突变体enr1的雄穗表型；c和d：wt和突变体enr1的花药表型；e和f：wt和突变体enr1的花药i
2-ki染色表型。
16.标尺=5cm（a、b）；2mm（c、d）；100μm（e、f）。
17.图2为玉米zmenr1基因的精细定位和图位克隆a，不育enr1群体dna与可育群体dna的多态性分子标记的分离比；b，f2群体中48个雄性不育株和48个雄性可育株用于玉米zmenr1基因的初定位，初步将zmenr1基因定位于4号染色体ssr标记 umc1926和umc1902之间；c，zmenr1基因精细定位于ssr标记 p2-2 和p2-4 之间，约111.45 kb的区间；d，精细定位区间内预测的4个基因模型；e，区间内4个候选基因通过玉米花药rna-seq数据进行表达谱分析，其中zm00001d049975在s7
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s9时期的花药中有表达峰，其它基因表达量很低或没有明显的表达峰；f，野生型和enr1突变体中zmenr1基因结构及测序分析。
18.图3为野生型（wt）和enr1突变体中zm00001d049975基因的序列比对图4为zmenr1基因在玉米花药不同发育时期中的表达模式分析s5，造孢细胞时期；s6, 小孢子母细胞时期；s7，减数分裂开始时期；s8a，减数分裂ⅰ，二分体时期；s8b，减数分裂ⅱ，四分体时期；s9，单核小孢子时期；s10，小孢子空泡化时期；s11，小孢子第一次不均等有丝分裂，二核小孢子时期；s12，小孢子第二次有丝分裂，三核小孢子时期。
19.图5为pcas9-zmenr1定点突变表达载体的物理图谱pcas9-zmenr1：从t-dna的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因bar的表达盒；核酸酶编码基因cas9的表达盒；zmenr1基因靶标2（mt2）的表达盒；靶标1（mt1）的表达盒。
20.图6为野生型zmenr1与zmenr1-cas9不育突变体的基因结构和dna序列分析野生型zmenr1（wt
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zmenr1）：基因全长3970 bp，包括11个外显子和10个内含子；enr1突变体zmenr1-cas9-1：在第1个外显子25 bp-37 bp处缺失13个碱基（gtgcagatggtgg）和85 bp处缺失1个碱基g；突变体zmenr1-cas9-2：在第1个外显子31 bp-36 bp处缺失6个碱基（atggtg）和85 bp处缺失1个碱基g；突变体zmenr1-cas9-3：在第1个外显子29 bp-31 bp处缺失3个碱基（aga）和85 bp处缺失1个碱基g。
21.图7为野生型（wt）与enr1三个等位纯合突变体的雄穗、花药和花粉粒表型分析第一排为玉米wt与zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3纯合突变体
雄穗的表型比较；第二排为wt及与zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3纯合突变体花药的表型比较；第三排为wt与zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3纯合突变体花粉粒的i
2-ki染色比较。
22.图8为利用共分离标记对zmenr1-cas9-1不育突变体的f2代植株进行基因分型共分离标记zmenr1-f1/r1对13株zmenr1-cas9-1不育突变体f2代植株的pcr和聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）鉴定结果：在纯合野生型（aa）植株中扩增出136 bp条带；在enr1/ enr1-cas9-1杂合型（aa）植株中扩增出136 bp和123 bp两条带；在enr1-cas9-1/enr1-cas9-1纯合突变型（aa）植株中扩增出123 bp条带。
23.图9为利用共分离标记对zmenr1-cas9-2不育突变体的f2代植株进行基因分型共分离标记zmenr1-f2/r2对11株zmenr1-cas9-2不育突变体f2代植株的pcr和聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）鉴定结果：在纯合野生型（aa）植株中扩增出135 bp条带；在enr1/ enr1-cas9-2杂合型（aa）植株中扩增出135 bp和129 bp两条带；在enr1-cas9-2/enr1-cas9-2纯合突变型（aa）植株中扩增出129 bp条带。
24.图10为利用共分离标记对zmenr1-cas9-3不育突变体的f2代植株进行基因分型共分离标记zmenr1-f3/r3对10株zmenr1-cas9-3不育突变体f2代植株的pcr和聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）鉴定结果：在纯合野生型（aa）植株中扩增出135 bp条带；在enr1/ enr1-cas9-3杂合型（aa）植株中扩增出135 bp和132 bp两条带；在enr1-cas9-3/enr1-cas9-3纯合突变型（aa）植株中扩增出132 bp条带。
具体实施方式
25.下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
26.实施例一：玉米雄性不育突变体enr1的获得通过筛选本实验室甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，ems）诱导的玉米自交系郑58突变体库，获得一个完全雄性不育的突变体，将其命名为enr1。该突变体的雄性不育性状在北京和海南三亚经过与野生型多代杂交均可稳定遗传，不受环境影响。在北京科技大学试验田和海南三亚等多地条件下观察和比较突变体与野生型整个生长周期植株形态，发现无明显差异，仅表现出雄性不育性状。
27.实施例二：植株表型鉴定及花粉育性观察enr1突变体在营养生长和雌穗发育方面，与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实， 而enr1突变体虽能正常抽雄，但是不能正常开花，花药颖壳不开裂，花药明显较小，并且发白干瘪不外露（图1）；进一步对野生型和突变体的花粉进行i
2-ki染色，发现野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，但突变体无花粉粒形成（图1）。
28.实施例三：zmenr1基因的定位、克隆和突变位点分析以自交系b73为父本与突变体enr1杂交，f1代育性正常，f2代出现育性分离，如表1
所示，f2群体中正常可育株（f）与不育株（s）的分离符合单基因3:1的分离比，即突变体的雄性不育表型表现为明显的单基因隐性遗传。
29.表1 玉米enr1突变体育性分离的遗传分析
f2群体植株总数育性植株数量不育植株数量f/s比x2值显著性检验,p》0.05enr1
×
b7312769343422.73:12.21(x
20.05
=3.84)ns*
挑选enr1
×
b73 f2群体中48个雄性不育株和48个雄性可育株，用于玉米zmenr1基因的初定位研究。所使用的ssr标记如表2所示，基因定位情况如图2所示。
30.表2 用于zmenr1基因定位的ssr标记引物名称引物序列(5'-3')umc1926-fatgccagcattcttcatcctacatumc1926-rtgaggcttggtccactaaagaaagumc123-fcacaaagagcagcccactttumc123-raagttgctgacatcgatccap1-1-fagagagaagaaagcgggtgcp1-1-racctgtcggcgctgccgcttcp1-2-fagcagcaggcaggcagatggp1-2-raactgctgctgctgctgaggp1-3-fttcgacgcgctctgagctcgp1-3-rcaatggggaaggcaaccgagp2-1-ftatcgtcggcgcgcaactcctcp2-1-racggtacgtagcgatgccgacp2-2-faaggctcccactccaagttcp2-2-rctttccgacacgtcggattgp2-3-fttgacttgacttatatggtgp2-3-rttaatgcggttagtgagtgcp2-4-ftaagcaatgataacacggctagp2-4-ragcccattgagaatggtaatcp2-5-facgtgttcgacgcgctctgagp2-5-raatggggaaggcaaccgagc
31.结果表明，zmenr1基因初步定位于4号染色体ssr标记umc1926和umc1902之间（图2b），进一步精细定位于标记p2-2 和p2-4之间约111.45 kb的区间（图2c），在此区间预测有4个候选基因（图2d）；利用玉米不同发育时期的花药rna-seq数据开展基因的表达谱分析，表明zm00001d049975在花药发育的s7-s9时期有表达峰，其它基因表达量很低或没有表达峰（图2e）。对zmenr1（zm00001d049975）和突变体基因进行克隆、测序分析，发现enr1突变体在+84~+85位置缺失2个碱基（gg）（图2f和图3），导致氨基酸移码突变，蛋白翻译提前终止（图2f）。zmenr1基因包含3970个核苷酸，包括11个外显子，编码一个酰基载体蛋白还原酶（enoyl-acyl-carrier-protein reductase），因此本发明将该基因命名为zmenr1。
32.实施例四：zmenr1的时空表达分析为了研究该基因与玉米雄性生殖发育的关系，本发明首先利用qpcr分析了该基因
在玉米花药发育不同阶段的表达模式。具体步骤如下：
33.1、玉米花药的取样与发育时期鉴定从玉米自交系b73处于不同发育阶段的雄穗中，按照花药的长度，收集不同长度的花药样品；每份样品采集20个长度相近的新鲜花药，其中3个固定在faa溶液中（coolaber，中国）通过树脂半薄切片实验确定具体的发育阶段，其余17个花药立即冷冻在液氮中，用于rna的提取。
34.利用梯度乙醇（50%、70%、90%、100%）对用于树脂切片的固定花药进行脱水，每步15-30分钟。脱水过程中花药可置于70%乙醇中长期保存；为便于后期包埋，可在90%乙醇中加入0.1%的伊红对材料进行染色；为保证脱水彻底，材料须在无水乙醇中脱水2-3次。随后进行树脂替换，将花药依次置于乙醇与spurr树脂体积比为3:1、1:1、1:3液体中2-4小时，最后置于纯树脂中过夜。树脂置换完成后，将花药置于模具中，加入200
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l spurr树脂，置于烘箱中，70℃聚合过夜。随后进行修块，然后可利用德国莱卡切片机进行切片，切片厚度为2
ꢀµ
m；用镊子夹取切好的片子，置于载玻片中央的无菌水中，42℃条件下展片过夜。将固定有样品的载玻片浸入0.1%的甲苯胺蓝染液中，染色1分钟，然后用去离子水冲洗，再置于展片台上，烘干后即可用于显微观察；也可以封片后长期保存。分析树脂切片的结果，根据玉米14个不同发育时期（stage1-stage14：s1-s14）的细胞学特点，确定每份样品的具体发育时期。
35.2、qpcr分析用trizol试剂（invitrogen，美国）提取上述鉴定的处于不同发育时期（s5-s12）的玉米花药总rna；然后使用5x all-in-one rt master mix （abm，加拿大）合成cdna；采用tb green
™
premix ex taq
™
（takara，日本）在quantstudio5 quantstudio 5 real-time pcr system （abi，美国）上进行定量逆转录聚合酶链反应检测，扩增引物为：qenr1-f（5
’‑
caatccagccaaccttacc-3’）和qenr1-r（5
’‑
ccatagacagcaggaaccaa-3’）；zmubiqutin为参照基因，其扩增引物为：ubiqutin-f（5
’‑
cgacaacgtgaaggcgaaga-3’）和ubiqutin-r（5
’‑
acgcagatacccaggtacagc-3’）；每个发育时期包括三个生物学重复，每个样品有三个技术重复；数据用2-δδct
方法进行分析，并以均值
±
标准差（means
±
sd）的形式给出定量结果。
36.zmenr1基因呈现花药发育时期特异表达的模式：在玉米花药发育的早期比如s5和s6时期有较低表达，随后从s7时期开始上升， s9时期表达量最高，随后在s10时期开始减弱（图4）。
37.实施例五：zmenr1基因的功能验证和利用crispr/cas9方法创制玉米雄性不育突变体为了明确玉米zmenr1在玉米中的功能，本发明采用crispr/cas9基因编辑方法突变zm00001d049975 基因序列，敲除该基因在玉米中的功能。本发明选取玉米杂交种hi ii作为基因编辑的受体材料。本发明分别选取基因保守区的seq id no.5和seq id no.6所示序列作为crispr/cas9基因编辑的靶标区域。
38.1、zmenr1的crispr/cas9基因编辑载体的构建本发明的基因编辑载体为pbue411-mt1t2-cas9，该载体的基础载体为pbue411-cas9，中间载体为pcbcmt1t2，提供grna。本发明通过在引物上设计靶点然后通过pcr获得mt-sgrna进而通过酶切连接到基础载体中，具体的构建流程如下：
（1）靶标grna的设计。将zmenr1（zm00001d049975）的基因序列输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr2/crispr进行靶标设计。本发明选择的两个靶标区域的dna序列如seq id no.5和seq id no.6所示。本发明的sgrna骨架序列从中间载体pcbcmt1t2直接扩增获得。
39.（2）通过在引物上设计靶点然后pcr扩增获得mt-sgrna。引物zmenr1-mt1-f和引物zmenr1-mt2-r扩增中间载体pcbcmt1t2，用于获得包含第一个和第二个靶标的sgrna的片段，产物长度为965 bp。pcr 体系和条件如下：模板dna （中间载体pcbcmt1t2≥30 ng/μl）1.2 μl；primer f/r：各1.2 μl；灭菌ddh2o：11.4 μl；2x mclab 酶（产品编号：i5hm-200）：15 μl。pcr的温度程序如下：
①
98 ℃ 2分钟；
②
98 ℃ 10秒；
③
58 ℃ 30秒；
④
72 ℃ 30秒；
⑤ꢀ
从
②
－
④
循环34次；
⑥ꢀ
72 ℃ 5分钟；
⑦ꢀ
25 ℃ 10分钟。最后回收pcr产物。载体构建所需的引物序列如下：zmenr1-mt1-f: 5
’‑
atatatggtctctggcgagctgctggtgtgcagatgggttttagagctagaaatagcaa-3’zmenr1-mt2-r: 5
’‑
attattggtctctaaaccacgggtttctaggactgatgcttcttggtgccgc-3’（3）通过酶切连接构建到骨架载体。将pbue411-cas9载体和回收的带有靶标的sgrna片段用bsai消化，同时加入t4连接酶将载体和sgrna片段连接。10 μl的酶切连接体系如下，sgrna片段：1 μl，pbue411-cas9载体（≥60 ng/μl) ：1 μl，10 x neb buffer：1 μl，bsai内切酶（产品编号：#r3733s ）：0.5 μl，t4 连接酶（产品编号：#m0202m ）：0.25 μl，灭菌ddh2o：6.25 μl。
40.图5所示为目的基因zmenr1（zm00001d049975）的双靶标（对应第一个靶标和第二个靶标），标记基因cas9和bar与骨架载体pbue411-cas9构建的表达载体pcas9-zmenr1。
[0041] 2、农杆菌介导的玉米遗传转化将上述构建的pcas9-zmenr1载体分别通过热激法转入农杆菌eha105中，pcr进行鉴定；然后以1:1的体积农杆菌和甘油混合于-80 ℃保存菌液。以新鲜剥离的1.8 mm左右的玉米杂交种hi ii的幼胚作为受体材料，将剥离的玉米胚放入含有1.8 ml悬浮液的2 ml塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43 ℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0 ml的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23 ℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28 ℃培养7-14天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5 mg/l bialaphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2 mg/l bialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28 ℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28 ℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25 ℃，5000 lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25 ℃，5000 lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
[0042] 3、t0代植株crispr/cas9突变结果检测为确定t0代植株crispr/cas9突变结果，采取如下步骤进行：本发明首先采用ctab法提取玉米叶片dna，具体方法如下：剪取2厘米左右长度的幼苗叶片，放入装有钢珠的2 ml离心管；将装有叶片的离心管放入液氮浸没5分钟，然后利用研磨仪打碎叶片样品；向离心管中加入500 μl ctab提取缓冲液（其中含有1%的β-巯基乙醇），并用力震荡混匀， 65 ℃恒温水浴中预热20-30 min，（期间取出颠倒1-2次，并注意实验样品编号的对应）；离心管冷却至室温后加入500 μl氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，用力摇晃30s之后在室温条件下静置片刻；在4 ℃条件下，以12000 rpm速度离心5 min，取离心完成后的500 μl上清液于新的1.5 ml离心管中；将等体积的异丙醇加入到盛有上清液的离心管中轻轻震荡混匀，室温条件下静置10 min左右；随后将盛有样品的离心管放入4 ℃离心机中，以12000 rpm速度离心10 min之后，轻轻吸取上清液，弃上清，保留沉淀；加入800 μl 75 %乙醇，洗涤沉淀两次，以10000 rpm速度离心5 min，弃掉上清；将样品放置在室温下自然干燥2-4小时，得到dna沉淀，加入适量无菌水溶解，轻微震荡，充分溶解dna。dna样品存于-20 ℃保存。用nanodrop检测dna浓度，稀释至10 ng/l用作pcr模板。
[0043]
然后根据zmenr1（zm00001d049975）基因序列设计pcr引物。
[0044]
检测靶标：mt1和mt2；产物大小：275 bp；引物序列如下：zmenr1-t-f1: 5
’‑ꢀ
aatgttcttgtagccgtagtga-3’；zmenr1-t-r1: 5
’‑ꢀ
tgctcttacaacaacatcattgcg-3’。
[0045]
提取基因组dna，按照以下pcr参数扩增：反应体系：15 μl mix常规pcr体系，0.5 μl forward primer，0.5 μl reverse primer，1 μl dna，5.5 μl 灭菌ddh2o，7.5 μl 2x taq mix（产品编号：10103es ）。
[0046]
反应程序：常规pcr：58 ℃退火、延伸30 s、32轮循环。
[0047]
接着将pcr产物回收并连接t载体测序，通过测序多个t0代独立阳性转化事件靶标区域的dna序列，明确靶标区域是否发生基因编辑，最终发现3个t0转化事件靶标区域序列发生了变化，且均为纯合突变，编辑前后的序列如图6所示，对应3个enr1等位纯合突变体：zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3。与野生型序列比对显示，zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3均在靶标1和2处发生了缺失突变。
[0048]
对3个enr1等位突变体中氨基酸序列进行比对分析发现，与未编辑的wt相比，突变后的品系zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3，其编码的核苷酸在靶标1或2处的缺失使其氨基酸发生了移码突变，且随后的氨基酸发生提前终止。因此这些转化体中zm00001d049975蛋白的功能均呈现缺失。
[0049] 4、f1代植株的基因分型由于在温室生长的玉米t0代植株，经常雌穗和雄穗发育不协调，同时当编辑的基因与雄性发育相关时也会影响育性，因此为了繁殖t0代植株，并使获得的基因编辑类型遗传下去，本发明使用玉米自交系郑58的野生型花粉为上述获得的zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3的t0代植株授粉，进而获得f1代种子，生长的植株为f1代植株。
[0050]
f1代植株包括2种分离类型，一种为cas9-阳性植株（转基因植株），另一种为cas9-阴性植株（非转基因植株），为了避免sgrna和cas9对杂交授粉引入的郑58野生型等位基因进行持续编辑，从而造成突变类型的复杂性，我们需要通过基因分型从f1代植株中挑选出
不含有cas9基因，但含有t0代突变类型的植株，这类植株自交后可以得到非转基因的f2代。f1代植株的基因分型步骤如下：按照上述的ctab法提取叶片dna后，首先利用cas9基因的特异引物cas9-f（5
’‑
cccggacaatagcgatgt-3）和cas9-r（5
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gagtgggccgacgtagta-3’）进行pcr扩增。pcr反应体系同上；反应程序：常规pcr：58℃退火、延伸1分钟、32轮循环。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳后，根据结果区分出cas9-阳性植株和cas9-阴性植株。
[0051]
进一步针对cas9-阴性植株，采用上述的检测mt1和mt2靶标的引物zmenr1-t-f1 和zmenr1-t-r1，进行pcr扩增；pcr产物纯化后，连接t载体，进行测序；根据测序结果分析确定t0代突变类型的遗传情况。
[0052]
实施例六：玉米zmenr1-cas9雄性不育突变体的表型分析上述实施例六鉴定的不含有cas9基因的f1代植株自交后获得f2代种子，三种突变类型（zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3）各取1个自交单穗进行穗行播种，在成熟期进行表型的调查。三种f2株系中，可育株与不育株的比例，均符合3:1分离，进一步表明zmenr1-cas9不育突变体的不育性状由单个隐性基因控制，然后针对f2代获得的稳定非转基因zmenr1-cas9不育突变体与野生型进行详细的雄穗、花药和花粉活力的观察。
[0053]
在营养生长和雌穗的发育方面，zmenr1-cas9-1、zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3不育突变体的植株与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实，而三个zmenr1-cas9不育突变体虽能正常抽雄，但是不能正常开花，花药颖壳不开裂，花药明显较小，并且发白干瘪不外露（图7）；进一步对野生型和突变体的花粉进行i
2-ki染色，发现野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，但突变体无花粉粒形成（图7）。这表明zmenr1（zm00001d049975）基因控制玉米的雄性发育，通过基因编辑方法创制的zmenr1-cas9不育突变体为无花粉型不育系，呈现完全败育的特点。
[0054]
实施例七：zmenr1-cas9不育体鉴定的共分离功能分子标记开发和应用
[0055] 1、共分离分子标记的开发在本发明中，针对获得的三种zmenr1-cas9不育突变体的突变位点，利用primer 5.0软件进行引物设计，开发出三对共分离功能分子标记：zmenr1-f1/r1、zmenr1-f2/r2和zmenr1-f3/r3，结合pcr与聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）或琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小即可分离出突变体的基因型。
[0056]
共分离分子标记zmenr1-f1/r1包括第一引物zmenr1-f1和第二引物zmenr1-r1；该标记能够特异性检测玉米zmenr1-cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因enr1-cas9-1，并能同时区分野生型enr1基因和突变型enr1-cas9-1基因；针对突变基因enr1-cas9-1中扩增出123 bp的条带，而对野生型enr1基因扩增出136 bp的条带。引物序列如下：zmenr1-f1：5
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ctggataggttagttggcattga
ꢀ‑3’
zmenr1-r1：5
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gagcatgcaatcagtcctaga
ꢀ‑3’
共分离分子标记zmenr1-f2/r2包括第一引物zmenr1-f2和第二引物zmenr1-r2，该标记能够特异性检测玉米zmenr1-cas9-2突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因enr1-cas9-2，并能同时区分野生型enr1基因和突变型enr1-cas9-2基因；针对突变基因enr1-cas9-2中扩增出129 bp的条带，而对野生型enr1基因扩增出135 bp的条带。引物序列
如下：zmenr1-f2：5
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tggataggttagttggcattga
ꢀ‑3’
zmenr1-r2：5
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gagcatgcaatcagtcctag
ꢀ‑3’
共分离分子标记zmenr1-f3/r3包括第一引物zmenr1-f3和第二引物zmenr1-r3，该标记能够特异性检测玉米zmenr1-cas9-3突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因enr1-cas9-3，并能同时区分野生型enr1基因和突变型enr1-cas9-3基因；针对突变基因enr1-cas9-3中扩增出132 bp的条带，而对野生型enr1基因扩增出135 bp的条带。引物序列如下：zmenr1-f3：5
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tggataggttagttggcattg
ꢀ‑3’
zmenr1-r3：5
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gagcatgcaatcagtccta
ꢀ‑3’
[0057] 2、共分离分子标记的应用为了验证上述标记的有效性，以实施例六中获得的f2株系为材料，进行enr1等位基因的检测。dna提取方法、pcr扩增体系和条件同实施例二，pcr产物进行page或琼脂糖凝胶电泳分离。
[0058]
理论上，zmenr1-f1/r1、zmenr1-f2/r2和zmenr1-f3/r3在enr1/ enr1纯合野生型（aa）dna中能分别扩增出136 bp、135 bp和135的条带，在enr1/ enr1纯合突变型材料（aa）dna中分别扩增出123 bp、129 bp和132 bp的条带，而在enr1/enr1杂合型（aa）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。zmenr1-f1/r1、zmenr1-f2/r2和zmenr1-f3/r3 分子标记的验证结果如图8、图9和图10所示，结果显示设计的3个功能性分子标记对f2植株的检测结果完全符合预期，在enr1/ enr1纯合野生型（aa）、enr1/ enr1杂合型（aa）和enr1/ enr1纯合突变型材料（aa）中分别扩增出对应大小的条带，可以作为enr1，enr1等位基因检测的理想标记。
[0059]
这些分子标记有助于在开花和授粉前确定突变基因型，以便在不同遗传背景下进行杂交和回交选育雄性不育系，具有重要的应用价值。

技术特征：
1.一种玉米雄性育性基因zmenr1，其特征在于，所述玉米雄性育性基因zmenr1位于4号染色体，其核苷酸序列为seq id no.1，其编码蛋白序列为seq id no.2。2.一种玉米雄性不育突变基因enr1，其特征在于，所述玉米雄性不育突变基因enr1由权利要求1所述玉米育性基因zmenr1突变获得，其突变位点位于zmenr1基因第1个外显子，在+84和+85位缺失2个碱基gg；所述突变基因enr1的全长dna序列为seq id no.3，其编码的氨基酸序列为seq id no.4。3.一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，抑制权利要求1所述zmenr1基因的表达和/或活性，选择玉米雄性不育的植株。4.根据权利要求3所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，抑制基因表达和/或活性的方法包括基因编辑、rna干扰中任一种。5.根据权利要求4所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，所述基因编辑为基于crispr/cas9的基因编辑方法。6.根据权利要求5所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，所述crispr-cas9系统包含表达cas9蛋白的基因和sgrna的基因，所述sgrna的靶序列如seq id no.5和seq id no.6所示，均位于zmenr1基因的第1个外显子区域。7.根据权利要求6所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，所述玉米雄性不育系包括zmenr1-cas9-1，zmenr1-cas9-2和zmenr1-cas9-3三种玉米等位雄性不育突变体；其中，zmenr1-cas9-1在第1个外显子25 bp-37 bp处缺失13个碱基gtgcagatggtgg，在85 bp处缺失1个碱基g； zmenr1-cas9-2在第1个外显子31 bp-36 bp处缺失6个碱基atggtg，在85 bp处缺失1个碱基g；zmenr1-cas9-3在第1个外显子29 bp-31 bp处缺失3个碱基aga，在85 bp处缺失1个碱基g。8.一种获得enr1雄性不育系的方法，其特征在于，通过权利要求3、4、5、6和7之任一所述方法获得的enr1雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得enr1雄性不育的性状和基因突变。9.通过权利要求8所述的方法获得的enr1雄性不育系在杂交育种和制种中的应用。10.根据权利要求9所述玉米enr1雄性不育系在杂交育种和制种中的应用，其特征在于，针对玉米突变等位基因enr1设计3组功能标记，用于杂交育种和制种中分子标记辅助选择：（1）针对玉米雄性不育突变体zmenr1-cas9-1的功能标记，所述功能标记引物zmenr1-f1和zmenr1-r1的序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示；（2）针对玉米雄性不育突变体zmenr1-cas9-2的功能标记，所述功能标记引物zmenr1-f2和zmenr1-r2的序列分别如seq id no.9和seq id no.10所示；（3）玉米雄性不育突变体zmenr1-cas9-3的功能标记，所述功能标记引物zmenr1-f3和zmenr1-r3的序列分别如seq id no.11和seq id no.12所示。

技术总结
本发明公开了玉米ZmENR1基因及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用。本发明通过EMS诱变获得的雄性不育突变体enr1，鉴定出一个控制玉米雄花发育的ZmENR1基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。进一步通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在野生型玉米中定点突变该基因，创制出三个雄花完全败育的等位突变体，对玉米育性控制和杂交种子生产具有重要意义。本发明还针对enr1的三个等位雄性不育突变体设计了功能分子标记，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要应用价值。记辅助选择中具有重要应用价值。记辅助选择中具有重要应用价值。


技术研发人员：万向元 安学丽 张少伟 江易林 易仑 吴锁伟 魏珣 龙艳 侯全璨 李金萍
受保护的技术使用者：北京科技大学 北京中智生物农业国际研究院
技术研发日：2023.08.11
技术公布日：2023/9/20