一种恒温条件下检测猴痘病毒的引物组及冻干试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种恒温条件下检测猴痘病毒的引物组及冻干试剂盒。


背景技术：

2.环介导等温扩增法，英文名称为loop-mediated isothermal amplification（lamp），是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶（bst dna polymerase）的作用下，60-65 ℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109～10
10
倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。该技术主要是利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的dna聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，让引物可以在等温条件下顺利结合上去进行链置换扩增反应，克服了传统pcr反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，并大大节省了反复升降温的时间，从而实现在恒温条件下进行连续的快速扩增，其灵敏度和扩增产物的量比pcr高出1个数量级。同时因为两对引物针对靶基因6个区域，使lamp具有极高的扩增在dna合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物（dntps）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。当前，lamp已在临床病原微生物检测、遗传病诊断、snp分型、传染病监测和转基因食品鉴定等领域显示出了巨大的应用潜力并正得到日益广泛的应用。
3.猴痘是一种病毒性人畜共患病，由猴痘病毒（monkeypox virus，mkxv）引起，能够在动物和人类之间传播，在人类之间也可以进行二次传播。病毒经黏膜和破损皮肤侵入人体。主要通过接触感染动物的呼吸道分泌物、病变渗出物、血液、其它体液，或被感染动物咬伤、抓伤而感染。人与人之间主要通过密切接触传播，亦可在长时间近距离接触时通过飞沫传播，接触病毒污染的物品也有可能感染。病毒还可通过胎盘从孕妇传播给胎儿。该病毒动物宿主包括一系列啮齿动物，如松鼠、冈比亚袋鼠、睡鼠和非人类灵长类动物。猴痘病毒是一种包膜双链dna病毒，呈长方形，可在非洲绿猴肾细胞中培养生长，导致细胞病变，属痘病毒科的正痘病毒属，抵抗乙醚，对干燥有较强抵抗力，但易被氯仿、甲醇和福尔马林灭活。56 ℃加热30分钟，也易使其灭活。
4.中国发明专利申请cn102839224a公开了一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂及等温扩增检测猴痘病毒的方法，该专利是利用lamp法检测猴痘病毒。在该检测过程中存在以下几方面问题：1、检测时间长，需要90 min才能完成检测；2、灵敏度较低，只能检测至2.76
×
10
4 cp/ml的质粒；3、检测试剂为液体试剂，不易运输及储存。
5.中国发明专利申请cn 115961092 a公开了一种用于检测猴痘病毒的环介导等温扩增引物组合及其应用，该专利是利用lamp法检测猴痘病毒，通过显色法来观察结果，肉眼辨别误差较大，最短反应时间需要40min，检测灵敏度较低，只能检测至为2
×
100cp/μl，检测试剂为液体试剂，不易储存及运输。
6.中国发明专利申请cn 115948612 a公开了一种检测猴痘病毒的引物探针组合、试剂盒、方法及应用，该专利采用的是lamp探针法，针对猴痘病毒的opg002基因和ati基因设计引物及探针，最短反应时间需要40min，1cp/μl的模板不能稳定检出，检测试剂为液体试剂，不易储存及运输。
7.基于目前市面上较少检测猴痘病毒的lamp引物组及冻干试剂盒。本发明提供了一种恒温快速检测检测猴痘病毒的lamp引物组以及冻干试剂盒和检测方法，该试剂盒具有lamp检测的优点，可实现常温储存及运输，仅需20 min即可完成检测，灵敏度可检至10
3 cp/ml，对于快速筛查猴痘病毒及口岸输入性疾病筛查具有着重要的意义，能够为防御疾病的传入做好技术支撑和战略储备，满足当前卫生检疫的需求。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种用于快速恒温检测猴痘病毒的引物组合及冻干试剂盒，本发明试剂盒是一种用于检测猴痘病毒的lamp冻干试剂盒。在有效地对猴痘病毒进行检测，确保准确性、特异性和敏感性高、重复性好的同时，能在短时间内完成检测获得结果，并且可常温运输和保存。
9.本发明为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：一种恒温条件下检测猴痘病毒的引物组，包括猴痘病毒的上游外引物、猴痘病毒的下游外引物、猴痘病毒的上游内引物以及猴痘病毒的下游内引物。所述猴痘病毒的上游外引物具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的下游外引物具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的上游内引物具有如seq id no.3所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的下游内引物具有如seq id no.4所示的核苷酸序列。具体序列如下：seq id no.1：5
’‑
：tactaggccccactgatt-3’（mpxv-f3）；seq id no.2：5
’‑
：gagaagttaataaagct-3’（mpxv-b3）；seq id no.3：5
’‑
：ctctcctagttatttgacagt-3’（mpxv-fip）；seq id no.4：5
’‑
：ttcaacgtagtgctatggttt-3’（mpxv-bip）；一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，包括lamp冻干检测试剂和质控试剂；所述的lamp冻干检测试剂为lamp冻干反应管，所述的lamp冻干反应管中包括以下组分：检测引物、bst dna聚合酶、反应buffer、dntp、mg
2+
和染料、冻干保护剂。
10.所述检测引物包括mpxv-f3、mpxv-b3、mpxv-fip、mpxv-bip；所述引物mpxv-f3的浓度为0.1-20 μm，优选为1.4 μm；所述引物mpxv-b3的浓度为0.1-20 μm，优选为1.4 μm；所述引物mpxv-fip的浓度为0.1-20 μm，优选为0.25 μm；所述引物mpxv-bip的浓度为0.1-20 μm，优选为0.25 μm。
11.所述冻干保护剂包括以下组分：葡聚糖、bsa、pvp、peg和ploy a；各组分质量百分含量如下：葡聚糖5～15％、bsa（即牛血清白蛋白） 0.5～5%、pvp（即聚乙烯吡咯烷酮）0.1～2%、peg（即聚乙二醇）0.5～5%、ploy a（即多聚腺苷酸）8~20%。
12.所述bst dna聚合酶：酶活为8 u，购自南京诺唯赞生物技术有限公司；所述反应buffer：用量为2.5 μl，购自南京诺唯赞生物技术有限公司；所述dntp：浓度为20 mm，购自北京索莱宝科技有限公司；
所述mg
2+
：浓度为6.25 mm，购自南京诺唯赞生物技术有限公司；所述染料为eva green ，用量为0.425 μl，购自biotium；质控试剂包括阳性质控和阴性质控；所述的阳性质控为浓度为1
×
107copies/ml猴痘病毒人工合成质粒的冻干粉末；使用时，只需添加500 μl阴性质控即可成为工作浓度；所述的阴性质控为te buffer。
13.本发明所有引物及质粒均来自于通用生物（安徽）股份有限公司。
14.所述的猴痘病毒人工合成质粒的序列如seq id no. 5所示：seq id no. 5：tcagaatctaatgatgacataactaagaagtttatctacagccaatttagctgcattatttttagcatctcgtttagattttccatctgccttatcgaatactcttccgtcaatgtctacacaggcataaaatgtaggagagttactaggccccactgattcaatacgaaaagaccaatctctcctagttatttgacagtactcattaataacggtgacagggttaacacctttccaataaataatttttttaaccggaataacatcatcaaaagacttatgatcctctctcattgatttttcgcgggatacatcatctattatagcatcagcatcagaatctgtaggccgtgtatcagcatccattgtcgtagaccaacgaggaggagtatcgttggagctgtaaaccatagcactacgttgaagatcatacagagctttattaacttctcgcttctccat上述lamp扩增检测的程序包括：60-65 ℃，15-60 min。优选为65 ℃，20 min。
15.本发明相比现有技术具有以下有益效果：在有效地对猴痘病毒进行检测，确保准确性、特异性和敏感性高、重复性好的同时，能在20min内完成检测获得结果，检测温度为恒温65℃，并且可常温运输和保存，避免了试剂被反复冻融，检测结果更稳定。本发明操作简便，只需要将阳性质控溶解，向冻干试剂中加入相应量的提取后的核酸作为稀释液即可直接扩增检测。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
17.图1为实施例2中猴痘病毒lamp冻干反应管照片。
18.图2为实施例3中猴痘病毒f3l基因lamp检测结果图。
19.图3为实施例4中梯度浓度的猴痘病毒人工合成质粒的扩增结果图。
20.图4为实施例5中猴痘病毒人工合成质粒特异性检测结果图。
21.图5为实施例6中猴痘病毒冻干试剂重复性实验的试剂盒1检测结果图。
22.图6为实施例6中猴痘病毒冻干试剂重复性实验的试剂盒2检测结果图。
23.图7为实施例6中猴痘病毒冻干试剂重复性实验的试剂盒3检测结果图。
具体实施方式
24.实施例1
25.一种检测猴痘病毒的lamp引物组合通过对比目标病原体的核苷酸序列，选取其中高度保守且具有特异性的基因部
位，并从ncbi（美国国家生物信息中心）下载相关序列（mpxv-f3l基因），然后使用primerexplorer进行引物设计。筛选后得到以下序列：猴痘病毒的上游外引物：5
’‑
：tactaggccccactgatt-3’（简称mpxv-f3）；猴痘病毒的下游外引物：5
’‑
：gagaagttaataaagct-3’（简称mpxv-b3）；猴痘病毒的上游内引物：5
’‑
：ctctcctagttatttgacagt-3’（简称mpxv-fip）；猴痘病毒的下游内引物：5
’‑
：ttcaacgtagtgctatggttt-3’（简称mpxv-bip）；所示引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。
26.实施例2
27.一种检测猴痘病毒的冻干试剂盒将实施例1的引物组合物进行试剂冻干。
28.本试剂盒包括：lamp冻干反应管、阳性质控、阴性质控。
29.所述的lamp冻干反应管中的组分为：引物、bst dna聚合酶、反应buffer、dntp、mg
2+
和染料、冻干保护剂。所述冻干保护剂的组分为：葡聚糖、bsa、pvp、peg和ploy a。
30.将上述冻干反应管的组分混合并用真空冷冻干燥机进行冻干，获得lamp冻干反应管，得到的猴痘病毒lamp冻干反应管如附图1所示。
31.所述引物由猴痘病毒的上游外引物、猴痘病毒的下游外引物、猴痘病毒的上游内引物、猴痘病毒的下游内引物组成。所述猴痘病毒的上游外引物：即mpxv-f3，浓度为1.4 μm；所述猴痘病毒的下游外引物：即mpxv-b3，浓度为1.4 μm；所述猴痘病毒的上游内引物：即mpxv-fip，浓度为0.25 μm；所述猴痘病毒的下游内引物：即mpxv-bip，浓度为0.25 μm。
32.所述bst dna聚合酶：酶活为8 u；所述反应buffer：用量为2.5 μl；所述dntp：即脱氧核糖核苷三磷酸，浓度为20 mm；所述mg
2+
：浓度为6.25 mm；所述染料：为核酸染料eva green ，用量为0.425 μl；所述冻干保护剂中的各组分质量百分含量如下：葡聚糖10%、bsa 1%、pvp 0.5%、peg 1%、ploy a10%，采用无菌无酶水将所有组分进行溶解。
33.所述的阳性质控：将猴痘病毒人工合成质粒稀释至终浓度为1
×
10
7 copies/ml，采用真空冷冻干燥机进行冻干，获得冻干粉末，即为阳性质控。
34.所述的阴性质控为te buffer。
35.所述猴痘病毒人工合成质粒：来源于通用生物（安徽）股份有限公司；所述te buffer：来源于生工生物工程(上海)股份有限公司；所述真空冷冻干燥机：型号为ctfd-30。
36.实施例3
37.一种检测猴痘病毒的冻干试剂盒的应用一种检测猴痘病毒的冻干试剂盒的应用，即使用实施例1提供的引物组合物制备得到的冻干试剂盒（即实施例2的冻干试剂盒）进行猴痘病毒的检验。
38.试剂盒采用te buffer为阴性质控，采用1
×
10
7 copies/ml的猴痘病毒人工合成质粒冻干粉末为阳性质控。
39.待测核酸样本：将1ml 1
×
10
7 copies /ml的猴痘病毒人工合成质粒制成的冻干
粉末中加入500 μl te buffer，稀释后得到核酸样本。
40.向lamp冻干反应管中添加25 μl模板，所述模板量为加入的待测核酸样本的量。
41.lamp反应程序如下：65℃，20 min。
42.猴痘病毒f3l基因lamp检测结果如图2所示。
43.实施例4
44.灵敏度检测实验将猴痘病毒人工合成质粒10倍梯度稀释至10
6 copies/ml、 10
5 copies/ml、10
4 copies/ml、103copies/ml、102copies/ml。
45.采用实施例2的冻干试剂盒分别对梯度稀释的猴痘病毒人工合成质粒进行检测，检测方法如实施例3所示。浓度为10
6 copies/ml、 10
5 copies/ml、10
4 copies/ml、103copies/ml、102copies/ml的猴痘病毒人工合成质粒的扩增结果如图3所示。
46.由图3可见，猴痘病毒人工合成质粒的最低检测浓度为103copies/ml，且检出率在100％，即为检测限浓度。
47.实施例5
48.特异性检测实验本实验例进行检测试剂盒的特异性实验，试剂盒采用25 μl的反应体系，反应体系如下：将25 μl的模板添加至冻干反应管中，65 ℃反应20 min。
49.将猴痘病毒人工合成质粒标记为样品1；将核酸提取试剂提取后的羊痘疫苗dna标记为样品2；将核酸提取试剂提取后的鸽痘疫苗dna标记为样品3；将核酸提取试剂提取后的鸡痘疫苗dna标记为样品4；将核酸提取试剂提取后的水痘疫苗dna标记为样品5。
50.采用实施例2的冻干试剂盒按照实施例3的方法分别对样品1-5进行检测， lamp反应后得到的检测结果图如图4所示。
51.从图4可以看出，检测试剂盒检测羊痘疫苗dna、鸽痘疫苗dna、鸡痘疫苗dna、水痘疫苗dna，均没有扩增；检测猴痘病毒人工合成质粒有明显扩增；可见本发明检测猴痘病毒的特异性好。
52.实施例6
53.重复性实验随机抽取三盒猴痘病毒冻干试剂盒，分别标记为试剂盒1、试剂盒2、试剂盒3；分别取试剂盒中阳性质控及阴性质控作为模板。
54.分别取25μl阳性质控、阴性质控加入冻干试剂中，65℃反应20min，实验结果见图5、6、7，比较实验结果之间的差异。
55.从实验结果可以看出，三盒试剂盒对阳性质控正常扩增，起峰时间一致，阴性质控未扩增，三盒试剂性能一致，可见本发明试剂盒重复性好。
56.除特殊说明外，本发明所述的百分数均为质量百分数，所述的比值均为质量比。
57.以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域技术人员在不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

技术特征：
1.一种恒温条件下检测猴痘病毒的引物组，其特征在于：包括猴痘病毒的上游外引物、猴痘病毒的下游外引物、猴痘病毒的上游内引物以及猴痘病毒的下游内引物；所述猴痘病毒的上游外引物具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的下游外引物具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的上游内引物具有如seq id no.3所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的下游内引物具有如seq id no.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：seq id no.1：5
’‑
：tactaggccccactgatt-3’；seq id no.2：5
’‑
：gagaagttaataaagct-3’；seq id no.3：5
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：ctctcctagttatttgacagt-3’；seq id no.4：5
’‑
：ttcaacgtagtgctatggttt-3’。2.一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，其特征在于：包括lamp冻干检测试剂和质控试剂；所述的lamp冻干检测试剂包括具有如seq id no .1
‑ꢀ
seq id no .4所示核苷酸序列的引物组合。3.根据权利要求2所述的一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，其特征在于：所述引物组合：猴痘病毒的上游外引物的浓度为0.1-20 μm；猴痘病毒的下游外引物的浓度为0.1-20 μm；猴痘病毒的上游内引物的浓度为0.1-20 μm；猴痘病毒的下游内引物的浓度为0.1-20 μm。4.根据权利要求2所述的一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，其特征在于：所述的lamp冻干检测试剂还包括bst dna聚合酶、反应buffer、dntp、mg2+和染料、冻干保护剂。5.根据权利要求4所述的一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，其特征在于：所述的冻干保护剂包括以下组分：葡聚糖、bsa、pvp、peg和ploy a。6.根据权利要求2所述的一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，其特征在于：所述的质控试剂包括阳性质控和阴性质控；所述的阳性质控为浓度为1
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107copies/ml猴痘病毒人工合成质粒的冻干粉末。7.根据权利要求6所述的一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，其特征在于：所述的阴性质控为te buffer。8.根据权利要求2所述的一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，其特征在于：lamp扩增检测的程序包括：60-65 ℃，15-60 min。9.根据权利要求8所述的一种冻干型猴痘病毒lamp检测试剂盒，其特征在于：lamp扩增检测的程序包括65 ℃，20 min。

技术总结
本发明提供一种恒温条件下检测猴痘病毒的引物组及冻干试剂盒，引物组包括猴痘病毒的上游外引物、猴痘病毒的下游外引物、猴痘病毒的上游内引物以及猴痘病毒的下游内引物。所述猴痘病毒的上游外引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的下游外引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的上游内引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述猴痘病毒的下游内引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。在有效地对猴痘病毒进行检测，确保准确性、特异性和敏感性高、重复性好的同时，能够在恒温条件下检测，20min内完成检测获得结果。完成检测获得结果。完成检测获得结果。


技术研发人员：杨帆 黄晶 于明明 田永帅 刘嘉男 陈娇
受保护的技术使用者：青岛汉唐生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.16
技术公布日：2023/9/20