一种携带杀伤开关的间充质干细胞及其在肿瘤治疗中的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术研发领域，具体提供了一种携带杀伤开关的间充质干细胞及其在肿瘤治疗中的应用。


背景技术：

2.肿瘤已经成为威胁人类健康的最大“杀手”，截止目前研究人员已经开发出了多种治疗恶性肿瘤的手段，其中化学药物治疗最为普遍，也是应用最广的疗法。化疗药物能够杀死肿瘤中的大多数细胞，但是长期使用会产生肿瘤耐药性，这可能是因为接受化疗的肿瘤细胞会释放细胞外囊泡，从而导致耐药细胞亚群建立，此外由于化学药物的靶向性较差，全身性给药会对正常细胞造成不良影响，从而引发令人厌烦的毒副作用。因此，人们越来越关注开发新的策略，这些策略可以更有效地将前药靶向肿瘤细胞，以提高疗效并降低毒性。
3.基因定向酶前药疗法（gene-directed enzyme prodrug therapy，gdept）是最重要和最成功的前药递送方法之一，在癌症治疗中显示出巨大的应用前景。gdept 利用转基因编码酶，将前药转化为活性治疗代谢物。gdept通常由三部分组成：无活性药物（前药）、编码将无活性前药转化为活性药物的酶的基因以及载体。该疗法通常包括以下三步：第一步，将编码基因克隆到载体中，并在有或没有载体的情况下递送至肿瘤细胞；第二步，基因被转录成 mrna，随后被翻译成肿瘤细胞内的酶；第三步，将前药全身给药并被同一细胞吸收，然后前药可以通过细胞内的酶转化为细胞毒性药物。由于基因表达可能受到肿瘤细胞特异性启动子的控制，因此该酶及其相关的酶促反应可以精确地针对肿瘤细胞，使其他细胞即使吞噬该基因和前药也不受影响（参见both gw. recent progress in gene-directed enzyme prodrug therapy: an emerging cancer treatment. curr opin mol ther. 2009;11(4):421
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32）。前药优先转化为药物，有毒药物仅在肿瘤细胞中产生，而与健康细胞的接触最少，这样前药的治疗指数可以远高于常规癌症化疗药物。
4.理想的 gdept酶应在肿瘤细胞中专门表达或以相对较高的比例表达，并且应具有高催化活性，以便肿瘤细胞即使在低底物浓度下也能转化前药。gdept 的理想前药在被酶激活之前应该是无毒或最小毒性的，但在酶激活后具有高毒性。此外，前药应该被肿瘤细胞有效吸收，对转导的酶具有高亲和力，而对不相关的内源酶具有低亲和力。为了有效杀死肿瘤细胞，前药的细胞毒性代谢物应具有较长的半衰期。在过去的二十年中，人们对许多酶/前药系统进行了研究，其中应用最广泛的是单纯疱疹病毒胸苷激酶 (herpes simplex virus thymidine kinase，hsv-tk) 与更昔洛韦 (ganciclovir，gcv)、胞嘧啶脱氨酶 (cytosine deaminase，cd)与 5-氟胞嘧啶 (5-fc，5-fluorocytosine)、细胞色素 p450 与环磷酰胺/异环磷酰胺 (cyclophosphamide/ifosfamide，cpa/ifa) )，以及硝基还原酶和 cb1954。
5.在众多gdept 酶中，胞嘧啶脱氨酶是一种经过充分研究的生物酶，多项研究比较了 cd/5-fc 与 hsv-tk/gcv 系统的功效，结果显示cd/5-fc 明显优于 hsv-tk/gcv ，cd/5-fc的优越效果可能归因于其更大的旁观者效应，gcv 的旁观者效应主要依赖于间隙连
是否促进肿瘤生长仍存在争议，出于安全原因，自杀基因是间充质干细胞最理想的有效负载，因为它们可以在交付后破坏细胞载体。
9.为克服现有gdept疗法的缺陷，本发明提供了一种携带杀伤开关的间充质干细胞，该细胞携带有胞嘧啶脱氨酶基因，可在体内将5-fc转化为5-fu，发挥抗肿瘤作用，且所述间充质干细胞与靶向cd133抗体联用，可防止肿瘤耐药性的发生，进一步提高抗肿瘤活性，延长动物生存周期。


技术实现要素：

10.本发明中的第一方面提供了一种携带杀伤开关的间充质干细胞，所述间充质干细胞被导入了自杀基因，所述自杀基因为胞嘧啶脱氨酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
11.本发明中利用了间充质干细胞的肿瘤细胞归巢能力，以其作为免疫治疗载体，输送自杀基因，与前药5-fc配合使用，可避免全身性的不良反应，有效杀死肿瘤细胞，提供安全性高的肿瘤治疗方案。
12.进一步的，所述自杀基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
13.进一步的，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，所述间充质干细胞为cd73+，cd90+，cd34-，cd45-细胞。
14.本发明中的第二方面提供了一种肿瘤免疫抑制剂，包含所述的间充质干细胞、5-fc和单克隆抗体，所述单克隆抗体为靶向cd44抗体、靶向cd133抗体和/或靶向olig2抗体。
15.进一步的，所述单克隆抗体为靶向cd133抗体，其重链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.5所示。
16.肿瘤耐药性的产生与多种作用机制相关，包括免疫检查点关闭、基因突变、关键酶失活等等，其中癌症干细胞在这一过程中发挥了关键作用。肿瘤干细胞的概念最早由 park 等人在1971 年提出，认为肿瘤是由一个自我更新的 cscs 亚群驱动的疾病，该亚群具有分化构成肿瘤实体的不同细胞群的能力，即使某些治疗方法能使肿瘤实体完全消退，也可能残余有足够的肿瘤干细胞引起肿瘤的复发，该理论表明，只有更具体地针对肿瘤干细胞的治疗才可能导致更持久的治疗效果，甚至能治愈转移性肿瘤。目前，肿瘤干细胞已经从造血系统、乳腺、肺、前列腺、结肠、大脑、头颈部和胰腺等肿瘤中被识别和分离出来。
17.肿瘤干细胞并非无迹可寻，其表面通常会表达一些肿瘤标志物，如cd44、cd133、cd117、olig2等，其中cd44和cd133是最为常见的肿瘤干细胞标志物，cd117也在卵巢癌、神经胶质瘤、肝癌等多种肿瘤干细胞中被观察到，少突胶质细胞转录因子 2（olig2）是一种中枢神经系统限制性转录因子，在神经胶质祖细胞增殖和 cns 发育过程中起着关键作用，olig2 也在胶质瘤中广泛表达，并在胶质瘤发生和肿瘤表型可塑性中发挥重要作用。有研究表明，5-fu耐药性产生后，肿瘤细胞表面的cd133表达水平提高（参见hee yi, hee-jung cho,et al, effect of 5-fu and mtx on the expression of drug-resistance related cancer stem cell markers in non-small cell lung cancer cells, korean j physiol pharmacol. 2012 feb; 16(1): 11
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16.）本发明中将经过基因工程修饰的间充质干细胞与靶向不同肿瘤干细胞表面标志物的抗体联合使用，不仅能够抑制肿瘤干细胞增殖，还可防止耐药性的出现，从而提高了抗肿瘤效果，经过研究表明，与抗cd133抗体联用的效果最佳。
18.本发明中的第三方面提供了一种所述间充质干细胞或所述的肿瘤免疫抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
19.进一步的，所述的肿瘤为神经胶质瘤、结直肠癌或卵巢癌。
有益效果
20.本发明提供了一种携带杀伤开关的间充质干细胞及其在肿瘤治疗中的应用，具有以下优势：（1）将自杀基因胞嘧啶脱氨酶导入间充质干细胞中，可实现体内具备给药治疗，防止发生全身性的毒副作用；（2）胞嘧啶脱氨酶基因经过修饰，具有更强的脱氨作用，酶活力得到强化；（3）经过基因修饰的间充质干细胞与单克隆抗体联用，尤其是和靶向cd133的抗体联用，可抑制肿瘤干细胞生长，防止肿瘤复发和耐药性的出现；（4）本发明提供的干细胞治疗方法可有效抑制动物体内肿瘤生长，调节免疫因子表达，提高治疗有效性。
附图说明
21.图1：基因修饰间充质干细胞msc-cd抑制多种肿瘤增殖；图2：msc-cd细胞及其与抗体联用抑制耐药性肿瘤细胞增殖；图3：不同治疗组动物模型的肿瘤体积变化；图4：模型动物血清中免疫因子表达水平。
实施方式
22.以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本技术要求保护的范围之中。
23.以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
24.实施例1 胞嘧啶脱氨酶的序列优化现有技术中已经报道了多种胞嘧啶脱氨酶可用于肿瘤治疗，包括大肠杆菌、酵母来源的胞嘧啶脱氨酶，本发明中以大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶为基础进行研究，ncbi数据库中查询并选择胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列，其genebank号为wp_219385354.1，氨基酸序列如seq id no.1所示。
25.在早期研究中，研究人员尝试了多种定点突变、序列截短的方式对胞嘧啶脱氨酶序列结构进行改进，相应突变分别命名为cd-m01、cd-m02、cd-m03、cd-m04和cd-m05。全基因合成上述突变体基因，设计引物利用同源重组进行pcr扩增，并分别导入亚克隆到载体pet32a的相应位点，获得重组质粒；通过热激转化e. coli bl21(de3)，得到重组大肠杆菌e. coli bl21(de3)/ pet32a-cd。37℃，200r/min培养12h后，离心收集菌体，去掉上清培养基后加入发酵培养基，37℃，220r/min培养8h后加入乳糖至终浓度为2.0g/l并降温至30℃诱导表达24h，离心收集菌体。测定突变体酶活，加入10g/l湿菌体和20mm底物5-fc，反应介
质为ph 8.0的磷酸盐缓冲液，总体系为1ml，在37℃温育90分钟。然后用10％三氯乙酸终止反应，并将混合物在4℃离心以收集上清。分别通过290nm和255nm处的吸亮度来检测5-fc和5-fu的存在，并计算相对酶活性。结果如表1所示，各个突变的酶活性有不同程度的改变，其中突变体cd-m03的活性最强，远高于野生型，后续实验中选用该突变体进行，经测定其氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.3所示。
26.表1 突变体相对酶活性相对酶活性野生型cd100%cd-m01165%cd-m0285%cd-m03260%cd-m04186%cd-m0590%实施例2 使用胞嘧啶脱氨酶基因修饰间充质干细胞2.1 慢病毒载体制备设计相应引物，通过pcr技术扩增cd-m03基因序列，通过酶切连接反应导入慢病毒载体质粒载体pcdh-ef1α-copgfp-t2a-puro中，将pcdh-ef1α-copgfp-t2a-puro质粒载体与病毒包装质粒pspax2和pmd2g按4：3：2的比例混合，并与pei（购自美国polyscience公司）及opti-mem培养基共孵育后转染至293t细胞，具体的转染操作过程参见pei转染试剂说明书。转染后24小时更换dmem完全培养基，分别在换液后48小时和72小时，收集上清液，在4℃、3000g条件下离心15min后，用0.45μm滤膜过滤，分装至ep管后转入-80℃保存。
27.2.2间充质干细胞制备本节中从脐带组织中分离制备所述间充质干细胞，用0.9%生理盐水洗涤脐带，去除杂质，将洗涤干净的脐带放入新的培养皿中，两端结扎部分剪掉，沿静脉血管的螺旋走向将小段脐带剪开，剔除脐带中的动、静脉血管；剩余脐带剪成若干段2-3 cm长的小段，使用无菌生理盐水洗涤3次；用组织镊将华通胶组织撕下，将其剪碎成1-8 mm3的小块；将华通胶组织接种于细胞培养皿中，加入4ml完全培养基，在37℃、5% co2和饱和湿度条件下培养，直至间充质干细胞从组织内爬出。待细胞长出后，胰酶消化并离心收集细胞，经流式细胞仪检测，所述细胞为cd73+，cd90+，cd34-，cd45-细胞，符合后续要求。
28.2.3间充质干细胞基因修饰传代培养2.2节中所获得的间充质干细胞，待细胞至对数生长期后，将慢病毒以moi＝5的感染系数进行转染，并加入病毒转染试剂polyberen（购自sigma公司）。37℃、5% co2和饱和湿度条件下培养，转染48h后离心收集细胞，经流失细胞仪鉴定，所述细胞能够表达所述胞嘧啶脱氨酶，转染效率可达75%，所述细胞记为msc-cd。
29.实施例3 胞嘧啶脱氨酶基因修饰间充质干细胞抑制肿瘤细胞生长以胶质瘤细胞系u251、结肠癌细胞系hct15和卵巢癌细胞系skov-3 （购自上海细胞研究所）为研究对象，考察胞嘧啶脱氨酶基因修饰间充质干细胞对肿瘤的抑制作用。
30.选取上述肿瘤细胞接种于96孔板中，每孔5000个细胞，37℃、5% co2和饱和湿度条件下培养4h后，按5:1比例加入msc-cd细胞，同时加入500μg/ml的5-fc，同时以仅加入500μ
g/ml 5-fc的培养孔为对照孔。培养48h后使用cck8法检测细胞存活率，具体步骤包括：弃去培养基，吸净残留液体，避光条件下每孔加入100μl无血清培养基及10μl cck8，将96孔板放于37℃孵箱中避光培养1小时，使用酶标仪测吸光度值od450nm，重复测量3次取均值。按公式细胞存活率＝(实验组od值-空白对照组od值)/(对照组od值-空白对照组od值)
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100％，计算所述细胞存活率。
31.结果如图1所示，本发明中提供的msc-cd细胞对于胶质瘤细胞、结肠癌细胞和卵巢癌细胞均有明显抑制作用，且对于hct15细胞的抑制作用最强，u251细胞次之，skov-3细胞相对较差。
32.实施例4胞嘧啶脱氨酶基因修饰间充质干细胞与抗体组合使用5-fu是一种胸苷酸合成酶抑制药，在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（5f-dump），而抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸（dump）甲基化转变为脱氧胸苷酸（dtmp），从而影响dna的合成。作为广谱抗肿瘤药，5-fu对于食管癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、神经胶质瘤等具有明显抑制作用，但在使用过程中也容易产生耐药性，有研究表明这耐药性的产生与肿瘤干细胞有关，本节中将msc-cd细胞与抗肿瘤抗体联用，以便有效杀死肿瘤干细胞，防止耐药性的出现。
33.本节中以胶质瘤细胞系u251为基础，通过逐步适应法培育5-fu耐药性细胞株，经过驯化所述耐药肿瘤细胞可在200μg/ml的5-fu中生长。本实施例中考察msc-cd与单克隆抗体联用，对于耐药细胞的抑制作用，分别选择靶向cd44、cd133、cd117、olig2的单克隆抗体作为候选药物，所述单克隆抗体由发明人在先制备获得。将该耐药肿瘤细胞接种于96孔板中，每孔5000个细胞，37℃、5% co2和饱和湿度条件下培养4h后，按5:1比例加入msc-cd细胞，同时加入500μg/ml的5-fc，然后随机分为5组，每组设置3个复孔，分别为：anti cd44组，加入靶向cd44单克隆抗体，终浓度为100μg/ml；anti cd133组，加入靶向cd133单克隆抗体，终浓度为100μg/ml；anti cd117组，加入靶向cd117单克隆抗体，终浓度为100μg/ml；anti olig2组，加入靶向olig2单克隆抗体，终浓度为100μg/ml；对照组，加入等体积的培养基。培养48h后使用cck8法检测细胞存活率，具体步骤参照实施例3。
34.结果如图2所示，单纯使用msc-cd细胞对于耐药性肿瘤细胞的作用甚微，与单克隆抗体联合后，抗肿瘤效果得到了强化，但是靶向cd117抗体似乎无明显协同作用，靶向cd133和olig2的单克隆抗体联用效果更好，考虑到cd133为多种肿瘤干细胞中普遍存在的表面标志物，适应性更强，故为最佳联合治疗剂。经过序列测定，本发明中所提供的靶向cd133单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.5所示。
35.实施例5胞嘧啶脱氨酶基因修饰间充质干细胞体内抑制肿瘤细胞生长5.1肿瘤动物模型制备与给药治疗本节中采用胶质瘤细胞系u251制备小鼠肿瘤模型，取1
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6 个细胞接种于裸鼠右前肢腋窝处皮下，每天观察成瘤情况并记录，肿瘤体积生长至100mm3以上时，表示造模成功。取30只造模成功小鼠，随机分为3组，分别为：msc-cd组，尾静脉注射1
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106个msc-cd细胞，每天注射500 mg/ kg的5-fc；msc-cd+cd133组，尾静脉注射1
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106个msc-cd细胞，每天注射500 mg/ kg的5-fc，每隔3天注射50mg/kg靶向cd133的单克隆抗体；对照组，每天注射
等体积生理盐水。各种共给药30天，观察治疗效果。
36.5.2细胞治疗可抑制肿瘤生长每2天观测肿瘤大小，记录肿瘤的长径(l)与短径(w)，肿瘤体积(v)计算公式如下：v肿瘤＝(长径l
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短径w/2)。结果如图3所示，msc-cd细胞能够延缓肿瘤生长，但是在给药后期肿瘤抑制作用开始降低，尤其是在最后一周，肿瘤体积开始快速增大，这可能与5-fu耐药性的出现有关，而msc-cd细胞与抗cd133抗体联用则未出现上述情况，说明这种联合治疗方法可有效杀死肿瘤干细胞，抑制耐药性的出现。
37.5.3细胞治疗调节免疫因子表达本节中检测血清中肿瘤免疫因子的表达水平，以考察所述干细胞治疗对于免疫环境的影响。治疗15天后取小鼠血液，放置于抗凝管中室温静置1h，4℃、2000rmp离心20min，获得小鼠血清。使用elisa试剂盒（购自美国abcam公司）检测血清中的tnf-α和ifn-γ含量，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。
38.结果如图4所示，经过msc-cd细胞治疗后tnf-α和ifn-γ含量均有所上升，其中ifn-γ表现更为明显，尤其是在msc-cd细胞与抗cd133抗体联用中，ifn-γ表达水平大幅度提高，说明这种方式有利于调动体内免疫反应，对抗肿瘤生长。
39.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种携带杀伤开关的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞被导入了自杀基因，所述自杀基因为胞嘧啶脱氨酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示。2.如权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于，所述自杀基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。3.如权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，所述间充质干细胞为cd73+，cd90+，cd34-，cd45-细胞。4.一种肿瘤免疫抑制剂，其特征在于其包含权利要求1-3任一项中所述的间充质干细胞、5-fc和单克隆抗体，所述单克隆抗体为靶向cd44抗体、靶向cd133抗体和/或靶向olig2抗体。5.如权利要求4所述的肿瘤免疫抑制剂，其特征在于，所述单克隆抗体为靶向cd133抗体，其重链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.5所示。6.如权利要求1-3任一项所述的间充质干细胞或权利要求4-5任一项所述的肿瘤免疫抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为神经胶质瘤、结直肠癌或卵巢癌。

技术总结
本发明提供了一种携带杀伤开关的间充质干细胞及其在肿瘤治疗中的应用，所述间充质干细胞被导入了自杀基因，所述自杀基因为胞嘧啶脱氨酶，所述胞嘧啶脱氨酶经过序列改造，其催化活性更强；还提供了一种肿瘤免疫抑制剂，包含所述间充质干细胞、5-FC和单克隆抗体，所述单克隆抗体为靶向CD44抗体、靶向CD133抗体和/或靶向OLIG2抗体，能够有效杀伤肿瘤干细胞，防止耐药性细胞出现，改善肿瘤治疗效果。改善肿瘤治疗效果。


技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：再少年（北京）生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.17
技术公布日：2023/9/20