一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗的制作方法

1.本发明涉及一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗，属于医用配制品技术领域。


背景技术：

2.流行性感冒是由流感病毒引起的传染病，流感病毒的基因转移和漂移特点，导致流感病毒的季节性和大流行。流感病毒是正粘病毒科的成员，根据其核蛋白（np）和基质蛋白（m）之间的抗原差异，分为三种不同的类型（a型、b型和c型）。
3.由甲型流感（h1和h3亚型）和b型流感病毒引起的季节性流行是全球健康的主要威胁。目前用于预防和治疗流感的疫苗有灭活流感疫苗和卵细胞培养生产的减毒流感疫苗，它们都是以ha1（流感病毒血凝素）球状头结构域为免疫原。
4.现有的三价流感疫苗或四价流感疫苗（针对流行的h1n1、h3n2和b型病毒株（victoria和yamagata）设计），由于流感病毒基因的快速进化，抗原可变性介导病毒逃离宿主免疫反应，其疗效有限，需要每年更新疫苗。
5.除了三价重组流感疫苗[riv3]（flublok, protein sciences）和基于细胞培养的流感疫苗[cciiv4]（flucelvax, novartis）外，其余市售流感疫苗都是通过在胚胎鸡蛋中繁殖病毒生产的，生产时间为6-8个月，限制了在大流行情况下快速开发和生产适应性疫苗。
[0006]
cn101450207a、cn103285391a中生产的流感疫苗都是通过在胚胎鸡蛋中繁殖病毒生产的，收集病毒后，进行减毒或灭活。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗，诱导哺乳动物的免疫反应，从而广泛地对多种流感毒株产生交叉反应，提高疫苗的抗体效价，提高免疫效果。
[0008]
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗，所述多价疫苗包括重组蛋白h1n1、重组蛋白h3n2、重组蛋白h5n1、重组蛋白h6n1、重组蛋白h7n9、重组蛋白h9n2、重组蛋白h11n2、重组蛋白b-victoria、重组蛋白b-yamagata，所述疫苗中各重组蛋白的质量浓度均为100μg/ml；所述重组蛋白从n端到c端的方向依次由信号肽、dc结合区、抗原、折叠蛋白、连接子、his标签连接；所述折叠蛋白为ferritin或foldon；所述抗原为h1n1抗原、h3n2抗原、h5n1抗原、h6n1抗原、h7n9抗原、h9n2抗原、h11n2抗原、b-victoria抗原或b-yamagata抗原；所述h1n1抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.6所示；所述h3n2抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.7所示；所述h5n1抗原的核苷酸序列如序列表中seqid no.8所示；所述h6n1抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.9所示；所述h7n9抗原的核苷酸序
列如序列表中seqid no.10所示；所述h9n2抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.11所示；所述h11n2抗原的核苷酸序列如序列表中seqid no.12所示；所述b-victoria抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.13所示；所述b-yamagata抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.14所示。
[0009]
所述信号肽的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示；所述dc结合区的核苷酸序列如序列表中seq id no.2所示；所述ferritin的核苷酸序列如序列表中seq id no.3所示；所述连接子的核苷酸序列如序列表中seq id no.5所示；所述his标签的核苷酸序列如序列表中seqid no.4所示；所述foldon的核苷酸序列如序列表中seq id no.19所示。
[0010]
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：（1）本发明对抗原序列进行了优化，制备的多价流感疫苗能够刺激机体产生较强的免疫原性，免疫小鼠后的血清抗体效价明显高于优化前抗原制备的多价流感疫苗。
[0011]
（2）本发明制备的多价流感疫苗免疫小鼠后再进行攻毒，小鼠的成活率明显高于优化前抗原制备的多价流感疫苗免疫的小鼠。
[0012]
（3）本发明制备的多价流感疫苗免疫小鼠后再进行攻毒，攻毒4天后，小鼠体内的病毒滴度明显低于优化前抗原制备的多价流感疫苗免疫的小鼠，说明本发明制备的多价流感疫苗的免疫效果更好，对小鼠具有显著的交叉保护作用，可同时抵抗多种流感毒株的侵染。
附图说明
[0013]
图1为本发明重组蛋白的结构设计图；其中图1a为含有ferritin的重组蛋白的结构设计图；图1b为含有foldon的重组蛋白的结构设计图；图2为含重组蛋白h1na的重组表达载体稳转cho细胞中gfp表达率的流式图；其中图2a为pcdna3.1-h1-ferritin稳转cho细胞中gfp表达率的流式图；图2b为pcdna3.1-h1-foldon稳转cho细胞中gfp表达率的流式图；图3 为his抗体鉴定重组蛋白的western blot图；其中图3a为his抗体鉴定含有ferritin重组蛋白的western blot图；图3b为his抗体鉴定含有foldon重组蛋白的western blot图；图3c为his抗体鉴定优化前重组蛋白的western blot图；图4为不同抗原包板检测多价流感疫苗免疫小鼠后血清抗体效价的柱状图；图5为感染a/beijing/262/1995（h1n1）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图5a为感染a/beijing/262/1995（h1n1）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图5b为感染a/beijing/262/1995（h1n1）流感病毒后各组小鼠体重变化图；图6为感染a/perth/16/2009（h3n2）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图6a为感染a/perth/16/2009（h3n2）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图6b为感染a/perth/16/2009（h3n2）流感病毒后各组小鼠体重变化图；图7为感染a/anhui/1/2005（h5n1）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图7a为感染a/anhui/1/2005（h5n1）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图7b为
感染a/anhui/1/2005（h5n1）流感病毒后各组小鼠体重变化图；图8为感染a/quail/hong kong/1721-30/99（h6n1）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图8a为感染a/quail/hong kong/1721-30/99（h6n1）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图8b为感染a/quail/hong kong/1721-30/99（h6n1）流感病毒后各组小鼠体重变化图；图9为感染a/anhui/01/2013（h7n9）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图9a为感染a/anhui/01/2013（h7n9）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图9b为感染a/anhui/01/2013（h7n9）流感病毒后各组小鼠体重变化图；图10为感染a/hong kong/1073/1999（h9n2）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图10a为感染a/hong kong/1073/1999（h9n2）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图10b为感染a/hong kong/1073/1999（h9n2）流感病毒后各组小鼠体重变化图；图11为感染a/duck/yangzhou/906/2002（h11n2）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图11a为感染a/duck/yangzhou/906/2002（h11n2）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图11b为感染a/duck/yangzhou/906/2002（h11n2）流感病毒后各组小鼠体重变化图；图12为感染b/florida/78/2015（b/victoria）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图12a为感染b/florida/78/2015（b/victoria）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图12b为感染b/florida/78/2015（b/victoria）流感病毒后各组小鼠体重变化图；图13为感染b/wisconsin/1/2010 bx-41a（b/yamagata）流感病毒后小鼠的生存曲线和体重变化图；其中图13a为感染b/wisconsin/1/2010 bx-41a（b/yamagata）流感病毒后各组小鼠生存曲线图；图13b为感染b/wisconsin/1/2010 bx-41a（b/yamagata）流感病毒后各组小鼠体重变化图。
具体实施方式
[0014]
实施例1 重组蛋白结构的设计本发明选择h1n1、h3n2、h5n1、h6n1、h7n9、h9n2、h11n2、b-victoria、b-yamagata流感亚型的共识ha和相应的ha茎结构域作为抗原，在每种抗原前面添加dc结合区（核苷酸序列为seq id no.2），通过与dc细胞结合快速识别该抗原发挥疫苗作用；在抗原后面添加ferritin（核苷酸序列为 seq id no.3），促进免疫原蛋白结构的折叠；在蛋白的c端添加his标签（核苷酸序列为seq id no.4），便于蛋白的鉴定与纯化；在n端添加信号肽（核苷酸序列为seq id no.1），促进蛋白的分泌，ferritin和his标签之间采用连接子（核苷酸序列为seq id no.5）连接，得到含有ferritin的重组蛋白，具体结构设计见图1a；同时以foldon（核苷酸序列为seq id no.19）作为折叠蛋白替换ferritin，得到含有foldon的重组蛋白，具体结构设计见图1b。
[0015]
实施例2 重组蛋白载体的构建本发明中提供了9种亚型的优化后抗原，分别为h1n1、h3n2、h5n1、h6n1、h7n9、h9n2、h11n2、b-victoria、b-yamagata，优化后的核苷酸序列如下：（1）h1n1抗原的核苷酸序列（seq id no.6）（2）h3n2抗原的核苷酸序列（seq id no.7）（3）h5n1抗原的核苷酸序列（seq id no.8）（4）h6n1抗原的核苷酸序列（seq id no.9）（5）h7n9抗原的核苷酸序列（seq id no.10）（6）h9n2抗原的核苷酸序列（seq id no.11）（7）h11n2抗原的核苷酸序列（seq id no.12）（8）b-victoria抗原的核苷酸序列（seq id no.13）（9）b-yamagata抗原的核苷酸序列（seq id no.14）；按照实施例1所述的含有ferritin的重组蛋白的结构进行重组，分别获得编码h1n1重组蛋白的核苷酸序列、编码h3n2重组蛋白的核苷酸序列、编码h5n1重组蛋白的核苷酸序列、编码h6n1重组蛋白的核苷酸序列、编码h7n9重组蛋白的核苷酸序列、编码h9n2重组蛋白的核苷酸序列、编码h11n2重组蛋白的核苷酸序列、编码b-victoria重组蛋白的核苷酸序列、编码b-yamagata重组蛋白的核苷酸序列；按照上述重组蛋白的核苷酸序列，委托山东弘诺生物科技有限公司合成，将其分别连接到pcdna3.1-egfp-t2a-puro载体上，获得的重组载体分别命名为pcdna3.1-h1-ferritin、pcdna3.1-h3-ferritin、pcdna3.1-h5-ferritin、pcdna3.1-h6-ferritin、pcdna3.1-h7-ferritin、pcdna3.1-h9-ferritin、pcdna3.1-h11-ferritin、pcdna3.1-b-victoria-ferritin、pcdna3.1-b-yamagata-ferritin。按照常规实验方法对这些载体进行转化、摇菌并提取质粒，各种质粒的浓度为1.0μg/μl，得到9种含有ferritin的pcdna3.1重组表达载体。
[0016]
同时将上述重组蛋白的核苷酸序列中的ferritin序列替换为foldon序列，合成含有foldon的重组蛋白，构建载体。获得的重组载体分别命名为pcdna3.1-h1-foldon、pcdna3.1-h3-foldon、pcdna3.1-h5-foldon、pcdna3.1-h6-foldon、pcdna3.1-h7-foldon、pcdna3.1-h9-foldon、pcdna3.1-h11-foldon、pcdna3.1-b-victoria-foldon、pcdna3.1-b-yamagata-foldon。按照常规实验方法对这些载体进行转化、摇菌并提取质粒，各种质粒的浓度为1.0μg/μl，得到9种含有foldon的pcdna3.1重组表达载体。
[0017]
本发明针对h1n1抗原、h3n2抗原、h5n1抗原、b-victoria抗原，进行了序列的优化，优化前后氨基酸序列的情况如下：h1n1抗原序列：优化前h1n1抗原的氨基酸序列是选取a/beijing/262/1995(h1n1)（qqy97247.1）中18-56位置的氨基酸和296-530位置的氨基酸，两者之间用gsa连接；优化后h1n1抗原的氨基酸序列（即seq id no.6对应的氨基酸序列）是在优化前h1n1抗原的氨基酸序列基础上去掉86-97位氨基酸，用gsagsa连接前后的氨基酸序列；将优化前h1n1抗原的氨基酸序列翻译得到优化前h1n1抗原的核苷酸序列（seq id no.15）。
[0018]
h3n2抗原序列：优化前h3n2抗原的氨基酸序列是选取a/netherlands/178/1995
(h3n2)（aiu46036.1）中17-65位置的氨基酸和301-525位置的氨基酸，两者之间用gsa连接；优化后h3n2抗原的氨基酸序列（即seq id no.7对应的氨基酸序列）是在优化前h3n2抗原的氨基酸序列的基础上去掉93-102位氨基酸，用gsagsa连接前后的氨基酸序列。
[0019]
将优化前h3n2抗原的氨基酸序列翻译得到优化前h3n2抗原的核苷酸序列（seq id no.16）。
[0020]
h5n1抗原序列：优化前h5n1抗原的氨基酸序列是选取a/hong kong/486/97(h5n1)（aaf74331.1）中17-56位置的氨基酸和298-533位置的氨基酸，两者之间用gsa连接。优化后h5n1抗原的氨基酸序列（即seq id no.8对应的氨基酸序列）是在优化前h5n1抗原的氨基酸序列的基础上去掉82-99位氨基酸，用gsagsa连接前后的氨基酸序列。
[0021]
将优化前h5n1抗原的氨基酸序列翻译得到优化前h5n1抗原的核苷酸序列（seq id no.17）。
[0022]
b-victoria抗原序列：优化前b-victoria的氨基酸序列是选取b/people/china/wuxing 2021/2021（qzp13341.1）中16-66位置的氨基酸和316-550位置的氨基酸，两者之间用gsa连接；优化后b-victoria抗原的氨基酸序列（即seq id no.13对应的氨基酸序列）是在优化前b-victoria的氨基酸序列基础上去掉83-90位氨基酸，用gsagsa连接前后的氨基酸序列。
[0023]
将优化前b-victoria抗原的氨基酸序列翻译得到优化前b-victoria抗原的核苷酸序列（seq id no.18）。
[0024]
将上述4种优化前抗原的核苷酸序列，按照实施例1所述的含有ferritin的重组蛋白的结构进行重组，分别获得4种优化前的重组蛋白的核苷酸序列，委托山东弘诺生物科技有限公司合成，将其分别连接到pcdna3.1-egfp-t2a-puro载体上，获得的重组载体分别命名为pcdna3.1-h1-优化前-ferritin、pcdna3.1-h3-优化前-ferritin、pcdna3.1-h5-优化前-ferritin、pcdna3.1-b-victoria-优化前-ferritin。按照常规实验方法对这些载体进行转化、摇菌并提取质粒，各质粒的浓度为1.0μg/μl，得到4种优化前含有ferritin的pcdna3.1重组表达载体。
[0025]
实施例3 重组表达载体转染cho细胞1、cho细胞的培养1）复苏细胞：将含有1mlcho细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5ml dmem完全培养基混合均匀，在1000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，补加5ml dmem完全培养基后吹匀，然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜，第二天换液并检查细胞密度；dmem完全培养基为含10vol% fbs的dmem高糖培养基（购自gibco）。
[0026]
2）细胞传代：细胞密度达80%以上，即可进行传代培养，第一次传代后的细胞培养至细胞状态良好，活力98%以上，取对数生长期细胞稀释至5
×
105个/ml，接种到六孔板中（每孔加入1ml细胞悬液）；操作完毕后置于37℃、5%co2的培养箱中培养，观察细胞密度，达到80%的汇合率即可进行转染。转染前，将培养基更换为新鲜的dmem高糖培养基，得到待转染的cho细胞悬液。
[0027]
2、重组表达载体转染cho细胞和稳转细胞系的筛选（1）做脂转complex：opti mem需在37℃水浴中预热，lipofiter
tm
转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。
[0028]
取一只洁净无菌的离心管，用dmem高糖培养基稀释4μg的pcdna3.1重组表达载体至总体积250μl，稀释后混匀，得到dna溶液。
[0029]
取另一只洁净无菌的离心管，加入238μl的dmem高糖培养基，再加入12μl的lipofiter
tm
，用枪轻轻吹打混匀，终体积250μl，静置5min，得到lipofiter
tm
溶液。
[0030]
（2）将dna溶液和lipofiter
tm
溶液充分混匀后，室温孵育20 min，得到lipofiter
tm-dna的培养液。将上述六孔板中的待转染的cho细胞悬液，去掉上清，将lipofiter
tm-dna的培养液加入到六孔板中的一个孔中置于37℃、5%co2的培养箱中培养6h。
[0031]
（3）去除含有lipofiter
tm-dna的培养液，每孔加入2ml新鲜的dmem完全培养基继续培养。
[0032]
（4）培养24h后，加入终浓度为400μg/ml的g418（购自mce，货号hy-17561），筛选稳转细胞系，每隔3天更换新鲜的含有400μg/ml g418的dmem完全培养基。
[0033]
（5）定期在荧光显微镜下观察细胞中gfp的表达情况，在其表达率达到80%以上时，收集细胞，用流式细胞仪测定gfp的表达率，侧面反映pcdna3.1在cho稳转细胞系中的表达情况。
[0034]
按照上述方法，将22种不同的重组表达载体（9种含有foldon的pcdna3.1重组表达载体、9种含有ferritin的pcdna3.1重组表达载体、4种优化前含有ferritin的pcdna3.1重组表达载体）转染到cho细胞中，利用g418筛选后，各种稳转细胞系中gfp的表达率在96.1%-99.2%之间。图2为pcdna3.1-h1-ferritin和pcdna3.1-h1-foldon稳转cho细胞中gfp表达率的流式检测图。
[0035]
实施例4 重组蛋白的鉴定及纯化浓缩将筛选得到的不同重组蛋白cho稳转细胞系，进行扩大培养，收集上清获得重组蛋白。利用重组蛋白中添加的his标签进行鉴定和纯化。根据ni-nta琼脂糖凝胶亲和层析纯化法将收集的上清进行纯化，得到纯化后的重组蛋白溶液（溶剂为pbs，购自索莱宝，货号：p1020），对纯化后的蛋白利用his抗体进行鉴定。
[0036]
h1-ferritin重组蛋白的大小为52.7kd，h3-ferritin重组蛋白的大小为52.9kd，h5-ferritin重组蛋白的大小为52.4kd，h6-ferritin重组蛋白的大小为52.5kd，h7-ferritin重组蛋白的大小为52.1kd，h9-ferritin重组蛋白的大小为52.5kd，h11-ferritin重组蛋白的大小为52.6kd，b-victoria-ferritin重组蛋白的大小为53.8kd，b-yamagata-ferritin重组蛋白的大小为54kd。利用his抗体鉴定，结果如图3a所示，蛋白大小与预测的重组蛋白大小一致。
[0037]
h1-foldon重组蛋白的大小为37.7kd，h3-foldon重组蛋白的大小为37.9kd，h5-foldon重组蛋白的大小为37.4kd，h6-foldon重组蛋白的大小为37.5kd，h7-foldon重组蛋白的大小为37.1kd，h9-foldon重组蛋白的大小为37.5kd，h11-foldon重组蛋白的大小为37.6kd，b-victoria-foldon重组蛋白的大小为38.8kd，b-yamagata-foldon重组蛋白的大小为39kd。利用his抗体鉴定，结果如图3b所示，蛋白大小与预测的重组蛋白大小一致。
[0038]
h1-优化前-ferritin重组蛋白的大小为53.4kd，h3-优化前-ferritin重组蛋白的大小为53.4kd，h5-优化前-ferritin重组蛋白的大小为53.6kd，b-victoria-优化前-ferritin重组蛋白的大小为54.6kd，结果如图3c所示，蛋白大小与预测的重组蛋白大小一致。
[0039]
实施例5 多价流感疫苗的制备及其免疫效果1、多价流感疫苗的制备将纯化后的9种含有ferritin的重组蛋白溶液均用pbs稀释（购自索莱宝，货号：p1020）到1mg/ml，按照等比例进行混合，用pbs（购自索莱宝，货号：p1020）稀释使各种抗原终浓度均为100μg/ml，得到ferritin多价流感疫苗。
[0040]
按照同样的方法和浓度对9种含有foldon的重组蛋白制备foldon多价流感疫苗。
[0041]
按照同样的方法和浓度对4种优化前的重组蛋白制备多价流感疫苗：将h1-优化前-ferritin重组蛋白和其余8种优化后的含ferritin的重组蛋白（即h3-ferritin重组蛋白、h5-ferritin重组蛋白、h6-ferritin重组蛋白、h7-ferritin重组蛋白、h9-ferritin重组蛋白、h11-ferritin重组蛋白、b-victoria-ferritin重组蛋白、b-yamagata-ferritin重组蛋白）制备成h1-优化前-ferritin多价流感疫苗；将h3-优化前-ferritin重组蛋白和其余8种优化后的ferritin的重组蛋白（即h1-ferritin重组蛋白、h5-ferritin重组蛋白、h6-ferritin重组蛋白、h7-ferritin重组蛋白、h9-ferritin重组蛋白、h11-ferritin重组蛋白、b-victoria-ferritin重组蛋白、b-yamagata-ferritin重组蛋白）制备成h3-优化前-ferritin多价流感疫苗；将h5-优化前-ferritin重组蛋白和其余8种优化后的ferritin的重组蛋白（即h1-ferritin重组蛋白、h3-ferritin重组蛋白、h6-ferritin重组蛋白、h7-ferritin重组蛋白、h9-ferritin重组蛋白、h11-ferritin重组蛋白、b-victoria-ferritin重组蛋白、b-yamagata-ferritin重组蛋白）制备成h5-优化前-ferritin多价流感疫苗；将b-victoria-优化前-ferritin重组蛋白和其余8种优化后的ferritin的重组蛋白（即h1-ferritin重组蛋白、h3-ferritin重组蛋白、h5-ferritin重组蛋白、h6-ferritin重组蛋白、h7-ferritin重组蛋白、h9-ferritin重组蛋白、h11-ferritin重组蛋白、b-yamagata-ferritin重组蛋白）制备成b-victoria-优化前-ferritin多价流感疫苗。
[0042]
2、流感疫苗的免疫原性（1）免疫方式及实验分组用制备的ferritin多价流感疫苗、foldon多价流感疫苗和优化前多价流感疫苗为抗原，采用spf级babl/c小鼠为动物模型，采用腹腔注射的免疫方式注射免疫剂量50μg/0.5ml/只/次，初次免疫后14d加强一次免疫，28d采血，利用酶联免疫吸附法检测免疫小鼠血清elisa抗体效价。实验分组为8组，分别为ferritin多价流感疫苗、foldon多价流感疫苗、h1-优化前-ferritin多价流感疫苗、h3-优化前-ferritin多价流感疫苗、h5-优化前-ferritin多价流感疫苗、b-victoria-优化前-ferritin多价流感疫苗、pbs对照组和空白对照组。每组10只小鼠，雌雄各半，体重在18～22g，周龄为6～8周。
[0043]
（2）检测采用酶联免疫吸附法(elisa法)进行检测，分别使用h1-ferritin、h3-ferritin、h5-ferritin、h6-ferritin、h7-ferritin、h9-ferritin、h11-ferritin、b-victoria-ferritin、b-yamagata-ferritin、包板，检测ferritin多价流感疫苗、foldon多价流感疫苗和优化前多价流感疫苗免疫小鼠的血清elisa抗体效价（igg）。
[0044]
（3）结果分析结果如图4和表1所示，使用本发明所制备的多价流感疫苗以100μg蛋白/只的剂量
经腹腔免疫接种babl/c小鼠后产生了高滴度的igg抗体，说明本发明所制备的多价流感疫苗能够刺激机体产生较强的免疫原性，且ferritin多价流感疫苗、foldon多价流感疫苗的抗体滴度显著高于4种抗原优化前的多价流感疫苗的抗体滴度。
[0045]
表1多价流感疫苗免疫小鼠的抗体效价
[0046]
实施例6 不同流感毒株攻毒实验1、本实施例中使用的病毒株毒株1：h1n1人流感病毒a/beijing/262/1995毒株2：h3n2人流感病毒a/perth/16/2009毒株3：h5n1人流感病毒a/anhui/1/2005毒株4：h6n1禽流感病毒a/quail/hong kong/1721-30/99毒株5：h7n9禽流感病毒a/anhui/01/2013毒株6：h9n2禽流感病毒a/hong kong/1073/1999毒株7：h11n2禽流感病毒a/duck/yangzhou/906/2002毒株8：b/victoria人流感病毒 b/florida/78/2015毒株9：b/yamagata人流感病毒b/wisconsin/1/2010 bx-41a毒株1-3购自武汉艾美捷科技有限公司，毒株4-7由中国疾病控制中心病毒病研究所提供，毒株8-9购自atcc。
[0047]
2、实验方法及分组根据免疫样品和攻击毒株的不同将小鼠随机分为31组，12只/组，雌雄各半，每组选取2只小鼠（一雌一雄）用于肺脏病毒滴度检测，其余10只用于生存率实验；免疫样品分别为不同的多价流感疫苗和pbs溶剂（购自索莱宝，货号：p1020）组，攻击毒株为上述9种毒株，实验分组见表2。采用腹腔注射的免疫方式注射免疫剂量50μg/0.5ml/只/次，初次免疫后14d加强一次免疫，21d小鼠经乙醚麻醉，待小鼠进入麻醉状态，从鼻腔滴注107pfu的流感病毒，每天监测小鼠存活状况，监测期为14天（滴注流感病毒后开始计算）。
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小鼠肺脏病毒滴度检测：取攻毒4天的小鼠，雌雄各一只，拉颈处死，无菌状态下取出肺脏，称重后与研磨钵中研磨，按照1g肺脏组织:10ml pbs的比例制备肺组织匀浆，取出置于1.5ml ep管中，2000g离心10分钟，取上清，测pfu。
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表2 攻毒实验分组表
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3、结果分析（1）攻毒后14天内小鼠存活情况图5为a/beijing/262/1995(h1n1)攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图5可知，攻毒后，两种多价流感疫苗组小鼠体重基本不变，且100％存活；h1-优化前-ferritin多价流感疫苗组小鼠体重基本不变，生存率为70%；pbs溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第12天全部死亡。
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图6为a/perth/16/2009（h3n2）攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图6可知，攻毒后，ferritin多价流感疫苗组小鼠体重基本保持不变，且100%存活；foldon多价流感疫苗组小鼠体重先降低后升高，且90％存活；h3-优化前-ferritin多价流感疫苗组小鼠体重持续降低，生存率为60%；pbs溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第10天全部死亡。
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图7为a/anhui/1/2005（h5n1）攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图7可知，攻毒后，两种多价流感疫苗组小鼠体重基本不变，且100％存活；h5-优化前-ferritin多价流感疫苗组小鼠体重基本不变，生存率为80%；pbs溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第9天全部死亡。
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图8为a/quail/hong kong/1721-30/99（h6n1）攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图8可知，攻毒后，两种多价流感疫苗组小鼠体重基本不变，且100％存活；pbs溶剂组小鼠于攻毒后第7天小鼠全部死亡。
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图9为a/anhui/01/2013（h7n9）攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图9可知，攻毒后，两种多价流感疫苗组小鼠体重基本不变，且100％存活；pbs溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第13天全部死亡。
[0055]
图10为a/hong kong/1073/1999（h9n2）攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图10可知，攻毒后，两种多价流感疫苗组小鼠体重基本不变，且100％存活；pbs溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第9天全部死亡。
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图11为a/duck/yangzhou/906/2002（h11n2）攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图11可知，攻毒后，ferritin多价流感疫苗组小鼠体重基本保持不变，且100%存活；foldon多价流感疫苗组小鼠体重先降低后升高，且90％存活；pbs溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第10天全部死亡。
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图12为b/florida/78/2015（b/victoria）攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图12可知，攻毒后，ferritin多价流感疫苗组小鼠体重基本保持不变，且100%存活；foldon多价流感疫苗组小鼠体重先降低后升高，且100％存活；b-victoria-优化前-ferritin多价流感疫苗组小鼠体重先降低后升高，生存率为70%；pbs溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第11天全部死亡。
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图13为b/wisconsin/1/2010 bx-41a（b/yamagata）攻毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图13可知，攻毒后，ferritin多价流感疫苗组小鼠体重基本保持不变，且100%存活；foldon多价流感疫苗组小鼠体重下降，后期小鼠体重上升，部分小鼠无法抵抗病毒而死亡，观察期结束，小鼠生存率为70％；pbs溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第9天全部死亡。
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（2）攻毒后4天小鼠肺脏病毒滴度检测攻毒4天后小鼠肺脏病毒滴度检测结果如表3所示，两种多价流感疫苗免疫后的小鼠体内的病毒滴度明显低于对照组，说明本发明制备的多价流感疫苗对小鼠具有显著的交叉保护作用，可同时抵抗多种流感毒株的侵染。且优化后的免疫原免疫小鼠的肺脏病毒滴度要低于优化前的免疫原免疫的小鼠肺脏病毒滴度，说明优化后的免疫原免疫效果更好。
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表3攻毒4天后小鼠肺脏病毒滴度
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技术特征：
1.一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗，其特征在于：所述多价疫苗包括重组蛋白h1n1、重组蛋白h3n2、重组蛋白h5n1、重组蛋白h6n1、重组蛋白h7n9、重组蛋白h9n2、重组蛋白h11n2、重组蛋白b-victoria、重组蛋白b-yamagata，所述疫苗中各重组蛋白的质量浓度均为100μg/ml；所述重组蛋白从n端到c端的方向依次由信号肽、dc结合区、抗原、折叠蛋白、连接子、his标签连接；所述折叠蛋白为ferritin或foldon；所述抗原为h1n1抗原、h3n2抗原、h5n1抗原、h6n1抗原、h7n9抗原、h9n2抗原、h11n2抗原、b-victoria抗原或b-yamagata抗原；所述h1n1抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.6所示；所述h3n2抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.7所示；所述h5n1抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.8所示；所述h6n1抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.9所示；所述h7n9抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.10所示；所述h9n2抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.11所示；所述h11n2抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.12所示；所述b-victoria抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.13所示；所述b-yamagata抗原的核苷酸序列如序列表中seq id no.14所示。2.根据权利要求1所述的一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗，其特征在于：所述信号肽的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示；所述dc结合区的核苷酸序列如序列表中seq id no.2所示；所述ferritin的核苷酸序列如序列表中seq id no.3所示；所述连接子的核苷酸序列如序列表中seq id no.5所示；所述his标签的核苷酸序列如序列表中seq id no.4所示；所述foldon的核苷酸序列如序列表中seq id no.19所示。

技术总结
本发明提供一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗，所述多价疫苗包括重组蛋白H1N1、重组蛋白H3N2、重组蛋白H5N1、重组蛋白H6N1、重组蛋白H7N9、重组蛋白H9N2、重组蛋白H11N2、重组蛋白B-Victoria、重组蛋白B-Yamagata，各重组蛋白的质量浓度均为100μg/mL；所述重组蛋白从N端到C端的方向依次由信号肽、DC结合区、抗原、折叠蛋白、连接子、His标签连接；所述折叠蛋白为Ferritin或Foldon；本发明对抗原序列进行了优化，制备的多价流感疫苗能够刺激机体产生较强的免疫原性，免疫效果更好。免疫效果更好。免疫效果更好。


技术研发人员：刘明录 金海锋 韩庆梅 王立新 冯建海 强邦明 张传鹏 许淼
受保护的技术使用者：山东兴瑞生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.17
技术公布日：2023/9/20