一种提高豆科作物产量的大豆突变基因及其应用

1.本发明属于分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种提高豆科作物产量的大豆突变基因及其应用。


背景技术：

2.大豆作为一种优良植物蛋白来源，可以补充人体所必需的多种氨基酸；同时大豆还富含对人体有益的异黄酮、皂苷、卵磷脂和可溶性纤维，通过提高免疫力、降低血管胆固醇、预防心血管疾病、促进胃肠蠕动。
3.大豆单产是由单位面积的有效株数和单株产量构成的，单株产量又受株高、主茎节数、分枝数、单株荚数、单荚粒数、单株籽粒数、百粒重以及开花期、成熟期等影响。这些与产量相关的性状都属于复杂的多基因或多qtl位点控制的数量性状，且易受环境条件的影响，迄今为止，控制大豆产量的关键基因克隆的成功案例还比较少。单株荚数是决定单株产量的一个关键决定因子，因此培育大豆豆荚数目较多的品种是大豆育种的目标之一。目前国内外研究已经定位了约70个大豆荚数qtl，这些qtl几乎分布于在大豆每一条染色体上，绝大多数的贡献率在20%以下，只有几个在20%以上。但是，有关控制大豆豆荚数目的关键基因克隆尚未见报道。


技术实现要素：

4.为了解决上述的技术问题，提高大豆单株豆荚数、单株籽粒数和单株产量及大豆产量，本发明提供以下技术方案。
5.第一方面，本发明提供一种大豆突变基因，所述大豆突变基因由大豆pod基因（glyma.08g055900）核苷酸序列中至少一个核苷酸发生突变后获得。
6.优选地，所述glyma.08g055900的序列如seq id no:2所示。
7.优选地，所述突变为核苷酸插入、缺失、重复以及单个碱基的点突变。
8.优选地，所述突变为核苷酸缺失。
9.优选地，所述核苷酸缺失为所述大豆pod基因起始密码子下游92bp处发生连续3个碱基缺失，并导致大豆pod蛋白质的第31位的脯氨酸缺失。
10.优选地，所述碱基缺失c和a 的缺失，具体为caa缺失。
11.优选地，该大豆突变基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
12.第二方面，本发明提供第一方面所述的大豆突变基因在提高豆科作物产量中的应用。
13.优选地，所述提高豆科作物产量为提高单株荚数、单株籽粒数和单株产量。
14.第三方面，本发明提供一种重组载体及其在提高豆科作物产量中的应用，其含有第一方面所述的大豆突变基因。
15.优选地，所述重组载体为pgmef1a2:spcas9。
16.第四方面，本发明提供一种重组基因工程菌及其在提高豆科作物产量中的应用，
所述重组基因工程菌含有第一方面所述的大豆突变基因。
17.优选地，所述重组基因工程菌采用第三方面的重组载体转化得到。
18.优选地，所述重组基因工程菌为农杆菌eha105。
19.第五方面，本发明提供一种转基因细胞及其在提高豆科作物产量中的应用，所述转基因细胞含有第一方面所述的大豆突变基因。
20.优选地，所述转基因细胞为双子叶植物转基因细胞。
21.优选地，所述双子叶植物包括大豆、花生、鹰嘴豆、菜豆、赤小豆、苜蓿、棉花、葡萄、樱桃、薄壳山核桃或橙子。进一步优选为大豆，更优选为大豆hc6。
22.第六方面，本发明提供第一方面所述的大豆突变基因、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组基因工程菌或第五方面所述的转基因细胞在双子叶植物分子育种或基因编辑中的应用。
23.优选地，所述的应用包括将第一方面所述的大豆突变基因、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组基因工程菌转入所述双子叶植物并表达pod同源蛋白的步骤。
24.优选地，所述双子叶植物包括大豆、花生、鹰嘴豆、菜豆、赤小豆、苜蓿、棉花、葡萄、樱桃、薄壳山核桃或橙子。进一步优选为大豆，更优选为大豆hc6。
25.本发明的有益效果：一、本发明以大豆pod基因glyma.08g055900（seq id no:2）为模板，通过crispr/cas9基因编辑技术获得一种大豆pod突变基因（seq id no:1）。
26.二、本发明将获得的大豆pod突变基因转入大豆细胞，并获得了单株荚数、单株籽粒数和和单株产量显著提高的转基因大豆，改善了大豆产量相关性状。并且为大豆育种提供了更加有效的技术手段。
附图说明
27.图1所示为pod基因编辑载体验证结果；图2所示为pod基因编辑载体图谱；图3所示为ko-pod双靶点敲除载体质粒转化eha105农杆菌菌落pcr电泳检测结果；图4所示为pod突变体大豆的基本信息；图5所示为pod基因在大豆各个组织中的表达量分析；图6所示为pod同源蛋白在双子叶植物中保守性分析。
具体实施方式
28.下面结合实施例和附图来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。
29.需要说明的是，下述实施例中所用实验方法如无特别说明，均为本领域常规方法。
30.实施例1、靶向大豆pod基因的特异性sgrna设计。
31.以大豆优良品种hc6的pod基因cds序列（seq id no:2中第369-3500位）为参考，利用crispr rgen tools分别设计两个特异性靶向pod基因的sgrna。其中，sgrna1（ttcttgggctttcttggat(seq id no:3)，seq id no:2 第457-475位的反向互补序列），相应
位点pam序列为tgg，sgrna2（ttgttatgacatggtgcgc(seq id no:4)，seq id no:2 第572-590位序列），相应位点pam序列为agg。
32.实施例2、大豆pod基因双靶点敲除载体的构建。
33.利用限制性内切酶bsa i-hf使中间载体gmpuc19-1和gmpuc19-2线性化，结果见图1中的a。将靶点引物ko-pod-sg1f（ggattgttcttgggctttcttggat，seq id no:5）/sg1r（aaacatccaagaaagcccaagaaca，seq id no:6）和ko-pod-sg2f（ggattgttgttatgacatggtgcgc，seq id no:7）/sg2r（aaacgcgcaccatgtcataacaaca，seq id no:8）分别退火形成dsdna，利用t4 dna连接酶分别将sgrna1靶点退火产物与gmpuc19-1线性化载体、sgrna2靶点退火产物与gmpuc19-2线性化载体进行连接，结果见图1中的b。然后将连接产物转化大肠杆菌dh5α，随机挑取单克隆。利用通用引物m13r（caggaaacagctatgacc，seq id no:9）与靶点特异性引物ko-pod-sg1r/sg2r进行菌落pcr，其中pcr反应体系（10 μl）包括：2 μl单克隆菌液，0.8 μl的特异性引物m13r（10 μm），0.8 μl的ko-pod-sg1r/sg2r（10 μm），5 μl的2
×
es taq mastermix（康为试剂）和1.4 μl的ddh2o。利用三步法进行扩增，反应程序为：95℃ 预变性5分钟，1个循环；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。实验结果见图1（其中a显示gmpuc19-1和gmpuc19-2质粒酶切产物电泳检测，m为dna marker，1、2分别代表未酶切的gmpuc19-1和gmpuc19-2质粒，3、4分别代表经bsa i-hf酶切后的gmpuc19-1和gmpuc19-2；b显示中间载体菌落pcr产物的电泳检测，m为dna marker，1-4代表随机挑取的ko-pod-sg1单克隆菌落，5-8代表随机挑取的ko-pod-sg2单克隆菌落；c显示双靶点敲除载体菌落pcr产物电泳检测，m为dna marker，1-6代表随机挑取的单克隆菌落）。挑取阳性单克隆进行sanger测序，测序结果表明靶点sgrna1和sgrna2装载成功。将上述构建成功的两个中间载体通过golden gate方法，将由gmu6启动子驱动的sgrna1和sgrna2表达盒连接到由大豆转录延伸因子ef1a2启动子驱动表达的spcas9载体（pgmef1a2:spcas9目的载体）上获得靶向pod基因的crispr敲除载体ko-pod，结果见图2。
34.由图1中的a可以看出， gmpuc19-1和gmpuc19-2质粒经限制性内切酶bsa i-hf酶切后，变为线性化dna。
35.由图1中的b可以看出，转化到大肠杆菌的中间载体经菌落pcr鉴定，结果表明挑取的4个ko-pod-sg1单克隆菌落和4个ko-pod-sg2单克隆菌落均为阳性克隆。
36.由图1中的c可以看出，转化到大肠杆菌的双靶点敲除载体经菌落pcr鉴定，结果表明1-5号单克隆菌落为阳性克隆。
37.由图2可以看出，构建好的pod基因双靶点敲除载体包含两个u6启动子分别驱动pod基因的两个sgrna序列，gmef1a2启动子驱动的spcas9，以及2x35s启动子驱动的抗性基因bar。
38.实施例3、大豆pod基因crispr敲除载体转化农杆菌。
39.取冻融后的农杆菌eha105感受态细胞，于细胞完全融化前加入2~3 μg敲除载体质粒ko-pod，轻轻吸打混匀，冰上孵育30分钟，液氮中速冻1分钟。然后37℃热激2~3分钟，随即转移至冰上静置3分钟。加入800 μl不含抗生素的lb液体培养基，28℃摇床中220 rpm振荡培养4~6小时。12000 rpm瞬时离心10秒，去部分上清，约留400 μl上清液以重悬菌体。吸取大约200 μl扩繁后的菌液均匀涂布到lb固体培养基（含50 mg/l硫酸卡那霉素和50 mg/l利
福平）。28℃恒温培养箱中倒置黑暗培养48小时。挑取单克隆于含有800 μl相应抗生素的lb液体培养基中，28℃，220 rpm 摇床上振荡培养4小时以上至菌液变浑浊，用引物m13r与靶点特异性引物ko-pod-sg1r/sg2r进行菌落pcr，其中pcr反应体系（10 μl）包括：2 μl单克隆菌液，0.8 μl特异性引物m13r（10 μm），0.8 μl ko-pod-sg1r/sg2r（10 μm），5 μl 2
×
es taq mastermix（康为试剂）和1.4 μl ddh2o。利用三步法进行扩增，反应程序为：95℃ 预变性5分钟，1个循环；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。结果见图3（其中m为dna marker，1-4代表随机挑取的ko-pod双靶点敲除载体质粒转化eha105农杆菌单克隆菌落），其中阳性克隆用于后续转化。
40.由图3可以看出，转化ko-pod质粒的农杆菌经菌落pcr鉴定，挑取的4个克隆均为阳性克隆。
41.实施例4、大豆突变体的获得。
42.采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法，以华春6号作为遗传转化受体。首先选取饱满均一的种子进行氯气消毒处理后，接种于萌发培养基上进行萌发3~5天。自下胚轴0.5 cm 处切下，将子叶一分为二切开，去除顶芽，制备大豆子叶节外植体，然后再将其在含有ko-pod载体的eha105农杆菌菌液中浸泡30 min，然后接种于共培养培养基上培养。共培养3天后，将愈伤组织表面上黑色物质刮掉，把豆瓣转到固体生长培养基中，每20天更换一次新的固体生长培养基，继代3~4次。待芽长到3 cm左右后，切下芽接种于生根培养基上生长，培养成苗。
43.取t0代转基因苗叶片提取dna，用特异性引物cf3492（5
’‑
ggcctgacccccaacttcaag-3’，seq id no:10）和cf3594（5
’‑
cccatcactttcacgagctc-3’，seq id no:11）检测转基因苗是否含有t-dna，并用m13f（tgtaaaacgacggccagt，seq id no:12）和ko-pod-sg2r检测是否含有gmu6:sgrna表达盒，发现编号为p4-117的植株同时含有t-dna和靶点表达盒，收取其种子繁殖下一代。
44.取t1代植株叶片提取dna，首先检测是否含有t-dna，选择含有t-dna的植株利用pod位点特异性引物v-pod-f（agagtttcgacgcaggatga，seq id no:13）和v-pod-r（gcacgagcccacttcttgat，seq id no:14）进行pcr扩增，并将扩增产物进行sanger测序检测pod位点是否发生编辑，其中pcr反应体系（50 μl）包括：5 μl dna，2 μl特异性引物v-pod-f（10 μm），2 μl v-pod-f（10 μm），25 μl 2
×
es taq mastermix（康为试剂）和16 μl ddh2o。利用三步法进行扩增，反应程序为：95℃ 预变性5分钟，1个循环；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。结果发现a760单株的pod位点可能发生编辑，收集该单株种子繁殖获得t2代植株。通过对t2代植株进行检测，发现了一种类型的pod变异，其pod位点缺失了3个碱基，导致1个氨基酸的缺失变异，将该突变体命名为podb，收集其种子并种植获得更高世代的纯合突变体。实验结果见图4（其中，a为pod基因与突变基因结构对比图，tss代表转录起始位点，tts代表转录终止位点，箭头指示转录的方向；b显示pod蛋白质第31位脯氨酸缺失）。
45.由图4中的a可以看出，在大豆pod基因起始密码子下游92bp处发生了连续3个碱基缺失，缺失核苷酸为caa。
46.由图4中的b可以看出，突变体podb导致大豆pod蛋白质的第31位的脯氨酸缺失。
47.实施例5、大豆pod基因突变体田间实验。
48.按照株距20厘米、行距40厘米的种植规格，将t3代纯合突变体podb和野生型poda，于11月在海南种植进行农艺性状考察。大豆成熟后考察植株的株高、底荚高度、分枝数、节数、单株荚数、每节荚数、每荚粒数、粒重、单株产量等。
49.大豆pod突变体田间农艺性状调查结果见表1。
50.表1 大豆pod突变体田间农艺性状调查结果
材料株高（cm）主茎节数（个）有效分枝（个）单株荚数（个）单株籽粒数（粒）单荚粒数（粒）百粒重（g）单株籽粒重（g）poda22.9
±
3.211.1
±
1.63.6
±
1.221.8
±
6.244.6
±
11.92.1
±
0.317.1
±
4.97.6
±
2.2podb21.7
±
3.111.6
±
1.04.1
±
1.127.8
±
6.1**57.5
±
13.9**2.1
±
0.217.6
±
4.710.1
±
2.9**
51.注： n = 10，利用t-test进行显著性检验，**表示p 《 0.01由表1可以看出，表型分析发现podb突变体的单株荚数、单株籽粒数和单株产量与比野生型对照poda相比都显著增加，而株高、主茎节数、底荚高度、有效分枝、单荚粒数、百粒重、含油量和蛋白质含量等主要农艺性状与野生型相比未发现显著差异。说明大豆pod突变基因podb能提高大豆的单株荚数、单株籽粒数和单株产量，从而提高大豆的品质和产量。
52.实施例6、大豆pod基因在大豆各个组织中的表达量分析。
53.设计pod基因特异pcr引物：rx120 （aaccctaaccagttagcgaac，seq id no:15）和rx121 （tccctcgaattcgaagatgat，seq id no:16）。
54.内参基因gmef-1α特异引物：rx118 （tgcaaaggaggctgctaact，seq id no:17）和rx119 （cagcatcaccgttcttcaaa，seq id no:18）。
55.提取野生型大豆开花期的根、茎、花、根瘤、不同发育程度的叶片以及豆荚发育时期不同长度的豆荚中的总rna，取2 μg总rna利用反转录试剂盒（transscript
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one-step gdna removal and cdna synthesis supermix）进行反转录生成cdna，反转录体系（20 μl）包括：2 μg rna，1 μl oligo(dt)
18
（0.5 μg/μl），1 μl酶e-mix，10 μl反应溶液r-mix，1 μl gdna remover，最后补ddh2o至总体积20μl。反应体系加好后，42℃孵育15分钟，反转录的产物稀释10倍后即可作为后续定量pcr的模板。然后利用qrt-pcr试剂盒检测上述大豆组织中pod基因的表达水平。qrt-pcr反应体系（20 μl）包括：6 μl稀释好的cdna模板，内参基因gmef-1α和正反向引物（引物rx120/rx121扩增pod基因，引物rx118/119扩增内参基因gmef-1α）各0.5 μl（10 μm），10 μl 2
×
sybr green qpcr master mix（诺唯赞），ddh2o至总体积20μl。反应程序为：95℃ 预变性3分钟，1个循环；95℃变性10秒，60℃退火30秒（采集荧光信号），50个循环；最后溶解曲线步骤为95℃变性15秒，60℃退火60秒，95℃变性15秒，1个循环。由于豆荚起始于茎节组织，将茎切分为茎节间和茎节，利用qrt-pcr试剂盒分别检测茎节间和茎节中pod基因的表达水平。实验结果见图5（其中a为pod基因在野生型大豆各个组织中的表达量；b为pod基因在大豆茎不同部位的表达量，内参基因为gmef-1α，每组数据为3次实验重复平均值）。
56.由图5中的a可以看出， pod基因主要在大豆的茎和根瘤中表达，在其它组织几乎不表达。
57.由图5中的b可以看出，pod基因在茎节中的表达量明显高于在茎节间中的表达量。
58.实施例7、大豆pod同源基因在豆科植物中的序列保守性分析。
59.利用pod蛋白质序列在植物基因组数据库phytozome进行blast序列比分析，下载蛋白序列保守性较高的pod同源蛋白序列，利用进化树分析软件mega5.1对检索到pod同源蛋白进行系统进化树分析，同时利用dnaman软件对来自不同物种的pod同源蛋白进行序列
保守性分析，结果见图6（其中a为双子叶植物中pod同源蛋白系统进化树分析，大豆k7l548为pod基因编码蛋白；b为双子叶植物中pod蛋白部分保守区域序列比对，下划线标注区域为保守的phd-type结构域），发现pod蛋白在多个双子叶植物中保守存在，尤其是组成phd-type结构域的氨基酸序列在各个物种中高度保守。
60.由图6中的a可以看出，系统进化树中pod蛋白在多种重要农业作物和果树中都保守存在。
61.由图6中的b可以看出，来自不同物种的pod同源蛋白在氨基酸序列上高度保守，尤其是组成phd-type结构域及其相邻区域的氨基酸序列在这些物种中高度保守。
62.说明能将pod突变基因转入双子叶植物并表达pod同源蛋白，提高双子叶植物的产量相关性状。
63.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种大豆突变基因，其特征在于：所述大豆突变基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。2.权利要求1所述的大豆突变基因在提高豆科作物产量中的应用，其特征在于：所述提高豆科作物产量包括提高单株荚数、单株籽粒数和单株产量。3.一种重组载体在提高豆科作物产量中的应用，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1所述的大豆突变基因。4.一种转基因细胞在提高豆科作物产量中的应用，其特征在于：所述转基因细胞含有权利要求1所述的大豆突变基因。5.权利要求1所述的大豆突变基因在双子叶植物分子育种中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将所述的大豆突变基因转入所述双子叶植物并表达pod同源蛋白。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的双子叶植物为大豆、鹰嘴豆、菜豆、赤小豆、苜蓿、棉花、葡萄、樱桃、薄壳山核桃或橙子。

技术总结
本发明提供了一种提高豆科作物产量的大豆突变基因及其应用。该基因由大豆POD基因（Glyma.08G055900）核苷酸序列中至少一个核苷酸发生突变后获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明以大豆POD基因（Glyma.08G055900）为模板，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得一种POD突变基因。将此突变基因转入大豆细胞，能获得豆荚数目和单株产量显著提高的转基因大豆，改善大豆产量相关性状，为大豆育种提供了更加有效的技术手段。为大豆育种提供了更加有效的技术手段。为大豆育种提供了更加有效的技术手段。


技术研发人员：朱友林 王东 杨荣新 蒋丽芸 钟丽梅 贺热情 阎新 刘金龙
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：2023.08.18
技术公布日：2023/9/20