用于测量尿中海藻糖酶的溶液以及使用该溶液的测量方法与流程

1.本发明涉及这样的海藻糖溶液，其与尿葡萄糖测量试剂盒一起使用以在体外诊断(生物化学医学诊断)领域中来测量作为肾损伤指示的尿海藻糖酶酶活性，以及使用该溶液的测量方法。


背景技术：

2.海藻糖酶是分子量为75kda的糖蛋白结构酶，并存在于肾近端小管和肠中。尿海藻糖酶测量可用于筛选、诊断和监测肾近端小管中发生的损伤
(1,2)
。据报道，即使在以下情况下，海藻糖酶活性也高于对照组：自糖尿病早期阶段起蛋白尿和糖尿均为阴性的情况下；而且在糖尿病晚期，由于近端小管中刷状缘的消失，活性降低
(3)
。其可以表明由于一些环境毒素引起的早期肾损伤。其表明，在熔铅工人中与对照组相比，海藻糖酶活性提高；血铅水平与尿海藻糖酶活性之间呈正线性关系。并且在环境镉暴露的情况下，观察到类似的活性提高
(4-6)
。据报道，在婴儿中使用氨苄青霉素和妥布霉素抗生素会提高尿海藻糖酶活性
(7)
。在慢性肾小球疾病(并且特别是肾病综合征)中，观察到尿海藻糖酶活性提高
(8)
。
3.目前有多种方法用于测量尿中的海藻糖酶。这些方法分为两个主要的组，即测量海藻糖酶活性的方法(比色法)和质量测量法(免疫化学法)。然而，没有开发出作为常规诊断实验室中常用的试剂盒的实例。因此，特别需要提供早期、快速、广泛和经济的肾损伤诊断的方法。
4.因此，由于现有解决方案的上述缺点和不足，有必要开发相关技术。


技术实现要素：

5.本发明涉及满足上述需求的尿海藻糖酶测量，其消除了所有缺点并提供了一些另外的优点。
6.本发明的主要目的是提供已经用于测量尿葡萄糖的试剂盒也用于尿海藻糖酶活性测量的用途，并从而使得非常快速和广泛地满足海藻糖酶测量的需要。因为与尿海藻糖酶测量相反，尿葡萄糖测量是全世界几乎所有医学诊断实验室进行的常规测量。本发明将使得广泛使用的尿葡萄糖测量也能够用于尿海藻糖酶活性测量。没有其他产品用于此目的。
7.为了实现上述目的，本发明是与尿葡萄糖测量试剂盒一起使用以在生物化学诊断领域中用于测量尿海藻糖酶活性的海藻糖溶液。在本发明的优选应用中，所述溶液包含浓度范围为0.2至68.0g/dl，优选40g/dl的海藻糖。本发明还包括含有所述溶液的尿海藻糖测量试剂盒。
8.为了实现上述目的，本发明是尿海藻糖酶测量的方法，其中使用所述溶液，并包括以下过程步骤：
9.a)将海藻糖溶液与尿样品混合,
10.b)在预定的温度和持续时间下孵育混合物，
11.c)通过使用选定的尿的葡萄糖测量试剂盒来测量混合物中的葡萄糖，
12.d)在前述步骤的所述同等条件下，测量添加去离子水的尿混合物中的葡萄糖，
13.e)评价两个葡萄糖测量结果之间的差。
14.根据本发明的应用，过程步骤“a”中的所述海藻糖溶液包含浓度范围为0.2至68.9g/dl，优选40g/dl的海藻糖。
15.根据本发明的应用，在过程步骤“a”中，将1单位体积的海藻糖溶液与39单位体积的尿混合。
16.根据本发明的应用，在过程步骤“d”中，将1单位体积的去离子水与39单位体积的尿混合。
17.根据本发明的应用，在过程步骤“e”中，将海藻糖溶液与去离子水混合，并将这两个不同的尿葡萄糖测量之间的差计算为海藻糖酶活性。
18.根据本发明的应用，在过程步骤“e”中，根据海藻糖酶形成的葡萄糖浓度，将海藻糖酶活性结果计算为u/l。
19.根据本发明的应用，在过程步骤“e”中，将每分钟从1μmol海藻糖产生2μmol葡萄糖的海藻糖酶活性假定为单位(u)。
20.在下面给出的详细描述中将更好地理解本发明的结构和特征性特征以及所有优点，并因此，应该考虑附图和详细解释来进行评估。
具体实施方式
21.在本详细描述中，为了更好地理解本发明，并且以不形成任何限制效果的方式，描述了本发明和本发明的优选应用。
22.本发明是与尿葡萄糖测量试剂盒一起使用以在生物化学诊断领域中用于测量尿海藻糖酶活性的海藻糖溶液。
23.本发明的海藻糖溶液还提供了在世界范围内的医学诊断实验室中用于尿葡萄糖常规测量的试剂盒也用于尿海藻糖酶活性测量的用途。
24.将本发明溶液中包含的海藻糖添加至尿。其被尿中的海藻糖酶转化成葡萄糖。
25.用于常规测量尿中葡萄糖的试剂盒也可以测量添加了本发明溶液或去离子水的尿中的葡萄糖。添加溶液和去离子水的两个不同测量之间的差示出了海藻糖酶活性。
26.本发明使用的尿葡萄糖测量试剂盒还包含尿分析反应检测试纸(dipstick)。其测量用本发明的海藻糖溶液处理的尿中形成的葡萄糖。医学诊断实验室中常规使用的任何类型的商业试剂盒都可用于通过本发明的溶液测量尿中的葡萄糖。
27.通过本发明的溶液进行的测量尿中海藻糖酶的方法包括最基本形式的以下过程步骤。
28.a)将海藻糖溶液与尿样品混合,
29.b)在预定的温度和持续时间下孵育混合物，
30.c)通过使用选定的尿的葡萄糖测量试剂盒来测量混合物中的葡萄糖，
31.d)在前述步骤的所述同等条件下，测量添加去离子水的尿混合物中的葡萄糖，
32.e)评价两个测量之间葡萄糖结果的差。
33.本发明的海藻糖溶液包含浓度范围为0.2至68.9g/dl，优选40g/dl的海藻糖，所述
海藻糖以不影响海藻糖酶活性的方式溶解在去离子水或另外的溶液中。将1单位体积的该溶液与39单位体积的尿混合。在本发明的另一些应用中，如果海藻糖溶液含有的海藻糖浓度不同于40g/dl，则改变溶液和尿的体积使得含有的海藻糖最终浓度在0.1至5g/dl范围内，优选1g/dl。将其保存在适当的温度下持续适当的时间。溶液中的海藻糖被尿中的海藻糖酶转化成葡萄糖。尿中海藻糖酶的浓度越高，则产生的葡萄糖越多。
34.用于常规测量尿中葡萄糖的试剂盒也可以测量添加了本发明溶液的尿中的葡萄糖。
35.同样的测量也通过使用添加了相同体积去离子水而非溶液的尿，并在相同条件(时间和温度)下孵育来进行。将该测量结果假定为空白。
36.通过添加溶液和去离子水的两个不同的尿葡萄糖测量之间的差示出海藻糖酶的活性。
37.根据由海藻糖酶形成的葡萄糖浓度，海藻糖酶活性结果以u/l计算。在计算中，还考虑了溶液与尿孵育的时间段、稀释因数和最终孵育体积。将每分钟从1μmol海藻糖产生2μmol葡萄糖的海藻糖酶活性假定为一个单位(u)。
38.尿海藻糖酶活性测量实施例1：
39.尿样品的收集：
40.从患者处收集随机的中段尿。尿样品不能浑浊。将尿样品置于干净且干燥的管中。在替代应用中，样品不需要立即进行分析，并可以在密闭管中在+4℃下储存2小时，在-20℃下储存48小时。
41.尿与40％海藻糖溶液的混合和孵育：
42.将取自患者的975μl尿与25μl 40％海藻糖溶液置于样品管中。将取自患者的975μl尿与25μl去离子水置于空白管中。将管在37℃下孵育30分钟。
43.在替代应用中，如果海藻糖溶液具有不同的浓度，则所用尿和溶液的体积可以相应地改变。孵育期和温度可因实验室条件而异。
44.海藻糖酶活性测量：
45.测量原理基于测量尿中的海藻糖被海藻糖酶转化成葡萄糖而形成的葡萄糖。
46.尿葡萄糖在abbot architect c8000(usa)装置上用architect牌葡萄糖试剂盒(参考号：3l82，germany)通过动力学比色法根据试剂盒说明进行测量。
47.分别测量添加海藻糖溶液的尿样品和添加去离子水的尿样品中的葡萄糖，并将其差认为是海藻糖酶活性。
48.尿葡萄糖测量实验原理：
49.葡萄糖在腺苷三磷酸(atp)和镁离子存在下被己糖激酶磷酸化；并产生葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，g-6-p)和腺苷二磷酸(adp)。当葡萄糖6磷酸脱氢酶(g-6-pdh)将g-6-p氧化成磷酸葡萄糖酸酸(phosphogluconate)时，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)被转化成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)。每一个消耗的葡萄糖分子产生一个nadh。产生的nadh吸收340nm处的光，并通过分光光度法检测到吸光度提高。方法在《800mg/dl(44mmol/l)范围内呈线性。
50.尿海藻糖酶活性的计算：
51.在用添加海藻糖溶液的尿样品和添加去离子水的尿样品分别进行葡萄糖测量之
后，获得了以下结果：
52.添加海藻糖溶液的尿的葡萄糖浓度：115mg/dl
53.添加去离子水的尿的葡萄糖浓度：7mg/dl
54.差＝115mg/dl-7mg/dl＝108mg/dl＝1080mg/l＝6mm＝6000μm(注：葡萄糖的分子量为180g/mol)
55.将每分钟从1μmol海藻糖产生2μmol葡萄糖的海藻糖酶活性假定为一个单位(u)。因为实验的孵育时间是30分钟，因此在1分钟内产生葡萄糖：
56.6000μm/30分钟.＝200μm/分钟./2＝100u/l
57.由于在测量之前将1单位体积的海藻糖溶液添加至39单位体积的尿中，因此将结果乘以“40
÷
39＝1.025”以校正稀释因数：
58.尿海藻糖酶活性：100u/l
×
1.025
59.尿海藻糖酶活性：102.5u/l
60.参考文献
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技术特征：
1.海藻糖溶液，其与尿葡萄糖测量试剂盒一起使用以在生物化学诊断领域中用于测量尿海藻糖酶活性。2.根据权利要求1所述的溶液，并且其特征在于含有0.2至68.9g/dl浓度的海藻糖。3.尿海藻糖酶测量试剂盒，其包含根据权利要求1或权利要求2所述的溶液。4.用于测量尿中海藻糖酶的方法，并且其特征在于包括以下过程步骤：a)将海藻糖溶液与尿样品混合，b)在预定的温度和持续时间下孵育混合物，c)通过使用选定的尿的葡萄糖测量试剂盒来测量混合物中的葡萄糖，d)在前述步骤的所述同等条件下，测量添加去离子水的尿混合物中的葡萄糖，e)评价两个葡萄糖测量之间结果的差。5.根据权利要求4所述的方法，并且其特征在于包括，在过程步骤“a”中，所述海藻糖溶液含有40g/dl浓度的海藻糖。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于在过程步骤“a”中，将1单位体积的海藻糖溶液混合到39单位体积的尿中。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于在过程步骤“d”中，将1单位体积的去离子水与39单位体积的尿混合。8.根据权利要求4所述的方法，并且其特征在于在过程步骤“e”中，将海藻糖溶液与去离子水混合，并且将两个不同的尿葡萄糖测量之间的差计算为海藻糖酶活性。9.根据权利要求4所述的方法，并且其特征在于在过程步骤“e”中，根据由海藻糖酶形成的葡萄糖浓度，将海藻糖酶活性结果计算为u/l。10.根据权利要求4所述的方法，并且其特征在于在过程步骤“e”中，将每分钟从1μmol海藻糖产生2μmol葡萄糖的海藻糖酶活性假定为一个单位(u)。

技术总结
本发明涉及这样的海藻糖溶液，其与尿葡萄糖测量试剂盒一起使用以在体外诊断(生物化学医学诊断)领域中测量作为肾损伤标志物的尿海藻糖酶活性，以及使用该溶液的测量方法。以及使用该溶液的测量方法。


技术研发人员：比伦特
受保护的技术使用者：阿克隆医疗档案和适应症动物档案公司
技术研发日：2021.11.11
技术公布日：2023/9/20