蛋白质与配体相互作用的鉴定和监测方法与流程

1.本发明总体上涉及生物化学领域。特别地，本发明涉及检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法。本文还提供了鉴定候选配体或预测药物在受试者中的疗效的方法。


背景技术：

2.鉴定和监测蛋白质化学相互作用的能力在生物学、化学和药物发现方面有许多重要应用。例如，在筛选用于药物发现和后续开发的大型化学文库时，监测蛋白质化学相互作用是很重要的。了解药物与其他可能导致不良副作用的蛋白质脱靶相互作用也很重要。
3.然而，现有的识别和监测蛋白质化学相互作用的方法通常需要使用重组蛋白质和修饰的生物活性化合物。这可能会损害所获得数据的生理相关性。例如，用重组蛋白筛选和鉴定的药物可能不会在细胞内与靶标结合。用重组蛋白鉴定的药物可能具有未知的脱靶活性，从而导致毒性。重组蛋白也可能在细胞外采用不同的结构构象，并且可能难以表达。此外，从表型药物筛选中鉴定的生物活性化合物的作用机制或蛋白质靶标通常是未知的。
4.因此，通常希望克服或改善上述一个或多个困难。


技术实现要素：

5.本文公开了一种检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法，所述方法包括：
6.a)使样品与细胞渗透性变性剂接触以促进样品中靶标的细胞内去折叠，
7.b)裂解样品；和
8.c)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标水平的差异指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。
9.本文公开了一种用于实施本文定义的方法的试剂盒。
10.本文公开了一种鉴定能够与靶标结合的候选配体的方法，所述方法包括：
11.a)使样品与候选配体接触；
12.b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；
13.c)裂解样品；以及
14.d)检测或测定所述非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，所述非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示所述候选配体能够结合所述靶标。
15.本文公开了一种预测药物在受试者中的疗效的方法，所述方法包括
16.a)从已经用所述药物治疗的受试者获得样品；
17.b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进靶标的细胞内去折叠；
18.c)裂解样品；
19.d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示药物与靶标的结合，从而预测药物在受试者中的疗效。
20.本文公开了一种鉴定受试者中与药物结合的靶标的方法，所述方法包括：
21.a)从已经用所述药物治疗的受试者获得样品；
22.b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；
23.c)裂解样品；以及
24.d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示药物与靶标的结合。
附图说明
25.以下仅通过非限制性示例的方式，参照附图描述本发明的实施方案，其中：
26.图1：通用细胞图谱(ucep)技术在药物发现中面临和解决的问题概述。
27.图2：图示说明了ucep的基本工作流程，所述ucep基于蛋白质在药物存在(和不存在)下的物理稳定性来鉴定药物靶蛋白。
28.图3：显示ucep筛选系统工作流程的示意图。首先，使用flp-in t-rex或crispr技术产生报告细胞。然后，在大规模小分子筛选之前，针对理想的ucep条件对报告细胞进行优化。
29.图4：摩尔浓度响应(mr)实验的ucep-介入(ucep-engage)的代表性印迹。所有实验都在一个生物重复中进行(n＝1)。gapdh或α-微管蛋白用作上样对照。(a)在3m、4m和5m条件下，mtx处理的可溶性dhfr丰度显著高于对照。这表明dhfr在k562细胞中被mtx强烈稳定。(b)在4m和5m条件下，mtx处理的可溶性ts丰度显著高于对照。说明mtx能稳定k562细胞中的ts。(c)在4m、5m和7m条件下，pan处理的可溶性hdac2丰度高于对照。这表明，在hepg2细胞中，pan对hdac2具有稳定作用。(d)在3m至7m的尿素浓度下，达沙替尼(dasanitib)处理组的可溶性abl激酶和bcr-abl融合蛋白的丰度显著高于dmso处理的对照组。这表明abl和bcr-abl蛋白都被达沙替尼稳定。
30.图5:ucep剂量反应实验，用于确定mtx和pan的靶标结合亲和力。(a)从0到40um的mtx，dhfr带强度以剂量依赖的方式逐渐增加。(b)同样，在帕比司他(panobinostat)处理的细胞中也观察到可溶性hdac2的丰度从0增加到10um，其中gapdh被用作上样对照。使用image lab对谱带强度进行半定量，并通过graphpad拟合剂量-反应曲线以计算ec50。
31.图6:mr实验的ucep-鉴定(ucep-id)火山图。(a)k562中甲氨蝶呤的靶向去卷积(n＝1)。二氢叶酸脱氢酶(dhfr)被检测为mtx唯一的药物结合靶标。(b)hepg2中帕比司他的靶向去卷积(n＝1)。一些靶标通过了过滤标准，并被检测到被帕比司他稳定。它们是hdac1、hdac2、ttc38、hdac6、cavin1、pah和adh5。(c)在稀释缓冲液中添加np40的hepg2中帕比司他的靶向去卷积(n＝2)。er膜蛋白fads1和fads2被鉴定蛋白质覆盖度增加。(d)k562中达沙替尼的靶向去卷积(n＝2)。已知的直接靶标，abl和btk激酶被检测为结合靶标。
32.图7:ucep测定开发的验证。(a)在hek293 dhfr-hibit细胞中，在进行或不进行ucep的情况下评估了五种不同化合物对蛋白质稳定性的影响。用20μm的化合物处理细胞10分钟。(b)选择性dhfr抑制剂甲氨蝶呤和氨基蝶呤的化学结构。(c)非dhfr抑制剂星形孢菌素(staurosporine)、恩杂鲁胺(enzalutamide)和帕比司他的化学结构。
33.dhfr:二氢叶酸还原酶
34.图8：不同化学变性剂的比较。hek293 dhfr hibit细胞用20μm甲氨蝶呤处理10分钟，然后用ucep处理。在ucep中，使用3m尿素、正甲基脲、盐酸胍或硫氰酸胍。使用pbs作为载体。结果显示蛋白质稳定性发生了倍数变化。dhfr:二氢叶酸还原酶
35.图9：磁性微珠与离心法分离蛋白质聚集体的效率比较。结果表明，磁性微粒在4m变性条件下可以优先捕获dhfr聚集体(未结合的蛋白质)，其效率与离心法相同。然而，不是药物靶标的α-微管蛋白也被simag-c1完全拉下，而不受simag-s的影响。研究表明，磁珠的不同表面化学性质可能会将蛋白质的可溶性部分吸收到磁珠上，特别是包被烷基的磁珠。
36.图10：不同有效尿素摩尔浓度下报告细胞中药物结合亲和力的测定。(a)hdacl-hibit报告细胞用不同剂量的帕比司他处理5分钟，然后用4m、5m、6m和7m尿素进行ucep。使用不同尿素浓度计算的结合亲和力是相似的，并且在实验变化范围内(n＝3)。(b)dhfr hibit报告细胞用不同浓度的氨基蝶呤处理10分钟，然后用2m、3m、4m和5m尿素进行ucep。氨基蝶呤在使用的不同尿素浓度之间显示出相似的结合亲和力(n＝2)。数据表示为平均值
±
sem。
37.图11:在3m至5m尿素的1％chaps存在下，图卡替尼(tucatinib)处理增加了her2-hibit报告细胞中蛋白质靶标的稳定性。将来自处理的测定生物发光信号值除以来自对照组的值以计算倍数变化，并在graphpad中绘制。
具体实施方式
38.本说明书教导了检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法。所述方法可以包括a)使样品与细胞渗透性变性剂接触以促进样品中靶标的细胞内去折叠。所述方法可包括b)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或者聚集性靶标水平的差异指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。所述方法可以包括在检测或测定非聚集性靶标的水平之前裂解样品。
39.本文公开了一种检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法，所述方法包括：a)使样品与细胞渗透性变性剂接触以促进样品中靶标的细胞内去折叠，b)裂解样品；和c)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。
40.在不受理论约束的情况下，本发明描述了允许使用细胞渗透性化学变性剂来鉴定和监测细胞裂解物中和细胞中的化学蛋白质相互作用的一系列步骤和步骤组合。细胞渗透性化学变性剂可用于存在化学/药物的情况下在细胞内使蛋白质去折叠，然后快速细胞裂解以稀释变性剂，从而产生蛋白质沉淀，然后通过离心、过滤或微珠将其与可溶性蛋白质分离。与用于鉴定相互作用蛋白质的未结合蛋白质相比，与蛋白质的化学结合可以改变影响蛋白质聚集或沉淀倾向的蛋白质的物理稳定性。在裂解过程中可以添加其他化学物质或物理颗粒，如微珠或类似材料，以增强聚集和沉淀。
41.裂解步骤可以通过添加细胞裂解缓冲液、样品的快速冻融和/或机械裂解技术(例如通过使样品通过注射器)来完成。在一个实施方案中，裂解步骤是快速细胞裂解。裂解步骤可以导致细胞渗透性变性剂的快速稀释。在一个实施方案中，裂解样品的步骤诱导未折叠靶标的聚集。裂解步骤允许在单个步骤中进行化学变性剂的稀释和靶标的提取。
42.裂解步骤优选非变性裂解，允许靶蛋白保持天然的，即正确折叠或天然样构象。这在本文中被称为天然裂解。这可以用化学方法或用本领域熟知的试剂例如溶菌酶和洗涤剂进行。裂解的程度必须足以允许细胞的蛋白质自由通过细胞。通常，当处理与膜结合的蛋白质时，裂解是在洗涤剂或两亲物(例如triton x-100或十二烷基麦芽糖苷)的存在下进行
的，以从膜释放蛋白质。裂解步骤也可以通过冷冻-解冻细胞来进行。更优选地，使用天然裂解缓冲液和冻融细胞两种进行裂解。优选地，裂解缓冲液含有溶菌酶，例如50-750μg/ml，更优选100-200μg/ml。脱氧核糖核酸酶也可以在天然裂解缓冲液中发现，优选为250-750μg/ml。天然裂解缓冲液可以含有例如20mm tris、ph 8、100mm nacl、溶菌酶(200μg/ml)和脱氧核糖核酸酶i(750μg/ml)。对于已知插入细胞膜中的靶蛋白，将洗涤剂以典型浓度添加到裂解缓冲液中，其中它们已知以天然形式(例如1％正十二烷基-β-麦芽糖苷)溶解膜插入蛋白。优选重复进行冻融步骤，即进行两个或更多个循环，优选3个或更多的冻融循环。
43.在一个实施方案中，裂解步骤包括使用洗涤剂。洗涤剂可以包括np40、ddm(正十二烷基-b-d-麦芽糖苷)和/或chap(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸酯)。可以使用洗涤剂的混合物。
[0044]
本文定义的方法可以包括检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平(或丰度)。与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异或变化可以例如指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。例如，与参考相比，非聚集性靶标水平增加或聚集性靶标水平降低可指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。
[0045]
例如，术语“参考”可以指参考或对照样本中的非聚集性靶标或聚集性靶标的水平。例如，参考或对照样品可以是不存在配体的样品。
[0046]
术语“非聚集性靶标”可指样品中存在的折叠和未折叠靶标。本文定义的方法可以包括检测或测定“非聚集性靶标”的水平，其可以包括折叠的和未折叠的靶标。例如，所述方法可以通过测定样品可溶性部分中折叠和未折叠靶标的总量来检测或测定“非聚集性靶标”的水平。在另一个实施方案中，所述方法可以仅检测或测定折叠的靶标。例如，所述方法可以使用试剂(例如抗体)，该试剂可以特异性地检测或测定折叠的靶标，但不能检测或测定未折叠或聚集性的靶标。
[0047]
在一个实施方案中，步骤c)包括检测或测定折叠靶标的水平，其中与参考相比折叠靶标水平的增加指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。
[0048]
样品可以包括来源于体液、血液、组织、类器官和/或培养细胞的活细胞或完整细胞。样品可以是细胞或组织样品。样品可以包括一种或多种细胞。该细胞可以是哺乳动物细胞、细菌细胞或酵母细胞。样品可以包括表达重组靶标的细胞。重组靶标可以与标签融合，用于靶标的测定或检测。
[0049]
在一个实施方案中，样品是从受试者获得的样品。
[0050]
如本文所用，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。在一个实施方案中，受试者是人。“非人类动物”一词包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
[0051]
所述方法可以包括使样品与细胞渗透性变性剂接触以促进样品中靶标的细胞内去折叠。术语“接触”可以指将样品与细胞渗透性变性剂孵育足够的时间，以使样品中的靶标的细胞内去折叠。
[0052]
本文所述的细胞渗透性变性剂可以是例如尿素或其衍生物(例如硫脲或甲基脲)。细胞渗透性变性剂可能能够渗透完整细胞或活细胞以促进蛋白质的细胞内去折叠。细胞渗透性变性剂可能能够促进细胞内或细胞外靶标在完整细胞或活细胞中或其上的去折叠。
[0053]
靶标可以是能够使用本文定义的方法检测或测定的任何分子。所述靶标可以是细
胞内靶标。在一个实施方案中，靶标是蛋白质。所述蛋白质可以是细胞内蛋白质。在另一个实施方案中，所述蛋白质是细胞外或膜蛋白。靶标可以是与核酸结合或相关的靶标。靶标可以以任何方式修饰，例如通过翻译后修饰(例如磷酸化)或通过定点诱变。靶标可以是融合蛋白。
[0054]
术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指通过肽键或修饰肽键连接的氨基酸(二肽或更大)的任何聚合物。少于约10-20个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。本发明的多肽可以包括非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其他非肽取代基可以由产生多肽的细胞添加到多肽中，并且会随着细胞类型的不同而变化。多肽在本文中根据其氨基酸骨架结构进行定义；诸如碳水化合物基团的取代基通常没有具体说明，但仍可存在。
[0055]
术语“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换地用于表示核苷酸的聚合物，其可以是mrna、rna、crna、cdna或dna。该术语通常指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的dna。
[0056]
在一个实施方案中，靶标是重组蛋白。“重组蛋白”是指使用重组技术，即通过表达重组多核苷酸制备的蛋白质。本文所用的术语“重组多核苷酸”是指通过操纵核酸在体外形成的多核苷酸，所述多核苷酸形成自然界中通常未发现的形式。例如，重组多核苷酸可以是表达载体的形式。通常，这样的表达载体包括与核苷酸序列可操作连接的转录和翻译调控核酸。
[0057]
本文中使用的术语“配体”是指能够结合另一分子的分子，包括但不限于小分子、肽、蛋白质、rna、dna、脂质和碳水化合物。在一个实施方案中，靶标在细胞内与配体结合。
[0058]
在一个实施方案中，所述方法包括在步骤c)之前去除聚集的和/或未折叠的靶标。所述方法可以包括从可溶性级分中分离不溶性级分。这可能涉及使用微滤、离心、亲和树脂和/或微珠。在一个实施方案中，离心用于将包含聚集靶标的不溶性悬浮颗粒与细胞碎片一起沉淀到小瓶底部。在另一个实施方案中，亲和树脂和/或微珠可用于去除聚集的靶标以及可溶性未折叠靶标。
[0059]
在一个实施方案中，所述方法包括在步骤c)之前在变性条件下去除聚集的和/或未折叠的靶标。这增强了从可溶性级分中对聚集的和/或未折叠的靶标的去除。在一个实施方案中，这增强了用微珠/纳米珠对聚集的和/或未折叠的靶标的去除。
[0060]
本文定义的方法可以检测样品中与配体结合的靶标的存在或不存在。本文定义的方法还可以告知与样品中配体结合的靶标的水平。例如，所述方法可以告知与样品中配体结合的靶标的百分比(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。
[0061]
在一个实施方案中，所述方法还包括检测或测定在不同浓度的变性剂下配体与靶标的结合。变性剂的浓度可以是能够诱导靶标去折叠的任何浓度。例如，浓度可以是0.5m、1m、1.5m、2m、2.5m、3m、3.5m、4m、4.5m、6m、6.5m、7m、7.5m、8m、8.5m、9m、9.5m、10m、10.5m、11m、11.5m、12m、12.5m或更高。
[0062]
在一个实施方案中，所述方法在动物的生理温度下进行。例如，所述方法可以在大约人体体温(即37℃)下进行。
[0063]
在一个实施方案中，靶标被偶联到标签上。例如，靶标可以表达为具有标签的融合蛋白。该标签可以是hibit标签，它是一种小的11个氨基酸的肽，以高亲和力与较大的lgbit亚基结合。结合的复合物具有荧光素酶活性，可用于靶标的检测或测定。
[0064]
靶标可以通过质谱法(用于鉴定未知靶标)或通过识别分子(例如抗体或适体)检测。识别分子可以是能够识别靶标或与靶标结合的任何分子。靶标也可以通过本领域熟知的任何其他生物分析技术检测。例如，靶标可以通过荧光蛋白指纹图谱、基于单分子荧光共振能量转移(fret)的肽指纹图谱或纳米孔技术检测。
[0065]“抗体”是指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应当理解，该术语扩展到表现出抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。可用于本发明实践的代表性抗原结合分子包括多克隆和单克隆抗体及其片段(如fab、fab’、f(ab’)2、fv)、单链(scfv)和结构域抗体(包括诸如鲨鱼和骆驼抗体)，以及包含抗体的融合蛋白，以及包含抗原结合/识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，例如igg、iga或igm(或其亚类别)，并且抗体不需要属于任何特定类别。
[0066]
本文中使用的术语“免疫测定”是指利用抗体或其抗原结合片段检测靶标的能力的分析方法。本定义涵盖了一系列免疫测定形式，包括但不限于直接免疫测定或间接免疫测定(包括蛋白质印记)和“三明治”免疫测定(例如夹心酶联免疫吸附测定(elisa))。
[0067]
抗体-靶标复合物的检测可以通过几种方法进行。靶标可以用诸如生物素、酶、荧光标志物或放射性的标记物制备，并且可以使用该标记物直接检测。或者，可以添加识别一抗的标记“二抗”或“报告抗体”，形成由靶-抗体-抗体组成的复合物。然后，再次加入适当的报告试剂以检测标记的抗体。可以根据需要添加任意数量的额外抗体。这些抗体也可以用标志物标记，包括但不限于酶、荧光标志物或放射性。靶标或抗体(一抗或二抗)可以固定在固体支持物上，但标记的组分不能固定，因为可检测的信号被排除在结合量之外。
[0068]
如本文所用，术语“报告试剂”是指能够检测与靶标结合的抗体存在的化合物。例如，报告试剂可以是附着在酶底物上的量热物质。当抗体和靶标结合时，酶作用于其底物并产生颜色。其他报告试剂包括但不限于发荧光的和放射性的化合物或分子。
[0069]
如本文所用，术语“固体支持物”是指可以附着试剂(如抗体、靶标和其他化合物)的任何固体材料。例如，在elisa方法中，微量滴定板的孔通常提供固体支撑。固体支持物的其他实例包括硝化纤维素膜、显微镜载玻片、盖玻片、珠、颗粒、细胞培养瓶以及许多其他物品。
[0070]
如本文所用，术语“标记”和用于检测抗体-靶标复合物的手段是指直接或间接参与产生指示复合物存在的可检测信号的分子。任何标记或指示手段都可以连接或结合到作为本发明一部分的表达的蛋白质、肽或抗体分子中，或单独使用，并且这些原子或分子可以单独使用或与其他试剂结合使用。这样的标记本身在临床诊断化学中是众所周知的。
[0071]
标记手段可以是荧光标记剂，其与抗体或靶标化学结合以形成荧光染料(染料)，该荧光染料是有用的免疫荧光示踪剂。合适的荧光标记剂是荧光染料如异氰酸荧光素(fic)、异硫氰酸荧光素(fitc)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯(dansc)、异硫氰酸钾四甲基罗丹明(tritc)、丽丝胺、罗丹明8200磺酰氯(rb 200sc)等。
[0072]
在优选实施方案中，指示基团是酶，例如辣根过氧化物酶(hrp)、葡萄糖氧化酶等。在这种主要指示基团是酶如hrp或葡萄糖氧化酶的情况下，需要额外的试剂来指示受体-配体复合物(免疫反应物)已经形成。这种用于hrp的额外试剂包括过氧化氢和氧化染料前体，例如二氨基联苯胺。另一种用于葡萄糖氧化酶的试剂是2,2,-叠氮基二-(3-乙基-苯并噻唑啉-g-磺酸)(abts)。
[0073]
放射性元素也是可用的标记试剂，并且在本文中被示例性地使用。示例性的放射性标记剂是产生伽马射线发射的放射性元素。本身发射伽马射线的元素，例如
124
i、
125
i、
128
i、
132
i和
51
cr代表一类产生伽马射线发射的放射性元素指示群。另一组有用的标记手段是那些本身发射正电子的元素，如
11
c、
18
f、
15
o和
13
n。β发射体也是有用的，例如
111
in或3h。
[0074]
标记物的连接，即肽和蛋白质的标记，在本领域是众所周知的。例如，杂交瘤产生的单克隆抗体可以通过代谢掺入作为培养基中成分提供的含有放射性同位素的氨基酸来标记。蛋白质结合或通过活化的官能团偶联的技术是特别适用的。
[0075]
本文提供了一种细胞，其包含编码与标签融合的靶标的重组核酸。本文提供了一种细胞，其包括与标签融合的靶标。
[0076]
在一个实施方案中，所述方法可用于鉴定与配体(例如生物活性化合物)结合的内源性蛋白质靶标。所述方法可以用于靶标鉴定和/或验证。
[0077]
本文公开了一种鉴定能够与靶标结合的候选配体的方法，所述方法包括：a)使样品与候选配体接触；b)使所述样品与渗透细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；c)裂解样品；和d)检测或测定所述未聚集的靶标或聚集的靶标的水平，其中与参考相比，未聚集的靶标或聚集的靶标的水平的差异指示所述候选配体能够结合所述靶标。
[0078]
所述方法可用于药物筛选。例如，可以用药物文库以高通量方式筛选细胞，以鉴定能够与靶标结合的候选配体。
[0079]
本文公开了一种预测药物在受试者中的疗效的方法，所述方法包括a)从已经用该药物治疗的受试者获得样品；b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；c)裂解样品；d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示药物与靶标的结合，从而预测药物在受试者中的疗效。
[0080]
所述方法可用于确定药物是否到达从患者获得的细胞或组织样品中的靶标。
[0081]
受试者可以是健康的受试者或患有某种病症或疾病的受试者。
[0082]
在一个实施方案中，样品是患者来源的细胞(例如患者来源的癌症细胞)或小鼠异种移植物。
[0083]
在一个实施方案中，所述病症或疾病是肿瘤或癌症。这种病症或疾病也可能是感染性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或免疫缺陷。
[0084]
本文中使用的术语“肿瘤”是指任何肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌前和癌细胞和组织。术语“癌症”和“癌变”是指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征是部分细胞生长不受调控。如本文所用，术语“癌症”是指非转移性和转移性癌症，包括早期癌症和晚期癌症。术语“癌前病变”是指通常先于或发展为癌症的病症或生长。所谓“非转移性”是指良性的或位于原发部位且未渗入淋巴或血管系统或原发部位以外的组织的癌症。一般来说，非转移性癌症是指0、i或ii期癌症的任何癌症，偶尔也包括iii期癌症。所谓“早期癌症”是指无侵袭性或转移性的癌症，或被归类为0期、i期或ii期癌症。术语“晚期癌症”通常指iii期或iv期癌症，但也可以指ii期癌症或ii期癌症的亚期。本领域技术人员将理解，ii期癌症被分类为早期癌症或晚期癌症取决于特定癌症类型。癌症的说明性示例包括但不限于血液癌症(例如白血病或淋巴瘤)、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、上皮癌、黑色
素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、直肠癌和食管癌。
[0085]“感染性疾病”是指由微生物因子(agent)(如普通感冒)引起的可在人与人之间或在生物体与生物体之间传播的疾病。感染性疾病是本领域已知的，并且包括例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体、淋病)、肺结核、hiv/aids、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、流感或冠状病毒感染性疾病(如sars-cov-2)。
[0086]“自身免疫性疾病”是指身体对自身组织的某些成分产生免疫原性(即免疫系统)反应的疾病。换句话说，免疫系统失去了将体内某些组织或系统识别为“自我”的能力，并将其作为攻击靶标，就好像它是外来的一样。自身免疫性疾病可分为主要由一个器官受到影响的疾病(如溶血性贫血和抗免疫性甲状腺炎)，以及自身免疫疾病过程通过许多组织扩散的疾病(例如系统性红斑狼疮)。例如，多发性硬化症被认为是由t细胞攻击大脑和脊髓神经纤维周围的鞘引起的。这会导致协调能力丧失、虚弱和视力模糊。自身免疫性疾病是本领域已知的，并且包括例如桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、狼疮、多发性硬化症、风湿性关节炎、溶血性贫血、抗免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、克罗恩病、结肠炎、糖尿病、硬皮病、银屑病等。
[0087]
如本文所用，术语“炎症性疾病”是指急性或慢性炎症病症，其可由感染或非感染原因引起。各种感染原因包括脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肺结核、皮炎和成人呼吸窘迫综合征。非感染性原因包括创伤(烧伤、割伤、挫伤、挤压伤)、自身免疫性疾病和器官排斥反应。
[0088]“免疫缺陷”是指患者的免疫系统因疾病或施用化学物质而受损的状态。这种病症使系统缺乏抵御外来物质所需的血细胞数量和类型。免疫缺陷病症或疾病是本领域已知的，并且包括例如艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)、scid(严重联合免疫缺陷疾病)、选择性iga缺乏症、常见可变免疫缺陷、x-连锁无丙种球蛋白血症、慢性肉芽肿性疾病、高igm综合征和糖尿病。
[0089]
如本文所定义的方法可以进一步包括治疗受试者。
[0090]
本文中使用的术语“治疗”可指(1)预防或延缓一种或多种病症的发生；(2)抑制紊乱或一种或多种紊乱指征的发展；(3)缓解紊乱，即导致紊乱或至少一种或更多紊乱指征的消退；和/或(4)导致紊乱的一种或多种指征的严重程度降低。
[0091]
本文定义的方法也可用于预测受试者对药物治疗作出反应的可能性。所述方法可以包括：a)从已经用该药物治疗的受试者获得样品；b)使样品与细胞渗透性变性剂接触；c)裂解样品；以及d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异预测受试者对药物作出反应的可能性。
[0092]
本文公开了一种鉴定受试者中与药物结合的靶标的方法，所述方法包括：a)从已经用该药物治疗的受试者获得样品；b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；c)裂解样品；以及d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示药物与靶标的结合。
[0093]
所述方法可用于确定药物是否与从患者获得的细胞或组织样品中的靶标结合。所述方法可用于确定药物是否与完整细胞或活细胞中的靶标结合。
[0094]
在一个实施方案中，提供了一种鉴定与受试者中的药物或配体结合的靶标的方
法，所述方法包括：a)从已经用该药物治疗的受试者获得样品；b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触；c)裂解样品；和d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或者聚集性靶标水平的差异指示药物与靶标的结合。
[0095]
在一个实施方案中，提供了一种鉴定与受试者中的药物或配体结合的靶标的方法，所述方法包括：a)从已经用该药物治疗的受试者获得样品；b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触；c)裂解样品；和d)使用质谱法检测或测定与药物或配体结合的靶标。
[0096]
所述方法可用于确定药物是否与完整细胞或活细胞中的靶标结合。靶标可以是细胞内靶标或细胞外靶标。细胞渗透性变性剂可促进存在于活细胞或完整细胞上的细胞内或细胞外靶标的去折叠。
[0097]
微流体芯片可以用于执行本文所定义的方法。微流体芯片可以包括一个或多个微流体通道(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多微流体通道)。在本文所述的方法中使用微流体显著减少了检测所需的样品量。
[0098]
本文公开了一种用于实施本文定义的任何方法的试剂盒。所述试剂盒可以进一步包括缓冲液、说明书等。试剂盒可以提供如本文所定义的用于执行本文所公开的方法的微流体芯片。
[0099]
如本文所用，“和/或”是指并包括一个或多个相关列出项目的任何和所有可能的组合，以及在可选(或)项中解释为缺少组合。
[0100]
本技术中使用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种制剂”包括多种制剂，包括它们的混合物。
[0101]
在本说明书和随后的陈述中，除非上下文另有要求，否则“包含(comprise)”一词以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变体将被理解为包括所述整数或步骤或整数的组或步骤的组，而不排除任何其他整数或步骤或整数的组或步骤的组。
[0102]
本领域技术人员将理解，本文所描述的本发明易受到除具体描述之外的变化和修改的影响。应当理解，本发明包括落入精神和范围内的所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或多个的任何组合和所有组合。
[0103]
实施例
[0104]
方法
[0105]
ucep-id和ucep-engage的共同步骤
[0106]
通用ucep工作流程
[0107]
源自体液、血液、组织、类器官和培养细胞等材料的活细胞/完整细胞在技术上与本文所述的方法兼容。然而，细胞的培养和收集可能需要进行相应的调整，以最大限度地减少生物反应、蛋白质去折叠和蛋白质聚集。用生物活性化合物或载体处理特定时间后，将细胞沉淀、洗涤、重悬于含有尿素或其他细胞渗透性化学变性剂的d-pbs或等渗缓冲液中。在摩尔浓度反应(mr)实验中，将细胞与单一浓度的药物或生物活性化合物孵育特定时间，该特定时间通常不少于5分钟，但用不同浓度的尿素进行测试。在当前的实施方案中，使用了0m至8m的尿素。在剂量反应(dr)实验中，在用单一浓度的化学变性剂测试之前，用不同浓度的药物或生物活性化合物孵育细胞，通常不少于5分钟。较短的药物治疗时间通常检测到较少的命中，但富含药物的主要靶标，而较长的治疗时间允许生物代谢化合物的积累，并可能
触发细胞中的下游事件。
[0108]
人类细胞通常与生物活性化合物和尿素在37℃下孵育，以更好地捕捉体内蛋白质的生理状态。在用尿素短时间孵育后，然后加入体积为细胞混合物溶液几倍的裂解缓冲液。化学变性剂的2倍至4倍的稀释系数已经过测试，并且使用所述方法效果良好。可以通过重复至少2次的快速冻融过程来促进细胞裂解。如果需要，可以通过用注射器反复穿过针头对溶解的细胞进行额外的机械剪切。
[0109]
聚集的蛋白质或不溶性细胞碎片可以使用多种方法去除，如微滤、离心和亲和树脂或微珠。在一些实施方式中，离心用于将不溶性悬浮颗粒与细胞碎片一起沉淀到小瓶底部，上清液用于下游分析。在另一个实施方案中，亲和树脂或微珠用于去除蛋白质聚集体和可溶性未折叠蛋白质。微珠已被用于捕获蛋白质聚集体，以促进蛋白质组学样品处理，其中蛋白质经受苛刻的条件以最大限度地提高蛋白质聚集和蛋白质提取。亲和树脂、微珠和类似材料用于将天然蛋白质与变性蛋白质分离，特别是通过过滤和离心不能很好地去除的小蛋白质聚集体和可溶性未折叠蛋白质。然而，微珠和类似材料的使用也有利于蛋白质组学样品的制备并实现自动化。
[0110]
在一项使用磁性微珠的方案开发实验中，结果表明，磁性微珠在从可溶性蛋白质组分中分离蛋白质聚集体方面非常有效(图9)。使用磁性微珠的聚集体分离方案首先将冻融裂解的细胞与1mg pbs预洗涤的磁性微珠混合。随后将其在室温下在旋转器上孵育10分钟。孵育后，将珠-细胞混合物放置在强磁性支架中1分钟，以从样品中分离磁珠。可以收集澄清的上清液并快速冷冻以进行下游分析。
[0111]
ucep-id的具体步骤
[0112]
定量lc-ms/ms分析
[0113]
将tcep加入从ucep通用工作流程获得的上清液中，然后加入氯乙酰胺。接下来，加入“结合”缓冲液(90％甲醇，10％teab缓冲液)，然后在样品加载到“s阱”柱(prolific)上之前加入磷酸。“s阱”柱离心后，将“洗涤”缓冲液加载到柱中，以去除盐、洗涤剂和其他小杂质。然后将含有胰蛋白酶/lyc(promega)混合物的消化缓冲液加载到柱上。消化后用洗脱缓冲液将消化的肽从柱中洗脱出来。用快速真空浓缩器干燥洗脱的肽，在teab缓冲液中再溶解，并用同量异序标签tmt试剂(thermofisher)标记。
[0114]
在用缓冲液a(l0mm甲酸铵)和缓冲液b(90％acn，10％甲酸铵)以阶梯梯度洗脱模式通过高ph反相色谱进行分级前，标记的肽在含有5％氨和2％乙腈溶液的溶液中脱盐和再溶解。使用快速真空浓缩器对所有级分进行干燥。干燥的分级肽在装入质谱仪进行分析之前用甲酸酸化。使用mascot和sequest等搜索引擎对获得的ms光谱与肽进行匹配，搜索参数包括用氨基甲酰甲基和tmt标记的肽的固定修饰，以及n-末端乙酰化、甲硫氨酸氧化和脱酰胺的动态修饰。与未处理的样品相比，通过化学物质结合的蛋白质具有不同的热力学稳定性，并且在处理的样品中表现出不同的强度/丰度，并且相应地分析所产生的数据以鉴定与目标化学物质相结合的蛋白质。在dr实验中，根据测定的谱带强度绘制了s(sigmodal)形的剂量-反应曲线。计算ec50并将其定义为达到剂量-反应曲线中最大强度的一半所需的剂量。此处得到的ec50可能与其在体内的实际药物结合亲和力强烈相关。
[0115]
ucep-engage的具体步骤
[0116]
蛋白质印迹/斑点印迹/elisa
[0117]
在凝胶电泳分析之前，上清液中的蛋白质在含有sds和tcep的样品缓冲液中变性并还原。使用半干转移系统将凝胶中的蛋白质转移到硝化纤维素膜上。转移后，用5％的牛奶封闭膜。随后用一抗探测膜，然后加入hrp连接的二抗来探测一抗。
[0118]
如果市场上有至少两种识别同一蛋白质靶标的不同表位的抗体，那么基于夹心elisa的ucep也可以开发出来以便于操作。包被在elisa板上的一抗具有捕获可溶性靶蛋白的功能。elisa板用pbs-t洗涤3次以除去其它未捕获的蛋白质。加入另一种酶偶联的一抗，以探测捕获的蛋白质，并在加入底物后产生化学发光信号。基于elisa的ucep可以进一步开发用于使用磁珠的自动化。与未处理的样品相比，通过化学物质结合的蛋白质在处理的样品中表现出不同的强度/丰度，然后相应地分析产生的数据。在dr实验中，根据测得的谱带强度绘制了一条s形的剂量-反应曲线。计算ec50并将其定义为达到剂量-反应曲线中最大强度的一半所需的剂量。此处得到的ec50可能与其在体内的实际药物结合亲和力强烈相关。
[0119]
ucep筛选
[0120]
ucep可用于高通量筛选结合目标特异性蛋白质靶标的小分子。ucep筛选包括报告细胞的产生、ucep分析优化和筛选等步骤(图3)。
[0121]
报告细胞的产生
[0122]
在筛选中，由于更生理相关的环境，基于细胞的测定优于基于重组蛋白的测定。工程化报告细胞提供快速而直接的筛选。可以使用不同的方法来产生报告细胞。在一个实施方案中，使用flp-in t-rex系统和crispr。
[0123]
在flp-in t-rex系统中，使用修饰的pentrla质粒(进入载体)来克隆目标蛋白。pentrla质粒被修饰为包括33个hibit核苷酸序列，用于在n或c末端加上目标蛋白的标签。将hibit标签目标蛋白通过网关(gateway)lr反应转移到网关目的载体pfrt/to/dest或pef5/frt/v5-dest之一。用最终目的载体转染flp-in t-rex hek293细胞，所述最终目的载体包括hibit标签目标基因和表达flp重组酶的pog44载体。用潮霉素和灭瘟素(blasticidin)选择细胞以去除未转化的细胞。在crispr系统中，在体外形成包括cas9、crrna、tracrrna在内的核糖核蛋白复合物。细胞被电穿孔以递送cas9核糖核蛋白复合物以及单链供体寡核苷酸。第二天，将细胞作为单个细胞分选到透明的96孔组织培养微孔板中，并孵育直到它们融合。
[0124]
ucep筛选方法的开发
[0125]
在进行任何hts之前，应针对每个靶标优化ucep条件，如变性剂浓度和稀释因子。在这里，flp-in t-rex细胞被用于测定开发。将细胞接种到生长培养基中的96孔透明底部白色微板中，并用四环素诱导hibit标签蛋白的表达。细胞在含有不同浓度尿素的pbs中孵育之前，用目标化学物质处理特定的持续时间。然后用pbs稀释尿素。随后加入含有lgbit和底物的hibit裂解检测缓冲液。之后测定生物发光。与未处理的样品相比，通过化学物质结合的蛋白质在处理的样品中表现出不同的强度/丰度，然后相应地分析产生的数据。
[0126]
初步结果：
[0127]
ucep-engage
[0128]
mr实验
[0129]
用ucep-engage对甲氨蝶呤(mtx)已知的靶标二氢叶酸还原酶(dhfr)和胸苷酸合
成酶(ts)进行了验证和评价。蛋白质印迹数据显示，这两种蛋白质都被mtx显著稳定，而它们的上样对照保持不变(图4a和4b)。然而，为了检测ts的稳定性，需要90分钟的更长的mtx孵育时间。ucep-engage测定还验证了帕比司他(pan)与hdac2的结合(图4c)。激酶抑制剂达沙替尼被开发用于通过靶向其abl结构域来抑制bcr-abl致癌融合蛋白。这种融合蛋白存在于髓性白血病细胞系k562中。从ucep-id结果(图6d)中，检测到abl，但由于其融合区的可变性，bcr-abl的独特肽很难被ms检测到。因此，当通过sds-page分离时，基于其比正常对应物bcr或abl更大的尺寸，ucep-engage可用于检测bcr-abl。结果(图4d)显示，在尿素浓度从3m到6m时，达沙替尼处理增加了可溶性靶蛋白abl以及bcr-abl(约250kda)的丰度。这表明ucep可以捕获天然蛋白质的药物靶向结合，但也可以捕获嵌合蛋白质。总之，结果表明，ucep能够使用蛋白质印迹等检测方法验证药物与其同源靶标的细胞内结合。
[0130]
剂量反应(dr)实验
[0131]
在4m尿素条件下进行ucep剂量反应实验，以确定mtx对dhfr的ec50。根据剂量反应图(图5a)确定mtx计算的ec50为40nm。此外，在5m尿素条件下，测定了另一种抑制剂帕比司他对hdac2的ec50。其免疫印迹的半定量显示ec50约为42nm(图5b)。dhfr和hdac2的mtx和pan的计算ec50与来自不同测定方法的其他已发表的ec50良好相关。
[0132]
ucep-id
[0133]
已经在k562和hepg2细胞中对甲氨蝶呤(mtx)、达沙替尼和帕比司他(pan)处理进行了一些ucep-id mr实验。在实验中，mtx和达沙替尼的最大剂量为10μm，而pan为5μm。将化合物与培养的细胞孵育10分钟，pan除外，pan为90分钟。在所有实验中测定的蛋白质的数量等于或大于6000，其中至少有3000种蛋白质被评分用于分析。
[0134]
ucep-id测定确定dhfr是mtx的结合靶标(图6a)，组蛋白脱乙酰酶1(hdac1)是pan的顶级靶标(图6a)。此外，ucep-id鉴定了许多其他蛋白质作为pan的潜在结合靶标(脱靶)(图6b)，2d-tpp也检测到了这些蛋白质。这一结果表明，ucep能够检测主要结合靶标和脱靶。然而，在2d-tpp研究中鉴定了两个膜蛋白靶标，fads1和fads2，但未通过ucep-id鉴定。为了提高疏水膜蛋白的溶解度，在细胞裂解过程中向稀释缓冲液中加入np-40(最终浓度为0.4％)，重复实验。该重复实验的结果表明，fads-1和fads2的蛋白质覆盖度增加，并且显著检测到它们的稳定性(图6c)。
[0135]
为了评估ucep-id对激酶抑制剂靶向去卷积的可靠性，还在k562活细胞中对达沙替尼进行了ucep-id。达沙替尼通过抑制致癌融合蛋白bcr-abe用于治疗粒细胞性白血病。cetsa/tpp对达沙替尼的靶向去卷积未能检测到其直接靶标abe和btk激酶的稳定性。有趣的是，ucep-id成功地将abl激酶和btk激酶鉴定为达沙替尼的靶标，具有高度显著的p值。除此之外，该测定还检测到其他靶标，如先前通过tpp方法鉴定的yes1和mapk14激酶(图6d)。几项研究表明，一些激酶在暴露于超过37℃的温度时会发生构象变化，这可能会改变其抑制剂的结合位点，导致其结合亲和力降低。因此，ucep可能对温度敏感的激酶有用，并且通常在生理温度下进行。
[0136]
ucep-screen
[0137]
用hibit标签二氢叶酸还原酶(dhfr)证明了ucep筛选技术，以评估已知dhfr抑制剂和非dhfr抑制剂的ucep测定的选择性(图7a)。测试的dhfr抑制剂为甲氨蝶呤和氨基蝶呤(图7b)，而使用的非dhfr抑制剂是星形孢菌素、恩杂鲁胺和帕比司他(图7c)。甲氨蝶呤和氨
基蝶呤在ucep后显著增加了dhfr-hibit蛋白的稳定性，而非dhfr抑制剂没有显著改变dhfr-hibit的蛋白稳定性(图7a)。这些发现证实了小分子对其真正蛋白质靶标的选择性亲和力可以通过ucep来评估。
[0138]
在测定开发过程中，还对不同的化学变性剂进行了评估。hek293dhfr hibit细胞用20μm甲氨蝶呤处理10分钟，然后用不同的化学变性剂如尿素、正甲基脲、盐酸胍或硫氰酸胍以3m浓度孵育，并用pbs稀释两倍。而尿素及其衍生物正甲基脲的测定效果良好；其他变性剂，如盐酸胍和硫氰酸胍，未能通过测定(图8)。这可以用它们的化学性质来解释。这一结果验证了在ucep技术中使用尿素及其衍生物作为化学变性剂的有用性和非显而易见性。
[0139]
在hdacl-hibit和dhfr-hibit报告细胞系统中评估了尿素浓度对ucep中结合亲和力的影响(图10)。他们用一系列剂量的帕比司他治疗5分钟，氨基蝶呤治疗10分钟。hdacl-hibit和dhfr-hibit通过其各自的抑制剂在四种不同的有效尿素浓度下的稳定性是明显的。重要的是，两种药物的结果都表明，用ucep定量的药物结合亲和力与尿素浓度无关。例如，帕比司他对4m、5m、6m和7m的计算ec50分别约为28nm、56nm、45nm和13nm(图10a)，这些都在可接受的实验变化范围内。对氨基蝶呤进行了类似的观察，2m、3m、4m和5m尿素的ec50分别约为2μm、6μm、5μm和3μm(图10b)。这一特性有助于ucep以更简单的实验设置和更高的ec50精度在选定的尿素浓度下筛选一组药物。
[0140]
除了在ucep-id实验中使用的np40外，其他非离子洗涤剂如chaps也被用于研究报告细胞系统中her2-hibit的图卡替尼结合。在本研究中，图卡替尼在3m尿素下表现出her2的最大稳定性(图11)。表面活性剂在测定缓冲液或提取缓冲液中的存在对于通过保持膜蛋白的天然形式可溶来提高ucep对膜蛋白的敏感性是重要的。然而，需要优化所用表面活性剂的量和类型，以最大限度地减少聚集蛋白的溶解并最大限度地提高天然膜蛋白的溶解度。
[0141]
结果
[0142]
本文描述了一种新的分析方法，用于鉴定和监测化学物质与细胞裂解物和活细胞中蛋白质的物理相互作用，并包括对不同应用的不同下游检测策略的适应。这为解决制药和生物技术行业面临的许多问题提供了新的解决方案。
[0143]
本文还描述了一系列和组合的步骤，这些步骤允许使用细胞渗透性化学变性剂来鉴定和监测细胞裂解物和细胞中的化学蛋白质相互作用。虽然氯化胍(gdmcl)等变性剂已被用于研究蛋白质的去折叠和蛋白质的化学相互作用，但其应用仅限于重组蛋白质和细胞裂解物。研究表明，细胞渗透性化学变性剂可用于鉴定和监测不同应用的细胞内化学蛋白质相互作用。还证明了原则上可以使用尿素和其他具有类似性质的化学品，包括硫脲和甲基脲等尿素衍生物。此外，已经表明，单纯使用化学变性剂不能达到本发明所要求的效用。
[0144]
使用尿素和蛋白酶的脉冲蛋白水解已被应用于监测和鉴定化学结合蛋白，但所述方法不适用于鉴定或监测细胞中的化学蛋白相互作用，因为蛋白酶不能渗透细胞。重要的是，部分消化的蛋白质将影响通常用于鉴定新结合蛋白的下游质谱分析的覆盖率和灵敏度。研究表明，尿素可以在没有蛋白酶的情况下用于鉴定化学结合蛋白，这提高了下游质谱分析的覆盖率和灵敏度。
[0145]
最近的靶向去卷积方法，如cetsa，已经证明细胞裂解物中的药物结合蛋白在加热时更稳定，形成更少的难溶性聚集体。通过定量可溶性和不溶性蛋白质的丰度，可以确定药
物结合蛋白。与基于热的测定如cetsa相比，本发明与温度无关，这将本发明的应用扩展到不耐热和耐热蛋白质。来自现有基于热量的方法的数据与药物结合亲和力没有很好的相关性，因为热量或升高的温度通常会影响化学蛋白质相互作用的缔合/解离速率，并降低对弱化学蛋白质相互作用力的敏感性。本发明巧妙地使用细胞渗透性化学变性剂如尿素来使蛋白质去折叠，以在生理温度下鉴定细胞中的药物/化学结合蛋白质。与现有的基于热的方法不同，化学变性剂诱导的蛋白质去折叠是可逆的，这可以用来提取更多的结合信息，用于鉴定弱的化学蛋白质相互作用，并区分细胞中的间接生物学结果。本发明涉及一系列步骤，这些步骤可以在生理温度下进行以最大限度地提高所获得的结合信息的生理相关性，但也可以与升高但不变性的温度相结合以增强检测信号。
[0146]
cpp方法类似于使用化学变性剂的本发明的实施方案，其中蛋白质聚集被用作鉴定化学结合蛋白质的读数。然而，与本发明不同的是，cpp使用氯化胍，并且只能在细胞裂解物样品上使用，这由于细胞裂解物中的蛋白质采用的非天然结构构象而增加了假阳性和假阴性率。本发明可以直接应用于完整的细胞。它涉及用细胞渗透性变性剂处理完整细胞，并将细胞裂解和化学变性剂稀释结合在一个步骤中，以诱导未折叠蛋白质的聚集。此外，特别表明，氯化胍或其他化学变性剂的简单使用不能实现本发明所要求的用途。
[0147]
在其中一种实施方式中，将细胞在类似浓度的化学变性剂中孵育和裂解(即，不突然稀释化学变性剂)，以最大限度地减少蛋白质聚集。取而代之的是微珠、亲和树脂或类似材料，以诱导蛋白质的聚集并将聚集的蛋白质与未变性的蛋白质分离。微珠的使用提高了处理量并促进了自动化，因为它避开了当前方法(如cetsa和cpp)中用于去除聚集蛋白的高速离心步骤。重要的是，微珠的使用去除了不能聚集或基本上不能聚集以通过离心去除的未折叠蛋白质，结果增加了所述方法的覆盖度和灵敏度。在本发明中，细胞渗透性化学变性剂用于首先在细胞中使蛋白质去折叠，并在裂解后保持蛋白质未去折叠，使得未去折叠的蛋白质可被微珠和类似材料结合。蛋白酶也可以用于去除由化学变性剂维持的未折叠蛋白质。所述方法的另一个实施方式涉及在细胞裂解过程中将化学变性剂的稀释和微珠的使用结合，以最大限度地提高灵敏度和覆盖度。
[0148]
现有的基于cetsa和类似技术的靶向去卷积技术利用了蛋白质质谱(ms)，用于未知药物靶标的全蛋白质组鉴定。这些技术的原理要求使用预先定义的“天然”缓冲液(含或不含温和洗涤剂(低于1％))裂解细胞。“天然”缓冲液通常用于提取天然形式的可溶性蛋白质。然而，这可能会限制许多蛋白质的可提取性，这些蛋白质是一些大蛋白复合物的一部分或具有更高的疏水性。在典型的基于ms的蛋白质组学分析中，高浓度的尿素用于增加蛋白质的提取，用于蛋白质组学的分析。在本发明中，尿素同时用于鉴定药物结合的蛋白质以及用于使细胞蛋白质从活细胞中的溶解度或可提取性最大化。因此，所述方法的蛋白质组覆盖率高于使用“天然”缓冲液提取蛋白质的现有方法。
[0149]
用于测定样品中可溶性级分的常见蛋白质组策略是使用液相色谱-质谱法。所述方法利用等量标签来测定多个样品的蛋白质组丰度，与无标记的方法相比，变异性最小。然而，有限数量的标签通道一直限制着数据分析中数据点的数量。为了解决这个问题，采用并修改了一锅分析策略，将来自两个相邻条件的2个样本组合为1个样本，以包括来自不同条件的更多信号信息。如果在蛋白质组范围内进行剂量反应分析是可取的，则可以采用一锅分析策略/压缩格式的方法来节省ms的运行时间。
[0150]
本发明可用于靶向蛋白-药物结合分析，以验证细胞内药物占有或药物-靶标结合。在靶向药物结合分析的一种实施方式中，抗体用于检测可溶性蛋白，但也可以使用其他免疫测定，如蛋白质印迹和elisa。如果市场上没有抗体，可以利用crispr-cas技术或其他克隆方法(如门克隆)对哺乳动物细胞进行改造，将小肽标签(例如hibit、flag、c-myc)插入靶向宿主蛋白的n/c末端。这些标记的宿主蛋白可以直接激活酶，也可以通过抗标记酶偶联的二抗检测产生化学发光信号。
[0151]
总之，名为ucep的发明涉及一系列和组合的步骤，这些步骤允许细胞渗透性化学变性剂用于鉴定和监测化学物质与细胞裂解物和活细胞中蛋白质的物理相互作用。它包括针对不同应用的不同下游检测策略的适应(图1)。具体而言，通过将本发明与蛋白质质谱法(称为ucep-id)相结合，本发明可用于全蛋白质组分析，从而鉴定与目标化学物质结合的未知靶标(图2)。ucep-id可用于靶向去卷积和阐明生物活性化合物在细胞中的作用机制。ucep也被用于靶向免疫测定，称为ucep-engage(图2)，用于验证化合物与细胞内蛋白质的真正结合。ucep还适用于与特定细胞内蛋白靶标结合的分子的高通量筛选(hts)，这有助于最大限度地提高所获得的结合数据的生理相关性。这种适应包括报告细胞的产生、基于细胞靶标的hts的微板形式的ucep测定的移植和优化，称为ucep-screen(图3)。

技术特征：
1.一种检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法，所述方法包括：a)使样品与细胞渗透性变性剂接触以促进样品中靶标的细胞内去折叠，b)裂解样品；和c)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标水平的差异指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括一种或多种细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是细胞或组织样品。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞渗透性变性剂是尿素或其衍生物(例如硫脲或甲基脲)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述靶标是蛋白质。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤b)包括快速裂解和/或稀释所述样品以促进所述靶标的聚集。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤c)之前去除聚集的和/或未折叠的靶标。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括检测或测定在不同浓度的变性剂下配体与靶标的结合。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法在动物的生理温度下进行。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述靶标与标签偶联。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述靶标通过质谱法或识别分子检测。12.一种用于实施权利要求1至11中任一项所述方法的试剂盒。13.一种鉴定能够与靶标结合的候选配体的方法，所述方法包括：a)使样品与所述候选配体接触；b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；c)裂解样品；和d)检测或测定所述非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，所述非聚集性靶标或聚集性靶标水平的差异指示所述候选配体能够结合所述靶标。14.一种预测药物在受试者中的疗效的方法，所述方法包括a)从已经用所述药物治疗的受试者获得样品；b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进靶标的细胞内去折叠；c)裂解样品；d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标水平的差异指示药物与靶标的结合，从而预测药物在受试者中的疗效。15.一种鉴定与受试者中的药物结合的靶标的方法，所述方法包括：a)从已经用所述药物治疗的受试者获得样品；b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；c)裂解样品；和d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，所述非聚集性靶标或聚集性靶标水平的差异指示所述药物与所述靶标的结合。

技术总结
本发明总体上涉及生物化学领域。特别地，本发明涉及检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法，所述方法包括使包含一种或多种细胞的样品与细胞渗透性变性剂接触，以促进样品中靶标的细胞内去折叠，然后裂解样品。然后检测或测定裂解样品的非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或者聚集性靶标水平的差异表明样品中结合配体的靶标的存在或水平。在具体实施方案中，细胞渗透性变性剂是尿素或其衍生物。其中还提供了鉴定候选配体或预测药物在受试者中的疗效的方法。候选配体或预测药物在受试者中的疗效的方法。候选配体或预测药物在受试者中的疗效的方法。


技术研发人员：陈顺兴
受保护的技术使用者：新加坡科技研究局
技术研发日：2021.12.20
技术公布日：2023/9/20